AbstractThe mechanism whereby RNA i

Abstract
The mechanism whereby RNA is translocated by the
single subunit viral RNA-dependent RNA polymerases
is not yet understood. These enzymes lack homologs
of the “O-helix” structures and associated fingers
domain movements thought to be responsible for
translocation in many DNA-templated polymerases.
The structures of multiple picornavirus polymerase
elongation complexes suggest that these enzymes use
a different molecular mechanism where translocation is
not strongly coupled to the opening of the active site
following catalysis. Here we present the 2.0- to
2.6-Å-resolution crystal structures and biochemical
data for 12 poliovirus polymerase mutants that together
show how proper enzyme functions and translocation
activity requires conformational flexibility of a loop
sequence in the palm domain B-motif. Within the loop,
the Ser288-Gly289-Cys290 sequence is shown to play
a major role in the catalytic cycle based on RNA
binding, processive elongation activity, and single
nucleotide incorporation assays. The structures show
that Ser288 forms a key hydrogen bond with Asp238,
the backbone flexibility of Gly289 is required for
translocation competency, and Cys290 modulates the
overall elongation activity of the enzyme. Some
conformations of the loop represent likely intermediates
on the way to forming the catalytically competent
closed active site, while others are consistent with a role
in promoting translocation of the nascent base pair out
of the active site. The loop structure and key residues
surrounding it are highly conserved, suggesting that the
structural dynamics we observe in poliovirus 3Dpol are
a common feature of viral RNA-dependent RNA
polymerases.Abstract
The mechanism whereby RNA is translocated by the
single subunit viral RNA-dependent RNA polymerases
is not yet understood. These enzymes lack homologs
of the “O-helix” structures and associated fingers
domain movements thought to be responsible for
translocation in many DNA-templated polymerases.
The structures of multiple picornavirus polymerase
elongation complexes suggest that these enzymes use
a different molecular mechanism where translocation is
not strongly coupled to the opening of the active site
following catalysis. Here we present the 2.0- to
2.6-Å-resolution crystal structures and biochemical
data for 12 poliovirus polymerase mutants that together
show how proper enzyme functions and translocation
activity requires conformational flexibility of a loop
sequence in the palm domain B-motif. Within the loop,
the Ser288-Gly289-Cys290 sequence is shown to play
a major role in the catalytic cycle based on RNA
binding, processive elongation activity, and single
nucleotide incorporation assays. The structures show
that Ser288 forms a key hydrogen bond with Asp238,
the backbone flexibility of Gly289 is required for
translocation competency, and Cys290 modulates the
overall elongation activity of the enzyme. Some
conformations of the loop represent likely intermediates
on the way to forming the catalytically competent
closed active site, while others are consistent with a role
in promoting translocation of the nascent base pair out
of the active site. The loop structure and key residues
surrounding it are highly conserved, suggesting that the
structural dynamics we observe in poliovirus 3Dpol are
a common feature of viral RNA-dependent RNA
polymerases.


Introduction
The incorporation of nucleotides onto a nucleic
acid chain by polymerase enzymes is a complex
process requiring more than a simple phosphoryl
transfer reaction. Kinetic and thermodynamic studies
of polymerases from a wide range of species reveal a
common mechanism that is broadly composed of five
steps: initial NTP selection by binding in or near the
active site, a conformational change to position the
NTP for catalysis, closure of the active site for the
phosphodiester bond formation step, a re-opening of
the active site, and finally translocation of the nucleic
acid to reset the enzyme for the next catalytic cycle.
The latter two steps are often coupled both thermodynamically
and structurally, with pyrophosphate
release often being thought to be a trigger point for
the conformational changes that drive translocation
[1,2].

Among DNA-templated polymerases, these steps
are well illustrated by structures of the bacteriophage
T7 DNA-dependent RNA polymerase (T7 RNAP)
[1,3–5] and the Thermus aquaticus DNA-dependent
DNA polymerase (Taq) [6] that have been captured at
various stages of the catalytic cycle. These structures
show initial NTP binding in the pre-insertion site that is
followed by a 20° to 25° rotation of the fingers domain
B′-motif “O-helix” that serves to reposition the nucleotide
over the active-site RRM motif for catalysis [4]. In
the process, a conserved tyrosine residue from the
O-helix (Y639 in T7 RNAP and Y671 in Taq) becomes
stacked on the newly formed base pair. This direct
contact is then thought to mediate translocation via the
tyrosine pushing the nascent base pair out of the active
site when the O-helix reverses its movement and the
fingers domain returns to the open conformation after
catalysis.

Less is known about the structural transitions that
take place within RNA-templated polymerases
during the catalytic cycle. This group of polymerases
includes telomerases, reverse transcriptases,
and the viral RNA-dependent RNA (RdRP) family of
small single subunit polymerases. The RdRPs
retain the common polymerase catalytic mechanism
and active-site geometry, but sequence and
structure comparisons show that they utilize different
molecular movements for active-site closure
and translocation. Viral RdRP structures show
conservation of an encircled active-site topology
[7] where a direct contact between the fingers and
thumb domain precludes the swinging movement of
the fingers domain that is associated with activesite
closure in other polymerases. Consistent with
this, structures of the poliovirus polymerase elongation
complex (EC) trapped at various points
during the catalytic cycle show that the viral
RdRPs close their active sites via a unique
structural transition in the palm domain [8]. The
RdRPs also differ from other polymerases in that

