3.2.1. Ion Exchange ChromatographyI

3.2.1. Ion Exchange Chromatography

Ion exchange chromatography separates proteins based on their surface ionic charge using resin that are modified with either positively-charged or negatively-charged chemical groups [4, 7]. Most proteins have an overall negative or positive charge depending on their isoelectric point (pI) at a given pH, which makes them possible to interact with an opposite charged chromatographic matrix [7]. If the net charge of the protein is positive at a pH below pI value, the protein will bind to a cation exchanger; at a pH above the pI value the net charge of the protein is negative and the protein will bind to an anion exchanger [38].

Proteins that interact weakly with the resins, for example a weak positively charged protein passed over resin modified with a negatively charged group, are eluted out in a low-salt buffer. On the other hand, proteins that interact strongly required more salt to be eluted. Proteins with very similar charge characteristics can be separated into different fractions as they are eluted from the column by increasing the concentration of salt in elution buffer [7].

Ion exchange column is one of the technologies that utilized the principle of ion exchange chromatography [33]. It uses membrane-absorbent technology as a chromatographic matrix to separate proteins. The membrane absorbents in columns are stabilized cellulose-based with highly porous structure that provides proteins access to the charged surface easily. Interactions among molecules and active sites on the membrane happened in convective through-pores. Therefore, the adsorptive membranes have the potential to maintain high efficiencies when purifying large biomolecules with low diffusion [33].

3.2.2. Gel Filtration Chromatography

Gel filtration chromatography, also called size-exclusion or gel-permeation chromatography, separates proteins according to molecular sizes and shape and the molecules do not bind to the chromatography medium [39]. It is a process in which large molecules passes through the column faster than small molecules. Small molecules can enter all of the tiny holes of the matrix and access more of the column. Small-sized proteins will pass through those holes and take more time to run out of the column compared with large-sized proteins that cannot get into those holes but run out directly of the column through void space in the column [4, 7].

Gel filtration chromatography kit applies the principle of gel filtration chromatography [40]. The target sample is applied on top of the column which contained porous beads, an example of matrix in the column. The molecules get separated when the molecules pass through the column of porous beads. The separation of molecules can be divided into three main types: total exclusion, selective permeation, and total permeation limit. Total exclusion is the part that large molecules cannot enter the pores and elute fast. For selective permeation region, intermediate molecules may enter the pores and may have an average residence time in the particles depending on their size and shape. As for total permeation limit, small molecules have the longest residence time once they enter the pores on the column [40]. An advantage of gel filtration-based chromatography is that it is suited for biomolecules that may be sensitive to pH changes, concentration of metal ions, and harsh environmental conditions [39].

3.2.3. Affinity Chromatography

Affinity chromatography depends on a specific interaction between the protein and the solid phase to affect separation from contaminants. It consists of the same steps as ion exchange chromatography [38]. It enables the purification of a protein on the basis of its biological function or individual chemical structure [41]. Proteins that have a high affinity towards the specific chemical groups such as ligands will covalently attach and bind to the column matrix while other proteins pass through the column [38]. Electrostatic or hydrophobic interactions, van der Waals’ forces and hydrogen bonding are the biological interactions between ligands and the target proteins [41]. The bound proteins will be eluted out from the column by a solution containing high concentration of soluble form of the ligand [36].

A biospecific ligand that can attach to a chromatography matrix covalently is one of the requirements for successful affinity purification. The binding between the ligand and target protein molecules must be reversible to allow the proteins to be removed in an active form [41]. After washing away the contaminants, the coupled ligand must retain its specific binding affinity for the target proteins. Some examples of biological interactions that are usually used in affinity chromatography are listed in Table 1 (see [41]).

tab1
Table 1: Typical biological interactions used in affinity chromatography [42].
Chromatographic separation by differential affinity to ligands immobilized on a beaded porous resin is fundamental to protein research [42]. A complete kit that contains pack beaded affinity resin columns based on principle of affinity chromatography has been introduced to the market [42]. An affinity resin can be used in batch or microcentrifuge spin column format depending on the scale and type of experiment to be carried out. Furthermore, it can be packed into some sort of larger gravity-flow column as well [42].

3.2.4. Gel Electrophoresis

Gel electrophoresis is a method to separate protein according to their size and charge properties. The partially purified protein from the chromatography separations can be further purified with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), or native gel electrophoresis [4]. In PAGE, the proteins are driven by an applied current through a gelated matrix [43]. The movement of protein through this gel depends on the charge density (charge per unit of mass) of the molecules. The molecules with high density charge migrate rapidly. The size and shape of protein are another two important factors that influence PAGE fractionation [43]. The acrylamide pore size plays a role as a molecular sieve to separate different sizes of proteins [4]. The larger the protein, the slower it migrates as it becomes more entangled in the gel [43]. Shape is also one of the factors because compact globular proteins move faster than elongated fibrous proteins of comparable molecular mass [43].

