3.1. PCR analysis of bacteriocinoge

3.1. PCR analysis of bacteriocinogenic LAB using a PCR bacteriocin primer
array
We examined bacteriocinogenic LAB isolated from retail foods
(Table 1; Garver and Muriana, 1993; Macwana and Muriana, 2012) by
a PCR primer array designed to accommodate various bacteriocin structural
genes forwhich sequence informationwas available (Table 2). We
obtained successful amplification of bacteriocin-related DNA sequences
with 1 to 6 primer sets with every Bac+ LAB strain that we examined
with our PCR bacteriocin primer array (Figs. 1, 2, and 4). DNA melting
curve and agarose gel analysis helped to identifywhether PCR products
were identical; if not,weopted to submit themfor DNA sequence determination
at our core facility followed by sequence analysis.
3.2. PCR bacteriocin primer array amplifies the same bacteriocin sequence
with different primer pairs
Amplification of nucleic acid extracted from P. acidilactici Bac3 occurredwithwith
4 sets of primers designed from4 different bacteriocin
structural genes (Fig. 1): papA (Pediococcus pentosaceous), pedB (Pediococcus
acidilactici), plnA (Lactobacillus plantarum), and sakX (Lactobacillus
sakei). When amplimers generated by these different primerpairs
were sequenced and analyzed by multiple sequence alignment,
the sequence of the intra-primer regions generated with P. acidilactici
Bac3 as template using primer pairs from different bacteriocins were
identical (Fig. 1). However, when the sequence information specific to
P. acidilactici Bac3 was compared to the bacteriocin structural genes
from which the primers were derived, there were obvious differences
within the intra-primer regions and those pertaining to Bac3 (Fig. 1).
3.3. PCR bacteriocin primer array identifies 3 different bacteriocin genes
in the same strain
A Bac+ isolate from ground pork (sausage) was identified as
Lactobacillus sakei (strain JD) by API identification. PCR bacteriocin
primer array analysis of Lb. sakei JD resulted in multiple PCR primer
sets exhibiting amplification. Sequence analysis identified 3 different
bacteriocin sequences that had little homology to each other and a
Blast search of GenBank showed that we identified three different
bacteriocin structural genes within a single Bac+ strain (Fig. 2).
Two of these bacteriocins (Sakacin T and Sakacin X) showed high homology
to bacteriocins found in Lb. sakei while the third bacteriocin
showed homology to one produced by Lb. curvatus (Curvacin A).
The prospects for multiple bacteriocin genes within individual
strains confirmed the need to sequence all successful amplimers
obtained with different primers sets. We also did this with 2 Bac+
strains of Lactococcus lactis isolated fromraw pork (RP1) and vegetables
(FS97). In both cases, we again identified three bacteriocin
genes in each strain that correlated to a two-component ltnA/ltnB
bacteriocin and additional lcnB bacteriocin thatwas previously identified
in Lc. Lactis (Garneau et al., 2002; van Belkum et al., 1992)
(Fig. 3). Lc. Lactis FS97 was of interest because it was unique in
being able to inhibit L. monocytogenes strains that had acquired bacteriocin
resistance to 2 different modes of actions and was categorized
as a bacteriocin belonging to a 3 rd mode of action (Macwana and
Muriana, 2011).