they do not contain the B′-motif helix located above
the active site and are thus missing the conserved
tyrosine residue that mediates translocation in the
DNA-templated enzymes. Interestingly, the poliovirus
polymerase EC structures also showed that
the enzyme can re-open the active site after
catalysis without translocation [8], resulting in a
unique structural state that has not been captured in
other polymerases where these two events appear
to be tightly coupled. A comparison of several viral
RdRP structures have shown that a loop within the
B-motif exhibits significant structural variability, and
this may expose a novel target site for the
development of antiviral polymerase inhibitors [9].
Based on its flexibility and proximity to the template
RNA strand, this loop is also postulated to play an
important role in modulating polymerase activity,
perhaps through effects on translocation, but direct
evidence of this has not yet been obtained.
In the course of investigating low ionic strength
conditions for maintaining 3Dpol crystals grown
without RNA, we discovered electron density
evidence for an alternate conformation of this
short loop that connects the base of the middle
finger to the major α-helix of the B-motif in the palm
domain (Fig. 1A). Composed of residues 288–292,
the loop is in direct proximity to the active site of the
polymerase and lies immediately adjacent
to the templating RNA strand in the poliovirus
3Dpol–RNA EC. This loop is highly conserved as
part of the RdRP B-motif that differs structurally
from the B′-motif of the DNA-templated polymerases,
and we hypothesized that the loop movement
could play a role in mediating RNA translocation
following catalysis. To address this, we generated a
set of 12 mutations in the loop itself that would
modulate the interactions it was making with the
rest of the polymerase, and here we report the
structural and biochemical analyses of these
mutants. Our crystal structures indicate that the
loop can exist in two stable conformations, and
biochemical data show that restricting the interconversion
between these conformations affects RNA
binding and overall polymerase activity, with some
mutations resulting in translocation-deficient
polymerases.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทคัดย่อกลไกโดยอาร์เอ็นเอเป็น translocated โดยpolymerases ขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอไวรัสย่อยเดียวไม่เป็นยังที่เข้าใจ เอนไซม์เหล่านี้ขาด homologsโครงสร้าง "O-เกลียว" และร่วมมือย้ายโดเมนคิดจะรับผิดชอบการสับเปลี่ยนใน DNA templated polymerases มากโครงสร้างของพอลิเมอเรส picornavirus หลายelongation สิ่งอำนวยความสะดวกแนะนำให้ ใช้เอนไซม์เหล่านี้กลไกระดับโมเลกุลแตกต่างกันซึ่งเป็นการสับเปลี่ยนไม่ขอควบคู่กับการเปิดใช้เร่งปฏิกิริยาต่อไปนี้ ที่นี่เราแสดง 2.0-การโครงสร้างผลึกละเอียดÅ 2.6 และชีวเคมีข้อมูล 12 poliovirus พอลิเมอเรสสายพันธุ์ด้วยกันที่แสดงหน้าที่เอนไซม์และการสับเปลี่ยนวิธีเหมาะสมกิจกรรมต้องการความยืดหยุ่น conformational ของวนลำดับในโดเมนปาล์ม B แปลน ภายในลูปลำดับที่ Ser288-Gly289-Cys290 จะแสดงการเล่นบทบาทสำคัญในวงจรของตัวเร่งปฏิกิริยาการยึดอาร์เอ็นเอผูก processive