PAGE is usually carried out in the presence of the sodium dodecyl sulfate (SDS) [44]. A protein treated with SDS will usually eliminate the secondary, tertiary and quarternary structure of protein [4, 7]. Proteins unfold into a similar rod-like shape because of the electrostatic repulsion between the bound SDS molecules. The number of SDS molecules which bind to a protein is approximately proportional to the protein’s molecular mass (about 1.4 g SDS/g protein) [43]. Each protein species has an equivalent charge density and is driven through the gel with the same force [43]. In addition, PAGE can minimize the denaturation of proteins. Many proteins still retain their biological activities after running PAGE [7]. However, larger proteins are held up to a greater degree than smaller proteins because the polyacrylamide is highly cross-linked [43]. Consequently, proteins become separated by SDS-PAGE on the basis of their molecular mass. SDS-PAGE can be used to determine the molecular mass of the mixture of proteins by comparing the positions of the bands to those produced by proteins of known size [43]. SDS used in electrophoresis resolve mixture of proteins according to the length of individual polypeptide chains [7].

A technique called two-dimensional gel electrophoresis was developed by Patrick O’Farrell in 1975. It is used to fractionate complex mixtures of proteins by using two different techniques—isoelectric focusing and SDS-PAGE [43]. First, proteins are separated according to their isoelectric point in a tubular gel. After this separation, the gel is removed and placed on top of a slab of SDS-saturated polyacrylamide. The proteins move into the slab gel and separated according to their molecular mass [43]. Two-dimensional gel electrophoresis is suitable to detect changes in proteins present in a cell under different conditions, at different stages in development or the cell cycle, or in different organisms [43].