3.4. PCR bacteriocin primer array identifies bacteriocin gene of a bacteriocin
that had an N-blocked terminus and whose sequence could not be
determined by Edman degradation
The bacteriocin primer array was also successful in identifying the
bacteriocin structural gene sequence in Lc. lactis FS92, a bacteriocinogenic
strain for which we were not able to determine amino acid sequence
using purified bacteriocin, presumably due to an N-blocked
terminus that prevented amino acid sequencing by Edman degradation
(Mao et al., 2001). Amplification of the lacticin FS92 bacteriocin
with primers from the lacA gene of Lc. lactis resulted in the identity
of a structural gene sequence sharing 92% homology with that in
FS92 (Fig. 4).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.1 การ bacteriocinogenic LAB ที่ใช้รองพื้นแบบ PCR bacteriocin วิเคราะห์ PCRอาร์เรย์เราตรวจสอบ bacteriocinogenic LAB ที่แยกต่างหากจากอาหารขายปลีก(ตารางที่ 1 Garver และ Muriana, 1993 Macwana และ Muriana, 2012) โดยเรย์พื้น PCR ออกแบบมาเพื่อรองรับโครงสร้าง bacteriocin ต่าง ๆยีน forwhich ลำดับ informationwas ว่าง (ตารางที่ 2) เราได้ขยายความสำเร็จของลำดับดีเอ็นเอที่เกี่ยวข้องกับ bacteriocinมี 1-6 รองพื้นชุดกับทุกต้องใช้บัค + LAB ที่เราตรวจสอบพร้อมของ PCR bacteriocin รองพื้น (Figs. 1, 2 และ 4) ดีเอ็นเอที่ละลายเส้นโค้งและ agarose เจวิเคราะห์ช่วยให้ผลิตภัณฑ์ PCR identifywhetherได้เหมือนกัน ถ้า ไม่ weopted ต้องกำหนดลำดับดีเอ็นเอ themforที่สถานหลักของเราตามลำดับวิเคราะห์3.2. PCR bacteriocin พื้นเรย์กำลังโคจรอยู่ซึ่งตามลำดับ bacteriocinมีคู่รองพื้นแตกต่างกันขยายของกรดนิวคลีอิกที่สกัดจาก P. acidilactici Bac3 occurredwithwithชุดที่ 4 ของไพรเมอร์ออก bacteriocin from4 แตกต่างกันยีนโครงสร้าง (Fig. 1): ปาป้า (Pediococcus pentosaceous) pedB (Pediococcusacidilactici), plnA (แลคโตบาซิลลัส plantarum), และ sakX (แลคโตบาซิลลัสsakei) สร้างเมื่อ amplimers โดย primerpairs เหล่านี้แตกต่างกันเรียงลำดับ และวิเคราะห์ โดยหลายลำดับตำแหน่งลำดับของภูมิภาคภายในพื้นที่สร้างกับ P. acidilacticiBac3 เป็นคู่รองพื้นจาก bacteriocins ที่แตกต่างกันไปได้เหมือนกัน (Fig. 1) อย่างไรก็ตาม เมื่อข้อมูลลำดับเฉพาะP. acidilactici Bac3 ถูกเปรียบเทียบกับยีนโครงสร้าง bacteriocinจากการที่ไพรเมอร์ที่ไม่ได้รับ มีความแตกต่างชัดเจนภายในภูมิภาคพื้นภายในและผู้ที่เกี่ยวข้องกับ Bac3 (Fig. 1)3.3 การ PCR bacteriocin พื้นเรย์ระบุยีน bacteriocin ต่าง ๆ 3ในสายพันธุ์เดียวกันมีบัค + แยกจากดินหมู (ไส้กรอก) ระบุเป็นแลคโตบาซิลลัส sakei (ต้องใช้ JD) โดยรหัส API PCR bacteriocinวิเคราะห์แถวพื้นปอนด์ sakei JD ส่งผลให้พื้น PCR หลายชุดขยายอย่างมีระดับ วิเคราะห์ระบุแตกต่างกัน 