elongation กิจกรรม และเดี่ยวนิวคลีโอไทด์ประสาน assays งานโครงสร้างSer288 ที่สร้างพันธะไฮโดรเจนกับคีย์กับ Asp238ความยืดหยุ่นของ Gly289 แกนหลักที่จะต้องการสับเปลี่ยนขีดความสามารถ และ Cys290 modulateselongation รวมกิจกรรมของเอนไซม์นี้ บางconformations วนหมายถึงตัวกลางที่มีแนวโน้มในทางที่จะสร้างอำนาจ catalyticallyปิดใช้งานไซต์ ในขณะที่คนอื่น ๆ สอดคล้องกับบทบาทในการส่งเสริมการสับเปลี่ยนคู่ฐานก่อออกของไซต์ใช้งานอยู่ ตกค้างคีย์และโครงสร้างการวนซ้ำรอบมันจะสูงอยู่ แนะนำที่เราสังเกตใน poliovirus 3Dpol dynamics โครงสร้างมีคุณลักษณะทั่วไปของไวรัสขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอpolymerasesบทคัดย่อกลไกโดยอาร์เอ็นเอเป็น translocated โดยpolymerases ขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอไวรัสย่อยเดียวไม่เป็นยังที่เข้าใจ เอนไซม์เหล่านี้ขาด homologsโครงสร้าง "O-เกลียว" และร่วมมือย้ายโดเมนคิดจะรับผิดชอบการสับเปลี่ยนใน DNA templated polymerases มากโครงสร้างของพอลิเมอเรส picornavirus หลายelongation สิ่งอำนวยความสะดวกแนะนำให้ ใช้เอนไซม์เหล่านี้กลไกระดับโมเลกุลแตกต่างกันซึ่งเป็นการสับเปลี่ยนไม่ขอควบคู่กับการเปิดใช้เร่งปฏิกิริยาต่อไปนี้ ที่นี่เราแสดง 2.0-การโครงสร้างผลึกละเอียดÅ 2.6 และชีวเคมีข้อมูล 12 poliovirus พอลิเมอเรสสายพันธุ์ด้วยกันที่แสดงหน้าที่เอนไซม์และการสับเปลี่ยนวิธีเหมาะสมกิจกรรมต้องการความยืดหยุ่น conformational ของวนลำดับในโดเมนปาล์ม B แปลน ภายในลูปลำดับที่ Ser288-Gly289-Cys290 จะแสดงการเล่นบทบาทสำคัญในวงจรของตัวเร่งปฏิกิริยาการยึดอาร์เอ็นเอผูก processive elongation กิจกรรม และเดี่ยวนิวคลีโอไทด์ประสาน assays งานโครงสร้างSer288 ที่สร้างพันธะไฮโดรเจนกับคีย์กับ Asp238ความยืดหยุ่นของ Gly289 แกนหลักที่จะต้องการสับเปลี่ยนขีดความสามารถ และ Cys290 modulateselongation รวมกิจกรรมของเอนไซม์นี้ บางconformations วนหมายถึงตัวกลางที่มีแนวโน้มในทางที่จะสร้างอำนาจ catalyticallyปิดใช้งานไซต์ ในขณะที่คนอื่น ๆ สอดคล้องกับบทบาทในการส่งเสริมการสับเปลี่ยนคู่ฐานก่อออกของไซต์ใช้งานอยู่ ตกค้างคีย์และโครงสร้างการวนซ้ำรอบมันจะสูงอยู่ แนะนำที่เราสังเกตใน poliovirus 3Dpol dynamics โครงสร้างมีคุณลักษณะทั่วไปของไวรัสขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอpolymerasesแนะนำจดทะเบียนของนิวคลีโอไทด์ไปเป็น nucleicโซ่กรด โดยเอนไซม์พอลิเมอเรสจะซับซ้อนกระบวนการต้องมากกว่า phosphoryl ง่ายโอนย้ายปฏิกิริยา การศึกษาเดิม ๆ และขอบของ polymerases จากหลากหลายชนิดเหมาะกับการกลไกทั่วไปทั่วไปประกอบด้วย 5ขั้นตอน: การเริ่มต้นเลือก NTP โดยรวมใน หรือใกล้ใช้ เปลี่ยนแปลง conformational ในตำแหน่งNTP สำหรับเร่งปฏิกิริยา ปิดของไซต์ใช้งานอยู่ขั้นก่อพันธะ phosphodiester ตัวใหม่เปิดการใช้ และสุดท้ายการสับเปลี่ยนของที่ nucleicกรดการรีเซ็ตเอนไซม์สำหรับรอบถัดไปตัวเร่งปฏิกิริยาขั้นตอนที่สองหลังมักควบคู่ทั้งสอง thermodynamicallyและ structurally, pyrophosphateปล่อยมักจะกำลังคิดว่า จะ เป็นจุดทริกเกอร์การสับเปลี่ยนไดรฟ์ที่เปลี่ยนที่ conformational[1, 2]ระหว่างดีเอ็นเอ templated polymerases ขั้นตอนเหล่านี้ดีดังรายละเอียดตามโครงสร้างของการแบคทีT7 ขึ้นอยู่กับดีเอ็นเออาร์เอ็นเอพอลิเมอเรส (T7 RNAP)[1,3-5] และ aquaticus Thermus ขึ้นอยู่กับดีเอ็นเอดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Taq) [6] ที่ได้ที่ขั้นตอนต่าง ๆ ของวงจรตัวเร่งปฏิกิริยา โครงสร้างเหล่านี้แสดงเริ่มต้นผูก NTP ในไซต์แทรกก่อนที่ตาม 20° 25 องศาหมุนของโดเมนที่นิ้วมือB′-แปลน "O-เกลียว" รองรับการจัดตำแหน่งนิวคลีโอไทด์กว่าแปลน RRM ใช้งานไซต์สำหรับเร่งปฏิกิริยา [4] ในกระบวนการ tyrosine นำตกค้างจากการO เกลียว (Y639 ใน T7 RNAP) และ Y671 ใน Taqซ้อนบนฐานคู่รูปแบบใหม่ ตรงนี้เป็นความคิดติดต่อบรรเทาการสับเปลี่ยนผ่านแล้วtyrosine ผลักดันคู่ฐานก่อจากการใช้งานไซต์เมื่อ O-เกลียวกลับการเคลื่อนย้ายและโดเมนนิ้วกลับไป conformation เปิดหลังเร่งปฏิกิริยาน้อยเป็นที่รู้จักกันเกี่ยวกับโครงสร้างการเปลี่ยนแปลงที่ทำภายในอาร์เอ็นเอ templated polymerasesในระหว่างวงจรการตัวเร่งปฏิกิริยา กลุ่มนี้ของ polymerasesรวม telomerases, transcriptases กลับและครอบครัวขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอ (RdRP) ไวรัสของpolymerases เล็กย่อยเดียวกัน RdRPsรักษากลไกการตัวเร่งปฏิกิริยาพอลิเมอเรสที่ทั่วไปและใช้งานไซต์เรขาคณิต แต่ลำดับ และเปรียบเทียบโครงสร้างแสดงว่า พวกเขาใช้แตกต่างกันความเคลื่อนไหวของโมเลกุลการปิดการใช้งานเว็บไซต์และการสับเปลี่ยน ดูโครงสร้าง RdRP ไวรัสอนุรักษ์ของโทโพโลยีการใช้งานเว็บไซต์ encircled[7] ซึ่งติดต่อโดยตรงระหว่างมือ และนิ้วหัวแม่มือโดเมนไม่สามารถย้าย swingingโดเมนของนิ้วมือที่เกี่ยวข้องกับ activesiteปิดใน polymerases อื่น ๆ สอดคล้องกับนี้ โครงสร้างของ elongation พอลิเมอเรส poliovirusคอมเพล็กซ์ (EC) ติดอยู่ที่จุดต่าง ๆในระหว่างวงจรการตัวเร่งปฏิกิริยาแสดงว่าไวรัสRdRPs ปิดเว็บไซต์การใช้งานผ่านเฉพาะเปลี่ยนโครงสร้างในโดเมนปาล์ม [8] ที่RdRPs ยังแตกต่างจาก polymerases อื่น ๆ ในที่ไม่ประกอบด้วยเกลียว B′ แปลนเหนือใช้ และจึงขาดการนำสารตกค้าง tyrosine ที่ mediates การสับเปลี่ยนในการเอนไซม์ดีเอ็นเอ templated เป็นเรื่องน่าสนใจ poliovirusโครงสร้างพอลิเมอเรส EC ยังพบว่าเอนไซม์นี้สามารถเปิดใช้งานเว็บไซต์หลังจากอีกเร่งปฏิกิริยา โดยการสับเปลี่ยน [8], ในการรัฐโครงสร้างเฉพาะที่ไม่ได้รับการบันทึกในpolymerases อื่น ๆ ที่ปรากฏเหตุการณ์เหล่านี้สองให้ได้อย่างใกล้ชิดควบคู่กัน การเปรียบเทียบหลายชนิดไวรัสโครงสร้าง RdRP ได้แสดงที่วนอยู่ภายในความสำคัญโครงสร้างแปรผัน จัดแสดงแปลน B และนี้อาจทำให้ไซต์เป้าหมายนวนิยายสำหรับการการพัฒนายาต้านไวรัสพอลิเมอเรส inhibitors [9]ขึ้นอยู่กับความยืดหยุ่นและความใกล้ชิดกับต้นแบบของสแตรนด์อาร์เอ็นเอ วงนี้เป็น postulated ยังเล่นตัวบทบาทสำคัญในการเกี่ยวกิจกรรมพอลิเมอเรสบางทีผ่านผลการสับ เปลี่ยน แต่โดยตรงหลักฐานนี้ไม่ได้ได้รับการในหลักสูตรการตรวจสอบแรงต่ำ ionicเงื่อนไขสำหรับการรักษาผลึก 3Dpol โตโดยอาร์เอ็นเอ เราค้นพบความหนาแน่นของอิเล็กตรอนหลักฐานสำหรับ conformation ที่อื่นนี้วงสั้น ๆ ที่ฐานของกลางในการเชื่อมต่อนิ้วกับα-เกลียวหลักของแปลน B ในโดเมน (Fig. 1A) ประกอบตก 288-292ลูปเป็นในทางตรงไปใช้งานของการพอลิเมอเรสและอยู่ติดกันทันทีการ templating ใน อาร์เอ็นเอสแตรนใน poliovirus การEC. 3Dpol-อาร์เอ็นเอ วงนี้จะอยู่สูงเป็นส่วนของ RdRP B-สาระสำคัญที่แตกต่าง structurallyจากแปลน B′ ของ polymerases ดีเอ็นเอ templatedและเราตั้งสมมติฐานว่าที่เคลื่อนวนสามารถมีบทบาทในการเป็นสื่อกลางการสับเปลี่ยนอาร์เอ็นเอเร่งปฏิกิริยาต่อไปนี้ ที่อยู่นี้ เราสร้างความชุดของกลายพันธุ์ 12 ในวงตัวเองที่จะmodulate โต้ตอบมันถูกทำให้มีการวางตัวของพอลิเมอเรส และที่นี่เรารายงานการวิเคราะห์โครงสร้าง และชีวเคมีเหล่านี้สายพันธุ์ โครงสร้างผลึกของเราบ่งชี้ว่า การวนสามารถมีอยู่ในสอง conformations มั่นคง และข้อมูลชีวเคมีแสดงว่า interconversion ที่จำกัดระหว่าง conformations เหล่านี้มีผลต่ออาร์เอ็นเอผลผูกพัน และการรวมพอลิเมอเรส กับกิจกรรมบางอย่างในการสับเปลี่ยนไม่กลายพันธุ์polymerases