3.2.5. Southwestern Blotting (Immunoblotting)

Southwestern blotting is a method that is used to isolate, identify, and characterize DNA-binding proteins by their ability in binding to specific oligonucleotide probes [44, 45]. Many of the DNA-binding proteins in the cell need to be isolated individually and characterized to define the gene function [44]. Three steps are involved in this method. First, nuclear protein extracts are separated by SDS-PAGE electrophoresis. Next, separated proteins are transferred to a nitrocellulose filter, polyvinylidene difluoride (PVDF) or cationic nylon membrane [12]. The filter will then be incubated with oligonucleotide probes to analyze the adsorbed proteins [44, 45]. However, this technique is beset with problems such as large amounts of nuclear proteins are required (typically 50–100 mg), protein degradation during isolation, facing difficulties in achieving efficient electrophoretic separation and transfer of a wide molecular size range of proteins [45].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2.1 การแลกเปลี่ยนไอออน Chromatographyแลกเปลี่ยนไอออน chromatography แยกโปรตีนตามค่า ionic ของพื้นผิวโดยใช้ยางที่มีการปรับเปลี่ยน ด้วย คิดบวก หรือ คิดลบเคมีกลุ่ม [4, 7] โปรตีนส่วนใหญ่มีค่าธรรมเนียมรวมค่าลบ หรือค่าบวกขึ้นอยู่กับจุดของ isoelectric (pI) ในการกำหนดค่า pH ซึ่งทำให้พวกเขาสามารถโต้ตอบกับตรงกันข้ามการคิด chromatographic เมตริกซ์ [7] ถ้าประจุสุทธิของโปรตีนเป็นจำนวนเต็มบวกที่มี pH ต่ำกว่าค่า pI โปรตีนจะผูกกับเครื่องแลกเปลี่ยน cation เป็นลบที่ pH สูงกว่าค่า pI ประจุสุทธิของโปรตีน และโปรตีนจะผูกกับแลกเปลี่ยน anion [38]โปรตีนที่โต้ตอบกับเรซิ่น อ่อนแอเช่นโปรตีนคิดค่าธรรมเนียมบวกส่งผ่านยางปรับเปลี่ยนกลุ่มการคิดค่าธรรมเนียมส่ง weakly จะ eluted ออกในบัฟเฟอร์เกลือต่ำ บนมืออื่น ๆ โปรตีนที่โต้ตอบขอต้องการเกลือเพิ่มเติมเพื่อจะ eluted โปรตีน มีค่าคล้ายลักษณะสามารถแบ่งออกเป็นส่วนต่าง ๆ ตามที่พวกเขาจะ eluted จากคอลัมน์ โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ elution [7]คอลัมน์การแลกเปลี่ยนไอออนเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่ใช้หลักการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography [33] ใช้เทคโนโลยีเมมเบรนดูดซับเป็นเมทริกซ์ chromatographic เพื่อแยกโปรตีน Absorbents เมมเบรนในคอลัมน์จะเสถียรใช้เซลลูโลส มีโครงสร้างสูง porous ที่ให้โปรตีนถึงผิวคิดค่าธรรมเนียมได้ ระหว่างโมเลกุลและไซต์ที่ใช้งานอยู่บนเมมเบรนเกิดขึ้นในด้วยการพาผ่านรูขุมขน ดังนั้น สาร adsorptive มีศักยภาพในการรักษาประสิทธิภาพสูงเมื่อบริสุทธิ์ชื่อโมเลกุลชีวภาพขนาดใหญ่กับแพร่ต่ำ [33]3.2.2. เจลอาบน้ำ Chromatographyเจลอาบน้ำกรอง chromatography เรียกว่าแยกขนาดหรือเจลซึม chromatography แยกโปรตีน ตามขนาดของโมเลกุล และรูปร่างโมเลกุลไม่ผูกปานกลาง chromatography [39] มันคือกระบวนการที่ผ่านโมเลกุลใหญ่ผ่านคอลัมน์ได้เร็วกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก โมเลกุลขนาดเล็กสามารถใส่หลุมเล็ก ๆ ของเมทริกซ์ทั้งหมด และเข้าถึงคอลัมน์เพิ่มเติม โปรตีนขนาดเล็กจะผ่านหลุมเหล่านั้น และใช้เวลามากกว่าเวลาคอลัมน์เปรียบเทียบกับโปรตีนขนาดใหญ่ที่ไม่ได้ลงในหลุมเหล่านั้น แต่ทำงานออกโดยตรงของคอลัมน์ผ่านพื้นที่โมฆะในคอลัมน์ [4, 7]ชุดเจลอาบน้ำ chromatography ใช้หลักการของเจกรอง chromatography [40] ตัวอย่างเป้าหมายจะใช้บนคอลัมน์ที่ประกอบด้วยลูกปัด porous ตัวอย่างของเมทริกซ์ในคอลัมน์ รับการแยกโมเลกุลเมื่อโมเลกุลผ่านคอลัมน์ของประคำ porous แยกโมเลกุลสามารถแบ่งออกเป็น 3 ประเภทหลัก: รวมแยก การซึมผ่านที่เลือก และวงเงินรวมซึมได้ รวมแยกเป็นส่วนที่โมเลกุลขนาดใหญ่ไม่สามารถใส่รูขุมขน และ elute อย่างรวดเร็ว การซึมผ่านใช้ภูมิภาค โมเลกุลปานกลางอาจใส่รูขุมขน และอาจมีเวลาพำนักเฉลี่ยในอนุภาคขึ้นอยู่กับขนาดและรูปร่างของพวกเขา สำหรับวงเงินรวมซึม โมเลกุลขนาดเล็กมีเวลาพำนักยาวเมื่อเข้ารูขุมขนบนคอลัมน์ [40] ข้อดีของเจ chromatography ที่ใช้กรองคือ ว่า มันเหมาะสำหรับชื่อโมเลกุลชีวภาพที่อาจมีความไวต่อค่า pH เปลี่ยน ความเข้มข้นของประจุโลหะ และสภาพแวดล้อมรุนแรง [39]3.2.3 การเชื่อมโยงกับ ChromatographyChromatography ความสัมพันธ์ขึ้นอยู่กับการโต้ตอบเฉพาะระหว่างโปรตีนและเฟสของแข็งมีผลต่อการแยกจากสารปนเปื้อน จะประกอบด้วยขั้นตอนเดียวกันเป็นการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography [38] มันช่วยทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนโดยฟังก์ชันชีวภาพหรือโครงสร้างเคมีละ [41] โปรตีนที่มีความสัมพันธ์สูงต่อกลุ่มเคมีเฉพาะ ligands จะแนบ และผูกเข้ากับเมตริกซ์คอลัมน์ในขณะที่โปรตีนอื่น ๆ ผ่านคอลัมน์ [38] covalently ไฟฟ้าสถิต หรือ hydrophobic โต้ van der Waals ของกอง และไฮโดรเจนยึดเป็นการโต้ตอบทางชีวภาพระหว่าง ligands