3ลำดับ bacteriocin มีน้อย homology กันและค้นหาระเบิดของ GenBank แสดงให้เห็นว่า เราระบุสามแตกต่างกันยีนโครงสร้าง bacteriocin ในเดียวบัค + ต้องใช้ (Fig. 2)สองของ bacteriocins เหล่านี้ (Sakacin T และ Sakacin X) แสดงให้เห็นว่า homology สูงจะพบใน sakei ปอนด์ขณะ bacteriocin สาม bacteriocinsพบ homology หนึ่งผลิต โดย curvatus ปอนด์ (Curvacin A)แนวโน้มสำหรับหลายยีน bacteriocin ภายในบุคคลสายพันธุ์ยืนยันต้องลำดับ amplimers ประสบความสำเร็จทั้งหมดรับกับชุดไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน เรายังทำอย่างนี้กับ 2 บัค +สายพันธุ์ผักและ Lactococcus lactis แยกต่างหาก fromraw หมู (RP1)(FS97) ในทั้งสองกรณี เราอีกระบุ bacteriocin สามยีนในแต่ละต้องใช้ที่ correlated จะมีสองส่วน ltnA/ltnBbacteriocin และ thatwas bacteriocin lcnB เพิ่มเติมที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ใน Lc. Lactis (Garneau et al., 2002; van Belkum et al., 1992)(Fig. 3) FS97 lc Lactis ไม่น่าสนใจเนื่องจากมันเป็นเฉพาะในความสามารถในการยับยั้งสายพันธุ์ L. monocytogenes ซึ่งดำเนิน bacteriocinต้านทานรูปแบบต่าง ๆ 2 การดำเนินการ และถูกจัดประเภทเป็น bacteriocin ของ 3 การโร้ดโหมดของการดำเนินการ (Macwana และMuriana, 2011)3.4 การ PCR bacteriocin พื้นเรย์ระบุยีน bacteriocin ของ bacteriocin เป็นที่มีเทอร์มินัสบล็อก N และลำดับที่ไม่สามารถกำหนด โดยการลดประสิทธิภาพของ Edmanยังประสบความสำเร็จในการระบุแถวพื้น bacteriocin ได้ลำดับยีนโครงสร้าง bacteriocin ใน Lc. lactis FS92, bacteriocinogenic เป็นต้องใช้ที่เราไม่สามารถกำหนดลำดับของกรดอะมิโนใช้ bacteriocin บริสุทธิ์ สันนิษฐานว่าเนื่องจากเป็น N-บล็อกเทอร์มินัสที่ป้องกันไม่ให้กรดอะมิโนลำดับ โดยย่อยสลาย Edman(เหมาและ al., 2001) ขยายของ bacteriocin lacticin FS92กับไพรเมอร์จาก lacA ยีน Lc. lactis ผลในตัวของลำดับยีนโครงสร้างร่วม homology 92% โดยที่ในFS92 (Fig. 4)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.1 การวิเคราะห์ PCR ของ LAB bacteriocinogenic โดยใช้วิธี PCR ไพร bacteriocin
อาร์เรย์
เราตรวจสอบ LAB bacteriocinogenic แยกจากอาหารค้าปลีก
(ตารางที่ 1; Garver และ Muriana 1993; Macwana และ Muriana, 2012) โดย
อาร์เรย์ไพร PCR ออกแบบมาเพื่อรองรับโครงสร้างต่างๆ bacteriocin
ยีน informationwas ลำดับ forwhich ใช้ได้ (ตารางที่ 2) เรา
ได้รับการขยายประสบความสำเร็จของลำดับดีเอ็นเอและโปรตีนที่เกี่ยวข้อง
กับ 1-6 ชุดไพรเมอร์ที่มีทุก Bac + สายพันธุ์ LAB ที่เราตรวจสอบ
ด้วยวิธี PCR ของเราด้วยไพรเมอร์แบค (มะเดื่อ. 1, 2 และ 4) ละลายดีเอ็นเอ
เส้นโค้งและการวิเคราะห์เจล agarose ช่วย identifywhether ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์
เหมือนกัน; ถ้าไม่ weopted ส่งกำหนดลำดับดีเอ็นเอ themfor
ที่สถานที่หลักของเราตามด้วยการวิเคราะห์ลำดับ.