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บทคัดย่อ
กลไก RNA ถูก translocated โดย
subunit เดียวไวรัส RNA polymerases RNA ขึ้นอยู่กับ
ไม่เข้าใจเลย เอนไซม์เหล่านี้ขาด homologs
ของ "O-เกลียว" โครงสร้างและนิ้วมือที่เกี่ยวข้อง
การเคลื่อนไหวโดเมนคิดที่จะเป็นผู้รับผิดชอบในการ
โยกย้ายใน polymerases ดีเอ็นเอ templated หลาย.
โครงสร้างของหลาย picornavirus โพลิเมอร์
เชิงซ้อนยืดตัวชี้ให้เห็นว่าเอนไซม์เหล่านี้ใช้
กลไกในระดับโมเลกุลที่แตกต่างกันที่การโยกย้ายเป็น
ไม่ได้คู่กับการเปิดใช้งานเว็บไซต์
ต่อไปนี้การเร่งปฏิกิริยา ที่นี่เรานำเสนอไป 2.0
2.6-A-ความละเอียดโครงสร้างผลึกและชีวเคมี
ข้อมูลสำหรับ 12 กลายพันธุ์โพลิเมอร์โปลิโอที่ร่วมกัน
แสดงให้เห็นว่าฟังก์ชั่นการทำงานของเอนไซม์ที่เหมาะสมและการโยกย้าย
กิจกรรมต้องมีความยืดหยุ่นของโครงสร้างห่วง
ลำดับบรรทัดฐาน B-โดเมนปาล์ม ภายในวง
Ser288-Gly289-Cys290 ลำดับแสดงให้เห็นว่าการเล่น
บทบาทสำคัญในวงจรการเร่งปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเอ
ที่มีผลผูกพันและการจัดกิจกรรมการยืดตัว processive และซิงเกิ้ล
ชุดตรวจการรวมตัวกันเบื่อหน่าย โครงสร้างแสดง
ว่า Ser288 รูปแบบพันธะไฮโดรเจนสำคัญกับ Asp238,
ความยืดหยุ่นกระดูกสันหลังของ Gly289 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ
ความสามารถโยกย้ายและ Cys290 modulates
กิจกรรมการยืดตัวโดยรวมของการทำงานของเอนไซม์ บาง
conformations ของวงแทนตัวกลางที่มีแนวโน้ม
ในทางที่จะก่อให้เกิดอำนาจตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับ
ใช้งานเว็บไซต์ที่ปิดขณะที่คนอื่นมีความสอดคล้องกับบทบาท
ในการส่งเสริมการโยกย้ายของคู่ฐานที่พึ่งออก
ของเว็บไซต์ที่ใช้งานอยู่ โครงสร้างห่วงและสารตกค้างที่สำคัญ
โดยรอบก็มีการอนุรักษ์อย่างมากแสดงให้เห็นว่า
การเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างเราสังเกตในโปลิโอ 3Dpol เป็น
ลักษณะทั่วไปของไวรัส RNA ขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเอ
polymerases.Abstract
กลไก RNA ถูก translocated โดย
subunit เดียวไวรัส RNA RNA ขึ้นอยู่กับ polymerases
ไม่เข้าใจเลย เอนไซม์เหล่านี้ขาด homologs
ของ "O-เกลียว" โครงสร้างและนิ้วมือที่เกี่ยวข้อง
การเคลื่อนไหวโดเมนคิดที่จะเป็นผู้รับผิดชอบในการ
โยกย้ายใน polymerases ดีเอ็นเอ templated หลาย.
โครงสร้างของหลาย picornavirus โพลิเมอร์
เชิงซ้อนยืดตัวชี้ให้เห็นว่าเอนไซม์เหล่านี้ใช้
กลไกในระดับโมเลกุลที่แตกต่างกันที่การโยกย้ายเป็น
ไม่ได้คู่กับการเปิดใช้งานเว็บไซต์
ต่อไปนี้การเร่งปฏิกิริยา ที่นี่เรานำเสนอไป 2.0
2.6-A-ความละเอียดโครงสร้างผลึกและชีวเคมี
ข้อมูลสำหรับ 12 กลายพันธุ์โพลิเมอร์โปลิโอที่ร่วมกัน
แสดงให้เห็นว่าฟังก์ชั่นการทำงานของเอนไซม์ที่เหมาะสมและการโยกย้าย
กิจกรรมต้องมีความยืดหยุ่นของโครงสร้างห่วง
ลำดับบรรทัดฐาน B-โดเมนปาล์ม ภายในวง
Ser288-Gly289-Cys290 ลำดับแสดงให้เห็นว่าการเล่น
บทบาทสำคัญในวงจรการเร่งปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับอาร์เอ็นเอ
ที่มีผลผูกพันและการจัดกิจกรรมการยืดตัว processive และซิงเกิ้ล
ชุดตรวจการรวมตัวกันเบื่อหน่าย โครงสร้างแสดง
ว่า Ser288 รูปแบบพันธะไฮโดรเจนสำคัญกับ Asp238,
ความยืดหยุ่นกระดูกสันหลังของ Gly289 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ
ความสามารถโยกย้ายและ Cys290 modulates
กิจกรรมการยืดตัวโดยรวมของการทำงานของเอนไซม์ บาง
conformations ของวงแทนตัวกลางที่มีแนวโน้ม
ในทางที่จะก่อให้เกิดอำนาจตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับ
ใช้งานเว็บไซต์ที่ปิดขณะที่คนอื่นมีความสอดคล้องกับบทบาท
ในการส่งเสริมการโยกย้ายของคู่ฐานที่พึ่งออก
ของเว็บไซต์ที่ใช้งานอยู่ โครงสร้างห่วงและสารตกค้างที่สำคัญ
โดยรอบก็มีการอนุรักษ์อย่างมากแสดงให้เห็นว่า
การเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างเราสังเกตในโปลิโอ 3Dpol เป็น
ลักษณะทั่วไปของไวรัส RNA ขึ้นอยู่กับ RNA
polymerases. บทนำรวมตัวกันของนิวคลีโอนิวคลีอิกเข้าสู่ห่วงโซ่กรดโดยเอนไซม์โพลิเมอร์ที่มีความซับซ้อนกระบวนการที่ต้องใช้มากกว่า phosphoryl ง่ายปฏิกิริยาการถ่ายโอน การศึกษาและการเคลื่อนไหวทางอุณหพลศาสตร์ของ polymerases จากหลากหลายของสายพันธุ์ที่เผยให้เห็นกลไกที่ประกอบด้วยวงกว้างห้าขั้นตอนการเลือก NTP เริ่มต้นโดยมีผลผูกพันในหรือใกล้ใช้งานเว็บไซต์, การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในการวางตำแหน่งNTP สำหรับปฏิกิริยาทางเคมี, การปิดการใช้งาน เว็บไซต์สำหรับการphosphodiester พันธบัตรขั้นตอนการสร้างใหม่การเปิดใช้งานเว็บไซต์และในที่สุดก็โยกย้ายของนิวคลีอิกกรดเพื่อตั้งค่าการทำงานของเอนไซม์สำหรับรอบตัวเร่งปฏิกิริยาต่อไป. หลังขั้นตอนที่สองเป็นคู่มักจะทั้ง