Assay of neuronal function with the

Assay of neuronal function with the Fluo-4 Ca2+ fluorescence indicator
The neurons were grown on Matrigel-coated flat bottom 96-well plates to perform the
functional assay. The neurons were first washed with Neurobasal medium (low Ca2+
and Mg2+) and washed again with 1X PBS (without Ca2+ and Mg2+). Next, a 5 µM Fluo-4
Ca2+ AM ester (Life Technologies) solution containing 0.001% pluronic F-127 (Life
Technologies) was loaded into each well, except for the negative control and blank. The
treated cells were incubated for 1 h in the dark at 37°C and 5% CO2 . The Fluo-4 dye
solution was removed and the cells were washed twice with 1X PBS (without Ca2+ and
Mg2+). Then, 0.001, 0.01, 0.1 and 1.0 mM glutamate (glutamate receptor agonist) were
added to the cells to examine the increase in the Ca2+
-dependent electrical activity with
the Fluo-4 dye. Finally, the fluorescence was read on a fluorescent microplate reader
(POLARstar Omega, BMG LABTECH) with excitation at 485 nm and emission at 520
nm. The data were analyzed by the Omega software and normalized to the blank
values. The intraneuronal calcium concentrations [Ca2+]i were calculated using the
following previously described equation:[Ca2+]
i=Kd·(F-Fmin)/(Fmax-F) Briefly, Kd is the
dissociation constant for Ca2+ and F is the fluorescence (in arbitrary units) of the
unknown sample. The values for Fmax and Fmin were determined using previously
described calibration procedures 27,28
. Fmax and Fmin are the ratios at saturating Ca2+ and
zero Ca2+
, respectively. The maximum fluorescence intensity (Fmax) was obtained by
adding the Ca2+ ionophore ionomycin (Life Technologies, 10 μM). The concentration of
the indicators in the calibration solution was selected to provide a similar fluorescence
intensity to that of the dye-loaded neurons.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทดสอบฟังก์ชัน neuronal ด้วยบ่งชี้ fluorescence Fluo-4 Ca2 +Neurons ถูกปลูกใน Matrigel เคลือบก้นดี 96 แผ่นเพื่อทำการวิเคราะห์งาน Neurons ถูกก่อนล้าง ด้วย Neurobasal กลาง (ต่ำ Ca2 +และ Mg2 +) และล้าง ด้วย PBS X 1 (ไม่มี Ca2 + และ Mg2 +) อีกด้วย ถัดไป 5 µM Fluo-4Ca2 + น.เอส (ชีวิตเทคโนโลยี) โซลูชันประกอบด้วย 0.001% pluronic F-127 (ชีวิตเทคโนโลยี) ถูกโหลดลงในแต่ละดี ยกเว้นสำหรับควบคุมค่าลบและว่างเปล่า ที่เซลล์บำบัดถูก incubated สำหรับ h 1 ในมืดที่ 37° C และ 5% CO2 สีย้อม Fluo-4โซลูชันที่ถูกเอาออก และเซลล์ถูกล้าง ด้วย 1 X PBS ครั้ง (ไม่ มี Ca2 + และMg2+) แล้ว 0.001, 0.01, 0.1 และ 1.0 mM glutamate (glutamate ตัวรับอะโกนิสต์) ได้เพิ่มเข้าไปในเซลล์เพื่อตรวจการเพิ่มขึ้นของ Ca2 +-กิจกรรมไฟฟ้าขึ้นอยู่กับสีย้อม Fluo-4 สุดท้าย fluorescence ที่ถูกอ่านบนเครื่องอ่าน microplate เรืองแสง(โอเมก้า POLARstar, BMG LABTECH) กับในการกระตุ้นที่ 485 nm และมลพิษที่ 520นิวตันเมตร ข้อมูลวิเคราะห์ โดยซอฟต์แวร์โอเมก้า และตามปกติจะว่างเปล่าค่า ความเข้มข้นแคลเซียม intraneuronal [Ca2 +] ถูกคำนวณโดยใช้การต่อก่อนหน้านี้อธิบายสมการ: [Ca2 +]ฉัน = Kd· (F-Fmin)/(Fmax-F) สั้น ๆ Kd เป็นค่าคง dissociation Ca2 + และ F คือ fluorescence (ในกำหนดหน่วยของการอย่างไม่รู้จัก ค่า Fmax และ Fmin ได้กำหนดใช้ก่อนหน้านี้อธิบายขั้นตอน 27,28. Fmax และ Fmin มีอัตราส่วนที่ saturating Ca2 + และศูนย์ Ca2 +ตามลำดับ ความเข้มสูงสุด fluorescence (Fmax) กล่าวโดยเพิ่ม Ca2 + ionophore ionomycin (ชีวิตเทคโนโลยี 10 μM) ความเข้มข้นของเลือกตัวบ่งชี้ในการแก้ปัญหาการปรับเทียบให้ fluorescence คล้ายความเข้มที่ neurons โหลดย้อม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทดสอบการทำงานของเส้นประสาทกับ Fluo-4 Ca2 +