และโปรตีนเป้าหมาย [41] โปรตีนที่ถูกผูกไว้จะ eluted ออกจากคอลัมน์ โดยการแก้ปัญหาที่ประกอบด้วยความเข้มข้นสูงของฟอร์มละลายของลิแกนด์ [36]ลิแกนด์ biospecific ที่สามารถแนบกับเมทริกซ์ chromatography covalently เป็นหนึ่งในความต้องการสำหรับความสัมพันธ์ที่ประสบความสำเร็จทำให้บริสุทธิ์ รวมระหว่างโมเลกุลโปรตีนลิแกนด์และเป้าหมายต้องสมมติให้โปรตีนออกในฟอร์มใช้งาน [41] หลังจากชะสารปนเปื้อน ลิแกนด์ coupled ต้องรักษาความสัมพันธ์ผูกเฉพาะสำหรับโปรตีนเป้าหมาย ตัวอย่างของการโต้ตอบทางชีวภาพที่มักใช้ในความสัมพันธ์ chromatography แสดงไว้ในตารางที่ 1 (ดู [41])tab1ตารางที่ 1: ปกติชีวภาพโต้ใช้ในความสัมพันธ์ chromatography [42]แยก chromatographic โดยความสัมพันธ์ส่วนการตรึงบนมีลูกปัดเรซิ่น porous ligands เป็นพื้นฐานการวิจัยโปรตีน [42] ชุดสมบูรณ์ที่ประกอบด้วยคอลัมน์ยางชุดลูกปัดความสัมพันธ์ตามหลักการของความสัมพันธ์ chromatography มีการแนะนำสู่ตลาด [42] ยางมีความเกี่ยวข้องสามารถใช้ชุดรูปแบบหรือ microcentrifuge หมุนคอลัมน์ขึ้นอยู่กับขนาดและชนิดของการทดลองทำ นอกจากนี้ มันสามารถถูกบรรจุลงในบางจัดเรียงของใหญ่กว่าแรงโน้มถ่วงกระแสคอลัมน์ด้วย [42]3.2.4 การเจล Electrophoresisเจ electrophoresis เป็นวิธีการแยกโปรตีนตามคุณสมบัติของขนาดและค่าธรรมเนียม โปรตีนบริสุทธิ์บางส่วนจากประโยชน์ chromatography สามารถจะบริสุทธิ์กับเจล polyacrylamide nondenaturing electrophoresis (หน้า), electrophoresis เจดั้งเดิม [4] ต่อไป หน้า โปรตีนที่ถูกขับเคลื่อน โดยปัจจุบันการใช้ผ่านเมทริกซ์ gelated [43] การเคลื่อนที่ของโปรตีนโดยใช้เจลนี้ขึ้นอยู่กับความหนาแน่นค่าธรรมเนียม (ค่าธรรมเนียมต่อหน่วยมวล) ของโมเลกุล โมเลกุล มีความหนาแน่นสูงค่าธรรมเนียมย้ายอย่างรวดเร็ว ขนาดและรูปร่างของโปรตีนมีอีกสองปัจจัยสำคัญที่ส่งผลต่อการแยกส่วนหน้า [43] ขนาดรูขุมขนอะคริลาไมด์เล่นบทบาทเป็นตะแกรงโมเลกุลในการแยกขนาดของโปรตีน [4] ใหญ่กว่าโปรตีน ช้ามากมันย้ายมากขึ้นจะเกี่ยวในเจล [43] รูปร่างยังเป็นหนึ่งปัจจัยเนื่องจากโปรตีนขนาดกะทัดรัด globular ย้ายเร็วกว่าอีลองเกตโปรตีนเยื่อของเทียบมวลโมเลกุล [43]โดยปกติดำเนินการหน้าออกในต่อหน้าของ dodecyl โซเดียมซัลเฟต (SDS) [44] โปรตีนที่รับ SDS จะมักจะกำจัดโครงสร้างรอง ระดับตติยภูมิ และ quarternary โปรตีน [4, 7] แฉเป็นรูปร่างเหมือนเหล็กคล้ายโปรตีน เพราะ repulsion สถิตระหว่างโมเลกุล SDS ผูก จำนวนโมเลกุลของ SDS ซึ่งผูกกับโปรตีนเป็นสัดส่วนประมาณกับมวลโมเลกุลของโปรตีน (ประมาณ 1.4 กรัม SDS/กรัม โปรตีน) [43] แต่ละชนิดโปรตีนมีความหนาแน่นค่าธรรมเนียมเทียบเท่า และขับเคลื่อนผ่านเจมีแรงเดียว [43] นอกจากนี้ หน้าสามารถลด denaturation ของโปรตีน โปรตีนจำนวนมากยังคงรักษากิจกรรมชีวภาพหลังจากรันหน้า [7] อย่างไรก็ตาม โปรตีนขนาดใหญ่มีจัดขึ้นให้ถึงระดับสูงกว่าโปรตีนที่มีขนาดเล็กเนื่องจาก polyacrylamide การ cross-linked สูง [43] ดังนั้น โปรตีนเป็นคั่น ด้วย SDS-หน้าตามมวลโมเลกุลของ หน้าองค์กรสามารถใช้เพื่อกำหนดมวลโมเลกุลของส่วนผสมของโปรตีน โดยการเปรียบเทียบตำแหน่งของวงการผู้ผลิตโปรตีนขนาดรู้จัก [43] องค์กรใช้ electrophoresis แก้ไขส่วนผสมของโปรตีนตามความยาวของโซ่ polypeptide ละ [7]เป็นพัฒนาเทคนิคที่เรียกว่า electrophoresis เจสอง โดย Patrick O'Farrell ในปี 1975 มันใช้ fractionate ส่วนผสมที่ซับซ้อนของโปรตีน โดยใช้เทคนิคแตกต่างกันสองตัวเน้น isoelectric และ SDS-หน้า [43] ครั้งแรก โปรตีนจะแยกตามจุดของ isoelectric ในเจท่อ หลังจากแยกนี้ เจจะเอาออก และวางไว้บนพื้นของ polyacrylamide SDS อิ่มตัว โปรตีนที่ย้ายไปเจพื้น และแยกตามมวลโมเลกุลของพวกเขา [43] สองเจ electrophoresis เหมาะเพื่อตรวจหาการเปลี่ยนแปลงในโปรตีนที่อยู่ในเซลล์ภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกัน ในระยะต่าง ๆ ในการพัฒนาหรือวงจรเซลล์ หรือสิ่งมีชีวิตอื่น [43]3.2.5. ตะวันตกเฉียงใต้ blotting วิธี (Immunoblotting)Southwestern blotting is a method that is used to isolate, identify, and characterize DNA-binding proteins by their ability in binding to specific oligonucleotide probes [44, 45]. Many of the DNA-binding proteins in the cell need to be isolated individually and characterized to define the gene function [44]. Three steps are involved in this method. First, nuclear protein extracts are separated by SDS-PAGE electrophoresis. Next, separated proteins are transferred to a nitrocellulose filter, polyvinylidene difluoride (PVDF) or cationic nylon membrane [12]. The filter will then be incubated with oligonucleotide probes to analyze the adsorbed proteins [44, 45]. However, this technique is beset with problems such as large amounts of nuclear proteins are required (typically 50–100 mg), protein degradation during isolation, facing difficulties in achieving efficient electrophoretic separation and transfer of a wide molecular size range of proteins [45].