thermodynamically และโครงสร้างที่มี pyrophosphate ปล่อยมักจะ ถูกคิดว่าจะเป็นจุดสำหรับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ผลักดันการโยกย้าย[1,2]. ท่ามกลางดีเอ็นเอ templated polymerases ขั้นตอนเหล่านี้จะแสดงเป็นอย่างดีโดยโครงสร้างของ bacteriophage T7 ดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับโพลีเมออาร์เอ็นเอ (T7 RNAP) [1,3 -5] และ Thermus aquaticus ดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Taq) [6] ที่ได้รับการบันทึกในขั้นตอนต่างๆของวงจรการเร่งปฏิกิริยา โครงสร้างเหล่านี้แสดง NTP เริ่มต้นมีผลผูกพันในเว็บไซต์ก่อนการแทรกที่ตามมาด้วย 20 °ถึง 25 °การหมุนของโดเมนนิ้วB'-บรรทัดฐาน "O-เกลียว" ที่ทำหน้าที่ในการเปลี่ยนตำแหน่งเบื่อหน่ายกว่าการใช้งานเว็บไซต์บรรทัดฐาน RRM สำหรับ ปฏิกิริยา [4] ในกระบวนการที่ตกค้างซายน์อนุรักษ์จากO-เกลียว (Y639 ใน T7 RNAP และ Y671 ใน Taq) กลายเป็นซ้อนกันบนฐานคู่เพิ่งตั้งขึ้นใหม่ นี้โดยตรงติดต่อเป็นความคิดแล้วจะไกล่เกลี่ยโยกย้ายผ่านทางซายน์ผลักดันฐานคู่ที่พึ่งออกมาจากการใช้งานเว็บไซต์เมื่อ O-เกลียวกลับเคลื่อนไหวและผลตอบแทนโดเมนนิ้วโครงสร้างเปิดหลังจากปฏิกิริยา. หักเป็นที่รู้จักกันเกี่ยวกับการเปลี่ยนโครงสร้างที่เกิดขึ้นภายใน polymerases RNA-templated ในระหว่างรอบตัวเร่งปฏิกิริยา กลุ่มของ polymerases นี้รวมถึง telomerases ย้อนกลับ transcriptases, และอาร์เอ็นเอไวรัส RNA ขึ้นอยู่กับ (RdRP) ครอบครัวของsubunit เดียวขนาดเล็ก polymerases RdRPs รักษาโพลิเมอร์ที่พบกลไกการเร่งปฏิกิริยาและเรขาคณิตที่ใช้งานเว็บไซต์ แต่ลำดับและเปรียบเทียบโครงสร้างแสดงให้เห็นว่าพวกเขาใช้ที่แตกต่างกันการเคลื่อนไหวของโมเลกุลให้มีการปิดการใช้งานเว็บไซต์และการโยกย้าย โครงสร้างไวรัส RdRP แสดงการอนุรักษ์ล้อมรอบโครงสร้างที่ใช้งานเว็บไซต์[7] ที่ติดต่อโดยตรงระหว่างนิ้วมือและนิ้วหัวแม่มือโดเมนติ๊เคลื่อนไหวแกว่งของโดเมนนิ้วมือที่เกี่ยวข้องกับ activesite ปิดใน polymerases อื่น ๆ สอดคล้องกับนี้โครงสร้างของการยืดตัวโพลิเมอร์โปลิโอที่ซับซ้อน (EU) ที่ติดอยู่ตามจุดต่าง ๆในระหว่างรอบการเร่งปฏิกิริยาแสดงให้เห็นว่าไวรัสRdRPs ปิดเว็บไซต์ที่ใช้งานของพวกเขาผ่านที่ไม่ซ้ำกันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในโดเมนปาล์ม [8] RdRPs ยังแตกต่างจาก polymerases อื่น ๆ ในการที่พวกเขาไม่ได้มีส่วนที่เป็นเกลียว B'-บรรทัดฐานอยู่เหนือการใช้งานเว็บไซต์และจึงหายไปป่าสงวนตกค้างซายน์ที่ไกล่เกลี่ยโยกย้ายในเอนไซม์ดีเอ็นเอ templated ที่น่าสนใจโปลิโอโครงสร้างโพลิเมอร์อีซียังพบว่าเอนไซม์สามารถ re-เปิดใช้งานเว็บไซต์หลังจากการเร่งปฏิกิริยาโดยไม่ต้องโยกย้าย [8] ผลในรัฐที่มีโครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์ที่ไม่ได้รับการบันทึกในpolymerases อื่น ๆ ที่ทั้งสองเหตุการณ์ที่ปรากฏที่จะคู่แน่น . เปรียบเทียบหลายไวรัสโครงสร้าง RdRP แสดงให้เห็นว่าวงภายในB-บรรทัดฐานจัดแสดงนิทรรศการความแปรปรวนโครงสร้างอย่างมีนัยสำคัญและนี้อาจทำให้เว็บไซต์เป้าหมายใหม่สำหรับการพัฒนาของโพลิเมอร์สารยับยั้งไวรัส [9]. จากความยืดหยุ่นและความใกล้ชิดกับแม่แบบของมันสาระ RNA วงนี้คือการตั้งสมมติฐานยังเล่นบทบาทสำคัญในการปรับกิจกรรมโพลิเมอร์, บางทีอาจจะผ่านผลกระทบต่อการโยกย้าย แต่โดยตรงหลักฐานของเรื่องนี้ยังไม่ได้รับที่ได้รับ. ในหลักสูตรของการตรวจสอบความแข็งแรงของอิออนต่ำเงื่อนไขในการรักษาผลึก 3Dpol ที่ปลูกโดยไม่ต้อง อาร์เอ็นเอที่เราค้นพบความหนาแน่นของอิเล็กตรอนหลักฐานสำหรับโครงสร้างสลับนี้วงสั้น ๆ ที่เชื่อมต่อกับฐานของกลางนิ้วเพื่อสำคัญα-เกลียวของ B-บรรทัดฐานในฝ่ามือโดเมน (รูป. 1A) ประกอบด้วยสารตกค้าง 288-292, ห่วงอยู่ในบริเวณโดยตรงไปยังเว็บไซต์ที่ใช้งานของโพลิเมอร์และอยู่ติดกับสาระ RNA templating ในโปลิโอ3Dpol-RNA EC วงนี้เป็นป่าสงวนอย่างสูงในฐานะส่วนหนึ่งของ RdRP B-บรรทัดฐานที่แตกต่างโครงสร้างจาก B'-บรรทัดฐานของ polymerases ดีเอ็นเอ templated, และเราตั้งสมมติฐานว่าการเคลื่อนไหวของวงที่จะมีบทบาทในการโยกย้าย RNA mediating ปฏิกิริยาต่อไปนี้ เพื่อแก้ปัญหานี้เราสร้างชุดของ 12 กลายพันธุ์ในวงของตัวเองที่จะปรับปฏิสัมพันธ์มันก็ทำให้กับส่วนที่เหลือของโพลิเมอร์และที่นี่เรารายงานการวิเคราะห์โครงสร้างและทางชีวเคมีของเหล่ามนุษย์กลายพันธุ์ โครงสร้างผลึกของเราระบุว่าห่วงสามารถอยู่ในสอง conformations มั่นคงและข้อมูลทางชีวเคมีแสดงให้เห็นว่าการ จำกัด interconversion ระหว่าง conformations เหล่านี้ส่งผลกระทบต่อ RNA ผูกพันและกิจกรรมโพลิเมอร์โดยรวมกับบางการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในการโยกย้ายขาดpolymerases