3.2 PCR อาร์เรย์ไพร bacteriocin ขยายลำดับ bacteriocin เดียวกัน
กับคู่ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน
การขยายของกรดนิวคลีอิกสกัดจาก P. acidilactici Bac3 occurredwithwith
4 ชุดไพรเมอร์ได้รับการออกแบบที่แตกต่างกัน from4 bacteriocin
ยีนโครงสร้าง (รูปที่ 1.) PAPA (Pediococcus pentosaceous) pedB (Pediococcus
acidilactici ) plnA (Lactobacillus plantarum) และ sakX (Lactobacillus
sakei) เมื่อ amplimers สร้างโดย primerpairs ที่แตกต่างกันเหล่านี้
มีลำดับขั้นตอนและวิเคราะห์โดยลำดับการจัดเรียงหลาย
ลำดับของภูมิภาคภายในไพรเมอร์สร้างขึ้นด้วย P. acidilactici
Bac3 เป็นแม่แบบโดยใช้คู่ไพรเมอร์จาก bacteriocins ที่แตกต่างกันได้
เหมือนกัน (รูปที่ 1). แต่เมื่อข้อมูลลำดับที่เฉพาะเจาะจงเพื่อ
P. acidilactici Bac3 เมื่อเทียบกับยีนโครงสร้าง bacteriocin
ที่ไพรเมอร์ที่ได้มามีความแตกต่างที่เห็นได้ชัด
ภายในภูมิภาคภายในไพรเมอร์และผู้ที่เกี่ยวข้องกับการ Bac3 (รูปที่ 1)..
3.3 PCR อาร์เรย์ไพร bacteriocin ระบุ 3 ยีน bacteriocin ที่แตกต่างกัน
ในสายพันธุ์เดียวกัน
Bac + แยกจากหมูสับ (ไส้กรอก) ถูกระบุว่าเป็น
Lactobacillus sakei (สายพันธุ์ JD) โดยระบุ API PCR bacteriocin
วิเคราะห์อาเรย์ของไพรเมอร์ Lb. sakei JD ผลไพร PCR หลาย
ชุดการแสดงการขยาย การวิเคราะห์ลำดับระบุแตกต่างกัน 3
ลำดับแบคที่มีความคล้ายคลึงกันเล็ก ๆ น้อย ๆ ให้กับแต่ละอื่น ๆ และ
ค้นหาระเบิดของ GenBank พบว่าเราระบุแตกต่างกันสาม
bacteriocin ยีนโครงสร้างภายในสายพันธุ์ Bac + เดียว (รูปที่ 2)..
สองคนนี้ bacteriocins (Sakacin T และ Sakacin X ) แสดงให้เห็นว่าที่คล้ายคลึงกันสูง
ถึง bacteriocins พบใน Lb. sakei ขณะที่สาม bacteriocin
แสดงให้เห็นคล้ายคลึงกันกับที่ผลิตโดย Lb. curvatus (Curvacin).
โอกาสสำหรับยีน bacteriocin หลายภายในแต่ละ
สายพันธุ์ได้รับการยืนยันความจำเป็นในการจัดลำดับทั้งหมด amplimers ที่ประสบความสำเร็จ
ที่ได้รับกับชุดไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน นอกจากนี้เรายังทำอย่างนี้มี 2 Bac +
สายพันธุ์ของ Lactococcus lactis หมู fromraw แยก (RP1) และผัก
(FS97) ในทั้งสองกรณีเราอีกครั้งระบุสาม bacteriocin
ยีนในแต่ละสายพันธุ์ที่มีความสัมพันธ์กับ ltnA สององค์ประกอบ / ltnB
bacteriocin และเพิ่มเติม LCNB bacteriocin thatwas ระบุก่อนหน้านี้
ใน Lc lactis (Garneau et al, 2002;.. รถตู้ Belkum, et al, 1992)
. (รูปที่ 3) lc lactis FS97 เป็นที่น่าสนใจเพราะมันเป็นเอกลักษณ์ใน
ความสามารถในการยับยั้ง L. monocytogenes สายพันธุ์ที่ได้รับ bacteriocin
ความต้านทานต่อ 2 โหมดที่แตกต่างกันของการกระทำและถูกแบ่ง
เป็น bacteriocin ที่อยู่ในประเภทที่ 3 โหมดของการดำเนินการ (Macwana และ
Muriana 2011) .