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2.1 แลกเปลี่ยนไอออนไอออนโครมาแลกเปลี่ยนแยกโปรตีนขึ้นอยู่กับพื้นผิวของพวกเขาเสียค่าใช้จ่ายอิออนโดยใช้เรซินที่มีการแก้ไขที่มีทั้งประจุบวกหรือประจุลบกลุ่มสารเคมี [4, 7] โปรตีนส่วนใหญ่จะมีค่าใช้จ่ายลบหรือบวกขึ้นอยู่กับมุม Isoelectric พวกเขาโดยรวม (PI) ที่ pH ที่กำหนดซึ่งทำให้พวกเขาเป็นไปได้ที่จะมีปฏิสัมพันธ์กับค่าใช้จ่ายตรงข้ามเมทริกซ์โครมา [7] หากค่าใช้จ่ายสุทธิของโปรตีนที่เป็นบวกที่ pH ต่ำกว่าค่า pI ที่โปรตีนจะผูกกับการแลกเปลี่ยนไอออนบวกหนึ่ง ที่ pH ดังกล่าวข้างต้นค่า pI ที่ค่าใช้จ่ายสุทธิของโปรตีนที่เป็นลบและโปรตีนจะผูกกับการแลกเปลี่ยนไอออน [38]. โปรตีนที่โต้ตอบอย่างอ่อนกับเรซินเช่นโปรตีนอ่อนแอประจุบวกผ่านเรซินแก้ไขด้วยในเชิงลบ กลุ่มค่าใช้จ่ายจะถูกชะออกมาในบัฟเฟอร์เกลือต่ำ ในทางกลับกัน, โปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์ที่จำเป็นอย่างยิ่งเกลือมากขึ้นที่จะชะ โปรตีนที่มีลักษณะค่าใช้จ่ายที่คล้ายกันมากสามารถแยกออกเป็นเศษส่วนที่แตกต่างกันที่พวกเขาจะชะจากคอลัมน์โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ชะเมื่อ [7]. คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่ใช้หลักการของโคแลกเปลี่ยนไอออน [33 ] จะใช้เทคโนโลยีเมมเบรนดูดซับเป็นเมทริกซ์ในการแยกสารโปรตีน ดูดซับเมมเบรนในคอลัมน์จะมีความเสถียรเซลลูโลสตามที่มีโครงสร้างที่มีรูพรุนสูงที่ให้โปรตีนเข้าสู่ผิวได้อย่างง่ายดายเรียกเก็บ การโต้ตอบกันของโมเลกุลและเว็บไซต์ที่ใช้งานบนเมมเบรนที่เกิดขึ้นในการไหลเวียนผ่านรูขุมขน ดังนั้นเยื่อดูดซับมีศักยภาพในการรักษาที่มีประสิทธิภาพสูงเมื่อบริสุทธิ์สารชีวโมเลกุลขนาดใหญ่ที่มีการแพร่กระจายต่ำ [33]. 3.2.2 กรองเจลโครมาโตรกรองเจลที่เรียกว่าขนาดยกเว้นหรือโคเจลซึมผ่านแยกโปรตีนตามขนาดและรูปร่างโมเลกุลโมเลกุลและไม่ได้ผูกกลางโคบ [39] มันเป็นกระบวนการที่โมเลกุลขนาดใหญ่ผ่านคอลัมน์เร็วกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก โมเลกุลขนาดเล็กสามารถใส่ทั้งหมดของหลุมเล็ก ๆ ของแมทริกซ์และเข้าถึงมากขึ้นของคอลัมน์ โปรตีนขนาดเล็กจะผ่านหลุมเหล่านั้นและใช้เวลามากขึ้นในการทำงานออกจากคอลัมน์เมื่อเทียบกับโปรตีนขนาดใหญ่ที่ไม่สามารถได้รับในหลุมเหล่านั้น แต่วิ่งออกโดยตรงของคอลัมน์ผ่านพื้นที่ช่องว่างในคอลัมน์ [4, 7] ชุดกรองโคเจลใช้หลักการของการกรองโคเจล [40] กลุ่มตัวอย่างเป้าหมายถูกนำไปใช้ด้านบนของคอลัมน์ที่มีลูกปัดที่มีรูพรุนตัวอย่างของเมทริกซ์ในคอลัมน์ที่ โมเลกุลเมื่อได้รับการแยกโมเลกุลผ่านคอลัมน์ของเม็ดมีรูพรุน การแยกตัวของโมเลกุลที่สามารถแบ่งออกเป็นสามประเภทหลัก: การยกเว้นรวมการซึมผ่านการคัดเลือกและการ จำกัด การซึมผ่านรวม ยกเว้นรวมเป็นส่วนหนึ่งที่โมเลกุลขนาดใหญ่ไม่สามารถเข้าสู่รูขุมขนและชะรวดเร็ว สำหรับภาคการซึมผ่านการคัดเลือกโมเลกุลกลางอาจเข้าสู่รูขุมขนและอาจมีเวลาที่อยู่อาศัยโดยเฉลี่ยในอนุภาคขึ้นอยู่กับขนาดและรูปร่างของพวกเขา ในฐานะที่เป็นขีด จำกัด ของการซึมผ่านรวมโมเลกุลขนาดเล็กมีเวลาที่อยู่อาศัยที่ยาวที่สุดเมื่อพวกเขาเข้าสู่รูขุมขนบนคอลัมน์ [40] ประโยชน์ของสารกรองที่ใช้เจลก็คือว่ามันเหมาะกับสารชีวโมเลกุลที่อาจจะไวต่อการเปลี่ยนแปลงค่า pH ความเข้มข้นของไอออนโลหะและสภาพแวดล้อมที่รุนแรง [39]. 3.2.3 ความสัมพันธ์โครมาโตร Affinity ขึ้นอยู่กับการทำงานร่วมกันเฉพาะระหว่างโปรตีนและของแข็งที่จะส่งผลกระทบต่อการแยกสารปนเปื้อนจาก มันประกอบไปด้วยขั้นตอนเช่นเดียวกับสารแลกเปลี่ยนไอออน [38] ซึ่งจะช่วยให้การทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนที่อยู่บนพื้นฐานของการทำงานทางชีวภาพของตนหรือบุคคลที่โครงสร้างทางเคมี [41] โปรตีนที่มีความสัมพันธ์กันสูงต่อกลุ่มสารเคมีที่เฉพาะเจาะจงเช่นแกนด์โควาเลนต์จะแนบและผูกกับคอลัมน์เมทริกซ์ในขณะที่โปรตีนชนิดอื่น ๆ ผ่านคอลัมน์ [38] ปฏิสัมพันธ์ไฟฟ้าสถิตหรือไม่ชอบน้ำแรงแวนเดอร์ Waals 'และพันธะไฮโดรเจนมีปฏิสัมพันธ์ทางชีวภาพระหว่างแกนด์และโปรตีนเป้าหมาย [41] โปรตีนที่ถูกผูกไว้จะถูกชะออกจากคอลัมน์โดยวิธีการแก้ปัญหาที่มีความเข้มข้นสูงของรูปแบบที่ละลายน้ำได้ของลิแกนด์ [36]. แกนด์ biospecific ที่สามารถแนบไปกับเมทริกซ์โคโควาเลนต์เป็นหนึ่งในความต้องการสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ความสัมพันธ์ที่ประสบความสำเร็จ ผูกพันระหว่างแกนด์และโมเลกุลโปรตีนเป้าหมายจะต้องย้อนกลับมาเพื่อช่วยให้โปรตีนจะถูกลบออกในรูปแบบที่ใช้งาน [41] หลังจากล้างสารปนเปื้อนออกไปที่แกนด์คู่จะต้องรักษาความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันเฉพาะโปรตีนเป้าหมาย ตัวอย่างบางส่วนของการมีปฏิสัมพันธ์ทางชีวภาพที่มักจะใช้ในโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดมีการระบุไว้ในตารางที่ 