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นามธรรม
กลไกโดย RNA จะ translocated โดยไวรัสอาร์เอ็นเอ ( RNA ชนิดเดียว

polymerases ยังไม่สามารถเข้าใจได้ เอนไซม์เหล่านี้ขาดโฮโมลอกส์
ของ " o-helix " โครงสร้างและการเคลื่อนไหวของนิ้วมือ
โดเมน คิดที่จะรับผิดชอบในการเคลื่อนย้ายในดีเอ็นเอ templated มากมาย

polymerases ที่เกี่ยวข้อง โครงสร้างของหลายวิธี
พิคอร์นาไวรัสสารประกอบเชิงซ้อนเอนไซม์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า การใช้กลไกระดับโมเลกุลที่แตกต่างกันที่พบ

ไม่ก็ขอคู่กับการเปิดใช้งานเว็บไซต์
ต่อไปนี้ปฏิกิริยา ที่นี่เรานำเสนอ 2.0 -
2.6 - • - ความละเอียดโครงสร้างผลึกและข้อมูลทางชีวเคมี
12 สายพันธุ์โดยโปลิโอไวรัสที่แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ที่เหมาะสมกัน

และโยกย้ายหน้าที่กิจกรรมต้องมีความยืดหยุ่นในห่วง
ลำดับในปาล์มเมน b-motif . ภายในห่วง
ser288-gly289-cys290 ลำดับแสดงเล่น
มีบทบาทสำคัญในวัฏจักรการใช้ RNA
ผูกพัน กิจกรรมการ processive และพยายามประสานนิวคลีโอไทด์เดียว

โครงสร้างแสดง
ที่ ser288 รูปแบบพันธบัตรไฮโดรเจน คีย์กับ asp238
,กระดูกสันหลังมีความยืดหยุ่นของ gly289 ที่จําเป็นสําหรับ
สมรรถโยกย้าย และ cys290 modulates
โดยรวมมีค่ากิจกรรมของเอนไซม์ โครงสร้างของลูปแสดงบาง

ตัวกลางอาจไปสร้าง
เชี่ยวชาญ catalytically ปิดแอคทีฟไซต์ ในขณะที่คนอื่นจะสอดคล้องกับบทบาทในการส่งเสริมการเคลื่อนย้ายของ nascent

ฐานคู่ของเว็บไซต์ที่ใช้งานอยู่ห่วงโครงสร้างและคีย์เร
รอบมันสูงเพื่อบอกว่า
พลศาสตร์โครงสร้างเราสังเกตในโปลิโอไวรัส 3dpol เป็นคุณลักษณะทั่วไปของไวรัส RNA
2

polymerases RNA โดยกลไก ซึ่งเป็น translocated RNA โดยไวรัสอาร์เอ็นเอ ( RNA ชนิดเดียว

polymerases ยังไม่สามารถเข้าใจได้ เอนไซม์เหล่านี้ขาดโฮโมลอกส์
ของ " o-helix " โครงสร้างและการเคลื่อนไหวของนิ้วมือ
โดเมน คิดที่จะรับผิดชอบในการเคลื่อนย้ายในดีเอ็นเอ templated มากมาย

polymerases ที่เกี่ยวข้อง โครงสร้างของสารประกอบเชิงซ้อนหลายพิคอร์นาไวรัสโดย
ยืดตัวแนะนำว่าเอนไซม์เหล่านี้ใช้กลไกระดับโมเลกุลที่แตกต่างกันที่พบ

ไม่ก็ขอคู่กับการเปิดใช้งานเว็บไซต์
ต่อไปนี้ปฏิกิริยาที่นี่เรานำเสนอ 2.0 -
2.6 - • - ความละเอียดโครงสร้างผลึกและข้อมูลทางชีวเคมี
12 สายพันธุ์โดยโปลิโอไวรัสด้วยกัน
แสดงว่าฟังก์ชันเอนไซม์ที่เหมาะสมและกิจกรรมโยกย้าย
ต้องมีความยืดหยุ่นในห่วง
ลำดับในปาล์มเมน b-motif . ภายในห่วง
ser288-gly289-cys290 ลำดับแสดงเล่น
มีบทบาทสำคัญในวัฏจักรการยึด
.รวมกิจกรรมการ processive และพยายามประสานนิวคลีโอไทด์เดียว