3.4 PCR bacteriocin อาร์เรย์ไพรระบุยีน bacteriocin ของแบค
ที่มีปลายทาง N-บล็อกและมีลำดับไม่สามารถ
กำหนดโดยการย่อยสลาย Edman
อาร์เรย์ไพรเมอร์แบคก็ประสบความสำเร็จในการระบุ
ยีนโครงสร้างโปรตีนใน Lc lactis FS92, bacteriocinogenic
สายพันธุ์ที่เราไม่สามารถที่จะตรวจสอบลำดับกรดอะมิโนที่
ใช้แบคบริสุทธิ์สันนิษฐานว่าเนื่องจาก N-บล็อก
ปลายทางที่จะป้องกันไม่ลำดับกรดอะมิโนโดยการย่อยสลาย Edman
(เหมา et al., 2001) การขยายของ lacticin FS92 bacteriocin
กับไพรจากยีน Laca ของ Lc lactis ผลในตัวตน
ของยีนโครงสร้างการแบ่งปันที่คล้ายคลึงกัน 92% กับที่ใน
FS92 (รูปที่ 4).

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.1 . เทคนิคการวิเคราะห์ bacteriocinogenic แล็บโดยใช้ PCR ไพรเมอร์เรย์

ต่อเราตรวจสอบ bacteriocinogenic Lab ที่แยกได้จากอาหารขายปลีก
( ตารางที่ 1 และ การ์เวอร์ muriana , 1993 ; macwana และ muriana 2012 ) โดย : PCR ไพรเมอร์เรย์ที่ออกแบบมาเพื่อรองรับต่าง ๆต่อลำดับยีนโครงสร้าง
ราย informationwas ใช้ได้ ( ตารางที่ 2 ) เรา
ได้รับความสำเร็จแบบต่อเกี่ยวเนื่องลำดับดีเอ็นเอ
1 ถึง 6 สีชุดกับทุกสายพันธุ์ที่เราตรวจสอบบั๊กแล็บ
ด้วย PCR ไพรเมอร์เรย์ ( ต่อลูกมะเดื่อ . 1 , 2 และ 4 ) ดีเอ็นเอเจลละลาย
โค้งและการวิเคราะห์ , ช่วย identifywhether PCR ผลิตภัณฑ์
ได้เหมือนกัน แต่ถ้าไม่ weopted ส่ง themfor การหาลำดับดีเอ็นเอ
ที่โรงงานหลักของเราตามด้วยการวิเคราะห์ลำดับ .