1 (ดู [41]). tab1 ตารางที่ 1. การมีปฏิสัมพันธ์ทางชีวภาพโดยทั่วไปใช้ในโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิด [42] แยกโครมาจากความสัมพันธ์ที่แตกต่างกันเพื่อให้แกนด์ตรึงบนลูกปัด เรซินที่มีรูพรุนเป็นพื้นฐานในการวิจัยโปรตีน [42] ชุดที่สมบูรณ์แบบที่มีแพ็คคอลัมน์เรซินลูกปัดความสัมพันธ์บนพื้นฐานของหลักการโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดได้รับการแนะนำให้รู้จักกับตลาด [42] เรซินสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดสามารถนำมาใช้ในชุดหรือไมโครรูปแบบคอลัมน์หมุนขึ้นอยู่กับขนาดและประเภทของการทดลองที่จะดำเนินการ นอกจากนี้ยังสามารถนำมาบรรจุลงในการจัดเรียงบางส่วนของคอลัมน์ไหลแรงโน้มถ่วงที่มีขนาดใหญ่เช่นกัน [42]. 3.2.4 เจล Electrophoresis electrophoresis เจลเป็นวิธีการที่จะแยกโปรตีนตามขนาดและคุณสมบัติของพวกเขาเสียค่าใช้จ่าย โปรตีนบริสุทธิ์บางส่วนจากการแยกสารที่สามารถทำให้บริสุทธิ์ต่อไปด้วยข่าวคราว polyacrylamide nondenaturing (หน้า) หรือข่าวคราวพื้นเมือง [4] ในหน้าโปรตีนจะขับเคลื่อนด้วยกระแสที่ใช้ผ่านเมทริกซ์ gelated [43] การเคลื่อนไหวของโปรตีนที่ผ่านการเจลนี้ขึ้นอยู่กับความหนาแน่นของค่าใช้จ่าย (ค่าใช้จ่ายต่อหน่วยของมวล) ของโมเลกุล โมเลกุลที่มีประจุความหนาแน่นสูงโยกย้ายอย่างรวดเร็ว ขนาดและรูปร่างของโปรตีนเป็นอีกสองปัจจัยสำคัญที่มีอิทธิพลต่อการแยกหน้า [43] ริลาไมด์ขนาดรูขุมขนมีบทบาทเป็นตะแกรงโมเลกุลที่จะแยกขนาดแตกต่างกันของโปรตีน [4] ที่มีขนาดใหญ่โปรตีนที่ช้าลงมันย้ายมันจะกลายเป็นทอดในเจล [43] รูปร่างยังเป็นหนึ่งในปัจจัยเพราะโปรตีนกลมขนาดกะทัดรัดเคลื่อนตัวได้เร็วกว่าโปรตีนเส้นใยยาวของมวลโมเลกุลเปรียบ [43]. หน้ามักจะดำเนินการในการปรากฏตัวของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตที่ (SDS) [44] โปรตีนรับการรักษาด้วยวิธี SDS มักจะขจัดรองในระดับอุดมศึกษาและโครงสร้างของโปรตีน quarternary [4, 7] โปรตีนแฉเป็นรูปทรงแท่งเหมือนที่คล้ายกันเพราะเขม่นไฟฟ้าสถิตระหว่างโมเลกุล SDS ที่ถูกผูกไว้ จำนวนของโมเลกุล SDS ที่ผูกกับโปรตีนประมาณสัดส่วนกับมวลโมเลกุลของโปรตีน (ประมาณ 1.4 กรัม SDS / g โปรตีน) [43] ชนิดโปรตีนแต่ละคนมีค่าความหนาแน่นเทียบเท่าและเป็นแรงผลักดันผ่านการเจลที่มีผลบังคับใช้เหมือนกัน [43] นอกจากนี้หน้าสามารถลดสูญเสียสภาพธรรมชาติของโปรตีน โปรตีนหลายคนยังคงรักษาฤทธิ์ทางชีวภาพของพวกเขาหลังจากที่ทำงานหน้า [7] แต่โปรตีนที่มีขนาดใหญ่จะถูกจัดขึ้นในระดับที่สูงกว่าโปรตีนที่มีขนาดเล็กเพราะ polyacrylamide จะสูง cross-linked [43] ดังนั้นโปรตีนกลายเป็นที่แยกจากกันโดย SDS-PAGE บนพื้นฐานของมวลโมเลกุลของพวกเขา SDS-PAGE สามารถใช้ในการตรวจสอบมวลโมเลกุลของส่วนผสมของโปรตีนโดยการเปรียบเทียบตำแหน่งของวงดนตรีให้กับผู้ผลิตโดยโปรตีนที่มีขนาดรู้จักกัน [43] SDS ที่ใช้ในการแก้ปัญหาอิส่วนผสมของโปรตีนตามความยาวของโซ่ polypeptide บุคคล [7]. เทคนิคที่เรียกว่าข่าวคราวสองมิติได้รับการพัฒนาโดยแพทริคแฟร์เรลล์ในปี 1975 มันถูกใช้เพื่อ fractionate ผสมที่ซับซ้อนของโปรตีนโดยใช้สอง ที่แตกต่างกันเทคนิค Isoelectric มุ่งเน้นและ SDS-PAGE [43] ครั้งแรกที่โปรตีนจะถูกแยกออกไปตามจุด Isoelectric ของพวกเขาในเจลท่อ หลังจากที่แยกนี้เจลจะถูกลบออกและวางไว้ที่ด้านบนของแผ่นอะคริเลต SDS-อิ่มตัว โปรตีนที่ย้ายเข้าไปอยู่ในเจลพื้นและแยกตามมวลโมเลกุลของพวกเขา [43] ข่าวคราวสองมิติมีความเหมาะสมในการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในโปรตีนที่มีอยู่ในมือถือภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกันในแต่ละขั้นตอนที่แตกต่างกันในการพัฒนาหรือวงจรมือถือหรือสิ่งมีชีวิตที่แตกต่างกันใน [43]. 3.2.5 ทิศตะวันตกเฉียงใต้ซับ (immunoblotting) ซับทิศตะวันตกเฉียงใต้เป็นวิธีการที่ใช้ในการแยกระบุลักษณะและโปรตีนดีเอ็นเอผูกพันด้วยความสามารถในการเชื่อมโยงไปยังโพรบ oligonucleotide เฉพาะ [44, 45] หลายของโปรตีนดีเอ็นเอผูกพันในเซลล์จะต้องมีการแยกเป็นรายบุคคลและการกำหนดลักษณะการทำงานของยีน [44] สามขั้นตอนที่มีส่วนเกี่ยวข้องในวิธีการนี้ ครั้งแรกที่สารสกัดจากโปรตีนนิวเคลียร์จะถูกคั่นด้วยอิ SDS-PAGE ถัดไปแยกโปรตีนจะถูกโอนไปกรอง nitrocellulose, Polyvinylidene difluoride (PVDF) หรือเมมเบรนไนลอนประจุบวก [12] ตัวกรองจะถูกบ่มกับยานสำรวจ oligonucleotide การวิเคราะห์โปรตีนดูดซับ [44, 45] อย่างไรก็ตามเทคนิคนี้จะรุมเร้าด้วยปัญหาดังกล่าวเป็นจำนวนมากของโปรตีนนิวเคลียร์จะต้อง (ปกติ 50-100 มก.) การย่อยสลายโปรตีนในระหว่างการแยกหันหน้าไปทางความยากลำบากในการบรรลุการแยกที่มีประสิทธิภาพและการถ่ายโอน electrophoretic ของช่วงขนาดกว้างโมเลกุลของโปรตีน [45] .