ตัวบ่งชี้เรืองแสงเซลล์ประสาทที่ถูกปลูกในMatrigel เคลือบด้านล่างแบนแผ่น 96
หลุมที่จะดำเนินการทดสอบการทำงาน เซลล์ประสาทถูกล้างครั้งแรกกับสื่อ Neurobasal (ต่ำ Ca2 +
และ Mg2 +) และล้างอีกครั้งกับ 1X พีบีเอส (ไม่ Ca2 + และ Mg2 +) ถัดไป 5 ไมครอน Fluo-4
เอสเตอร์ Ca2 + AM (เทคโนโลยีชีวิต) วิธีการแก้ปัญหาที่มี 0.001% pluronic F-127
(ชีวิตเทคโนโลยี) ถูกโหลดเข้าไปในแต่ละดียกเว้นสำหรับการควบคุมเชิงลบและว่างเปล่า
เซลล์ได้รับการรักษาที่ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืดที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและ CO2 5% สีย้อม Fluo-4
วิธีการแก้ปัญหาที่ถูกถอดออกและเซลล์ถูกล้างครั้งที่สองกับ 1X พีบีเอส (ไม่ Ca2 + และ
Mg2 +) จากนั้น 0.001, 0.01, 0.1 และ 1.0 มิลลิกลูตาเมต (กลูตาเมตตัวเอก)
ถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์เพื่อตรวจสอบการเพิ่มขึ้นของCa2 +
กิจกรรมไฟฟ้า -dependent
กับสีย้อมFluo-4 ในที่สุดการเรืองแสงได้อ่านบนเครื่องอ่าน microplate เรืองแสง
(POLARstar โอเมก้า, BMG LABTECH) ที่มีการกระตุ้นที่ 485 นาโนเมตรและการปล่อยที่ 520
นาโนเมตร
วิเคราะห์ข้อมูลโดยซอฟแวร์และโอเมก้าปกติว่างค่า ความเข้มข้นแคลเซียม intraneuronal [Ca2 +]
ฉันจะถูกคำนวณโดยใช้ต่อไปนี้อธิบายไว้ก่อนหน้าสม[Ca2 +]
i = Kd · (F-Fmin) / (Fmax-F) สั้น ๆ , Kd
เป็นแยกออกจากกันอย่างต่อเนื่องสำหรับCa2 + และ F นั้นเรืองแสง ( ในหน่วยพล)
ของกลุ่มตัวอย่างที่ไม่รู้จัก ค่าสำหรับ Fmax และ Fmin
คํานวณโดยใช้ก่อนหน้านี้อธิบายขั้นตอนการสอบเทียบ
27,28 Fmax และ Fmin เป็นอัตราส่วนที่ saturating Ca2 +
และศูนย์Ca2 +
ตามลำดับ ความเข้มแสงสูงสุด (Fmax)
ที่ได้รับจากการเพิ่มCa2 + ionophore ionomycin (เทคโนโลยีชีวิต 10 ไมครอน) ความเข้มข้นของตัวชี้วัดในการแก้ปัญหาการสอบเทียบได้รับเลือกให้จัดให้มีการเรืองแสงคล้ายเข้มกับที่ของเซลล์ประสาทย้อมโหลด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทดสอบการทำงานของการ fluo-4 แคลเซียมกับการบ่งชี้
เซลล์ประสาทเติบโตใน matrigel เคลือบด้วยแผ่นแบนล่าง 96 ดำเนินการ
การทดสอบการทํางาน เซลล์ประสาทก่อนล้างด้วย neurobasal ขนาดกลาง (
แคลเซียมต่ำและ mg2 ) และล้างอีกทีด้วย 1X PBS ( และไม่มีแคลเซียม mg2 ) หน้า 5 µ M fluo-4
แคลเซียมเป็นเอสเทอร์ ( เทคโนโลยี ) สารละลายที่มี 0001 % ชนิด f-127 ( เทคโนโลยีกับชีวิต
) ถูกโหลดเข้าไปในแต่ละยกเว้นการควบคุมและลบที่ว่างเปล่า
ถือว่าเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืดที่อุณหภูมิ 37 องศา C และ CO2 ร้อยละ 5 แก้ปัญหาสี
fluo-4 ถูกเอาออก และเซลล์ก็ล้างสองครั้งกับ 1x PBS ( โดยไม่มีแคลเซียมและ
mg2 ) จากนั้น , 0.001 , 0.01 , 0.1 และ 1.0 มม. กลูตาเมต ( ผงชูรสรีเซพเตอร์อะโกนิสต์ )
เพิ่มเซลล์การตรวจสอบเพิ่มในแคลเซียม
-
ย้อมขึ้นอยู่กับไฟฟ้ากิจกรรมกับ fluo-4 . ในที่สุด การได้อ่านในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยเรืองแสงอ่าน
( polarstar โอเมก้า สบาย labtech ) กับความตื่นเต้นที่ 465 นาโนเมตรและมลพิษที่ 520
nm . วิเคราะห์ข้อมูล โดยโอเมก้าซอฟแวร์และปกติที่จะว่าง
ค่าที่ความเข้มข้นของแคลเซียม แคลเซียม intraneuronal [ ] ผมได้ทำการคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
[ ]
= KD ด้วยแคลเซียม ( f-fmin ) / ( fmax-f ) สั้น ๆ , KD เป็น
หวิวคงที่สำหรับแคลเซียมและ F เป็นเรืองแสง ( พลในหน่วย ) ของ
ตัวอย่างที่ไม่รู้จัก ค่าสำหรับ fmax fmin และถูกใช้อธิบายขั้นตอนการสอบเทียบ 27,28 ก่อนหน้านี้

และ fmax fmin มีอัตราส่วนที่แคลเซียมสูงแล้ว

, แคลเซียม 0 ตามลำดับ ความเข้มแสงสูงสุด ( fmax ) โดยนำ
เพิ่มแคลเซียมไอโอโนฟอร์ ionomycin ( เทคโนโลยี , ชีวิต 10 μ M ) ความเข้มข้นของ
ตัวชี้วัดในการเลือกโซลูชั่นเพื่อให้ความเข้มฟลูออเรสเซนต์
คล้ายกับที่ของสีย้อมโหลดเซลล์ประสาท