2 . PCR ไพรเมอร์เรย์ต่อขยายกันต่อด้วยไพรเมอร์คู่

ลำดับต่าง ๆเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก สารสกัดจาก P . acidilactici bac3 occurredwithwith
4 ชุดไพรเมอร์ที่ออกแบบมา from4 แตกต่างกันต่อ
โครงสร้างยีน ( รูปที่ 1 ) : ป๊า ( 3 pentosaceous ) pedb ( 3
acidilactici )plna ( Lactobacillus plantarum ) และ sakx ( Lactobacillus
sakei ) เมื่อ amplimers สร้างโดยเหล่านี้แตกต่างกัน primerpairs
เป็นลำดับ และวิเคราะห์จากหลายลำดับการจัดแนว
ลำดับภายในภูมิภาคที่สร้างขึ้นด้วย P . acidilactici
รองพื้น bac3 เป็นแม่แบบการใช้ไพรเมอร์คู่จากวัตถุดิบต่างๆ
เหมือนกัน ( รูปที่ 1 ) อย่างไรก็ตาม เมื่อลำดับข้อมูลเฉพาะ
Pbac3 acidilactici เปรียบเทียบกับยีนโครงสร้างแบคทีริโอซิน
ซึ่งไพรเมอร์ที่ได้มา มีความแตกต่างที่เห็นได้ชัด
ภายในภายในภูมิภาค และผู้ที่เกี่ยวข้องกับ bac3 รองพื้น ( รูปที่ 1 )
3 . PCR ไพรเมอร์เรย์ต่อระบุ 3 ยีนในสายพันธุ์เดียวกันแตกต่างกันต่อ

มีบัคแยกจากหมูสับ ( ไส้กรอก ) ที่ถูกระบุว่าเป็น
แลคโตบาซิลัส sakei ( เจดีสายพันธุ์ ) โดยรหัส API PCR ไพรเมอร์เรย์การวิเคราะห์ปอนด์ต่อ
sakei เจดี ( PCR ไพรเมอร์หลายชุด (
9 . การวิเคราะห์ลำดับการระบุที่แตกต่างกัน 3
ต่อลำดับที่ตัวน้อยกับแต่ละอื่น ๆและพบว่า การพบระเบิด
3
เราระบุต่อโครงสร้างยีนในสายพันธุ์เดียว BAC ( รูปที่ 2 )
2 ของวัตถุดิบเหล่านี้ ( sakacin T และ sakacin X ) พบ
ตัวสูงวัตถุดิบที่พบในปอนด์ sakei ในขณะที่
ต่อที่สามพบตัวหนึ่งที่ผลิตโดยปอนด์ curvatus ( เคอวาซิน ) .
โอกาสที่ยีนต่อหลายสายพันธุ์
ภายในบุคคล ยืนยันต้องลำดับความ amplimers
ทั้งหมดได้รับชุดไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน เราก็ทำแบบนี้กับ 2 บัค
สายพันธุ์แลคโตค คัส lactis แยก fromraw หมู ( rp1 ) และผัก
( fs97 ) ในทั้งสองกรณี เราระบุต่ออีก 3
ยีนในแต่ละสายพันธุ์นั้น มีความสัมพันธ์กับแบบ ltna / ltnb
ต่อต่อเป็น lcnb เพิ่มเติมและระบุก่อนหน้านี้
ใน LC . lactis ( garneau et al . , 2002 ; รถตู้ belkum et al . ,1992 )
( รูปที่ 3 ) LC . fs97 lactis เป็นที่น่าสนใจเพราะมันคือเอกลักษณ์
สามารถยับยั้ง L . monocytogenes สายพันธุ์ที่ได้รับการต้านทานต่อ
2 โหมดที่แตกต่างกันของการกระทำและแบ่ง
เป็นแบคทีริโอซินเป็นของ 3 โหมดของการกระทำ ( macwana และ
muriana , 2011 ) .
3.4 . PCR ไพรเมอร์เรย์ระบุต่อต่อต่อ
ยีนของมี n-blocked เทอร์มินัสซึ่งไม่สามารถกำหนดลำดับ

ต่องูหัวกระโหลก ไพรเมอร์เรย์ ยังประสบความสำเร็จในการระบุยีนโครงสร้าง
ต่อลำดับใน LC . fs92 lactis , bacteriocinogenic
สายพันธุ์ที่เราไม่สามารถกำหนดลำดับกรดอะมิโน
ใช้แบคทีริโอซินบริสุทธิ์ สันนิษฐานว่า เกิดจาก n-blocked
ปลายทางที่ทำให้ลำดับกรดอะมิโนโดยงูหัวกระโหลก
( เหมา et al . , 2001 ) การเพิ่มปริมาณของแลคติซิน fs92 แบคทีริโอซิน
กับไพรเมอร์จาก laca ยีนของ LC . lactis ส่งผลให้เกิดอัตลักษณ์
ของยีนโครงสร้างลำดับแบ่งปัน 92% ซึ่งตาม
fs92 ( ภาพที่ 4 ) .