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดำเนินงาน . การแลกเปลี่ยนไอออนโครมาโตกราฟีแลกเปลี่ยนไอออน chromatography

แยกโปรตีนตามพื้นผิวของไอออนประจุโดยใช้เรซินที่มีการปรับเปลี่ยนด้วยเช่นกัน มีประจุบวกหรือลบค่าสารเคมีกลุ่ม [ 4 , 5 ] โปรตีนส่วนใหญ่มีประจุลบ หรือ บวก โดยรวมขึ้นอยู่กับจุดไอโซอิเล็กทริก ( PI ) ที่ให้ด่างซึ่งทำให้พวกเขาสามารถโต้ตอบกับการเรียกเก็บเงิน และตรงข้ามกับเมทริกซ์ [ 7 ] ถ้าประจุสุทธิของโปรตีนเป็นบวกที่ pH ด้านล่างค่า พาย โปรตีนจะทำให้การแลกเปลี่ยนไอออนบวก ; ที่ pH สูงกว่ามูลค่าสุทธิและค่าใช้จ่ายของโปรตีนที่เป็นลบและโปรตีนจะทำให้การแลกเปลี่ยนไอออน [ 38 ] .

โปรตีนที่โต้ตอบอย่างอ่อนกับเรซิ่น ,ตัวอย่างเช่นอ่อนแอโปรตีนผ่านดัดแปลงด้วยเรซินประจุบวกกับประจุลบ กลุ่ม มีตัวอย่างในบัฟเฟอร์เกลือต่ำ บนมืออื่น ๆ , โปรตีนที่โต้ตอบขอต้องการเกลือมากกว่าที่จะตัวอย่าง .โปรตีนที่มีลักษณะค่าใช้จ่ายที่คล้ายกันมากสามารถแบ่งออกเป็นเศษส่วนที่แตกต่างกันเช่นที่พวกเขามีตัวอย่างจากคอลัมน์โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือในสารประกอบบัฟเฟอร์ [ 7 ] .

คอลัมน์ไอออนแลกเปลี่ยนเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่ใช้หลักการของการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography [ 33 ] ใช้ดูดซับเทคโนโลยีเมมเบรนเป็นเมทริกซ์ และการแยกโปรตีนเยื่อแผ่นเซลลูโลสจากวัสดุดูดซับในคอลัมน์ที่มีเสถียรภาพสูงด้วยโครงสร้างรูพรุนที่ให้โปรตีนเข้าประจุพื้นผิวได้อย่างง่ายดาย ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลและใช้งานเว็บไซต์ในเมมเบรนเกิดขึ้นโดยผ่านรู ดังนั้นนำมาหุ้มมีศักยภาพในการรักษาประสิทธิภาพสูงเมื่อบริสุทธิ์สารชีวโมเลกุลขนาดใหญ่ที่มีการแพร่กระจายต่ำ [ 33 ] .

3.2.2 . gel filtration chromatography

gel filtration chromatography , ยังเรียกว่าขนาดการยกเว้นหรือโครมาโทกราฟีใช้เจล แยกตามขนาดและรูปร่างของโมเลกุลโปรตีนและโมเลกุลไม่ผูกกับสื่อ chromatography [ 39 ]มันคือกระบวนการที่โมเลกุลขนาดใหญ่ผ่านคอลัมน์เร็วกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก โมเลกุลขนาดเล็กที่สามารถเข้าสู่ทั้งหมดของหลุมเล็ก ๆของเมทริกซ์และการเข้าถึงเพิ่มเติมของคอลัมน์โปรตีนขนาดเล็กจะผ่านหลุมนั้น และใช้เวลาวิ่งออกจากคอลัมน์เมื่อเทียบกับโปรตีนขนาดใหญ่ที่ไม่สามารถเข้าไปในหลุมนั้น แต่วิ่งออกตรงของคอลัมน์ผ่านช่องว่างในคอลัมน์ [ 4 , 5 ] .

gel filtration chromatography Kit ใช้หลักการของ gel filtration chromatography [ 40 ]ตัวอย่างเป้าหมายใช้ด้านบนของคอลัมน์ ซึ่งมีรูพรุน ลูกปัด , ตัวอย่างของเมทริกซ์ในคอลัมน์ โมเลกุลที่แยกจากกันเมื่อโมเลกุลผ่านคอลัมน์ของวัสดุเม็ด การแยกโมเลกุลสามารถแบ่งออกเป็นสามประเภทหลัก : ทั้งหมดยกเว้นงาน การซึมผ่านและจำกัดการซึมผ่านทั้งหมด