โครงสร้างแสดง
ที่ ser288 รูปแบบพันธบัตรไฮโดรเจน คีย์กับ asp238
กระดูกสันหลัง , ความยืดหยุ่นของ gly289 ที่จําเป็นสําหรับ
สมรรถโยกย้าย และ cys290 modulates
โดยรวมมีค่ากิจกรรมของเอนไซม์ โครงสร้างของลูปแสดงบาง

โอกาสของเราในทางที่จะสร้างความเชี่ยวชาญ catalytically
ปิดแอคทีฟไซต์ ในขณะที่คนอื่นจะสอดคล้องกับบทบาทในการส่งเสริมการเคลื่อนย้ายของ nascent

ฐานคู่ของเว็บไซต์ที่ใช้งานอยู่ ห่วงโครงสร้างและคีย์เร
รอบมันสูงเพื่อบอกว่า
พลศาสตร์โครงสร้างเราสังเกตในโปลิโอไวรัส 3dpol เป็นคุณลักษณะทั่วไปของไวรัส RNA
.
)


polymerases .บทนำ
การนิวคลีโอไทด์บนสายโซ่กรดนิวคลีอิก
โดยวิธีเอนไซม์มีความซับซ้อนกระบวนการที่ต้องการมากกว่า

โอนง่ายฟ ฟอริลปฏิกิริยา พลังงานจลน์และอุณหพลศาสตร์ของการศึกษา
polymerases จากหลากหลายชนิดเปิดเผย
กลไกทั่วไปที่กว้างประกอบด้วยห้าขั้นตอน : การเลือกเริ่มต้นโดย NTP

ผูกพันหรือใกล้ไซต์งาน ,การเปลี่ยนแปลงในตำแหน่ง
NTP เพื่อเร่งปิดเว็บไซต์ของงาน
ฟ โฟไดเ เตอร์การสร้างพันธะขั้นตอนอีกครั้งเปิด
เว็บไซต์ ปราดเปรียว และสุดท้าย การเคลื่อนย้ายของกรดนิวคลีอิก
ตั้งค่าเอนไซม์สำหรับรอบต่อไป catalytic .
หลังสองก้าว มักจะควบคู่ทั้ง thermodynamically
โครงสร้างกับไพโร
ปล่อยมักถูกคิดว่าเป็นจุดทริกเกอร์สำหรับการเคลื่อนย้ายไดรฟ์หนึ่ง

[ 1 , 2 ] .

ระหว่างดีเอ็นเอ templated polymerases เหล่านี้ขั้นตอน
ดีภาพประกอบ โดยโครงสร้างของแบคเทอริโอเฟจดีเอ็นเออาร์เอ็นเอพอลิเมอเรส ( 2
* * 3 * * 3 rnap )
[ 1 , 3 และ 5 ] และ thermus พรายน้ำขึ้น
ดีเอ็นเอดีเอ็นเอ เมอเรส ( แทค ) [ 6 ] ซึ่งได้รับการบันทึกในขั้นตอนต่างๆของวัฏจักร
เร่งปฏิกิริยาเหล่านี้โครงสร้าง
แสดงเริ่มต้น NTP ผูกพันในก่อนแทรกเว็บไซต์ที่
ตามด้วย 20 องศา 25 องศาการหมุนของนิ้วมือโดเมน
B School - โมทีฟ " o-helix " ที่ทำหน้าที่ในการตรวจสอบตำแหน่งนิวคลีโอไทด์
ผ่านแอคทีฟไซต์ RRM แม่ลายสำหรับการเร่งปฏิกิริยา [ 4 ] ใน
กระบวนการศึกษาแต่อย่างใด สารตกค้างจาก
o-helix ( y639 * * 3 และใน rnap y671 ในแท็ค ) กลายเป็น
ซ้อนกันในรูปแบบใหม่คู่เบสนี้โดยตรง
ติดต่อ คิดแล้วไกล่เกลี่ยโยกย้ายผ่าน
ซีนผลักตั้งไข่ฐานคู่ของเว็บไซต์ที่ใช้งาน o-helix
เมื่อย้อนกลับของการเคลื่อนไหวและ
นิ้วโดเมนส่งกลับไปยังโครงสร้างเปิดหลังจากเร่ง


น้อยเป็นที่รู้จักกันเกี่ยวกับการเปลี่ยนโครงสร้างนั้นเกิดขึ้นภายใน templated polymerases

ระหว่าง . วงจรเร่งปฏิกิริยา กลุ่มนี้ polymerases
รวม telomerases transcriptases , ย้อนกลับ , และไวรัสอาร์เอ็นเอ ( RNA

( rdrp ) ครอบครัวของใบเดี่ยวขนาดเล็ก polymerases . โดยทั่วไปการรักษา rdrps

ใช้กลไกเรขาคณิตและเว็บไซต์ที่ใช้งานอยู่ แต่ลำดับและ
เปรียบเทียบโครงสร้างแสดงให้เห็นว่าพวกเขาใช้การเคลื่อนไหวของโมเลกุลที่แตกต่างกันสำหรับการใช้งานเว็บไซต์ปิด

และโยกย้าย . โครงสร้าง rdrp ไวรัสแสดง
การอนุรักษ์การล้อมการใช้งานเว็บไซต์แบบ
[ 7 ] ซึ่งเป็นผู้ติดต่อโดยตรงระหว่างนิ้วโป้งและโดเมน precludes

นิ้วแกว่งการเคลื่อนไหวของโดเมนที่เกี่ยวข้องกับ activesite
ปิดในอื่น ๆ polymerases .
นี้สอดคล้องกับโครงสร้างของโปลิโอไวรัสการยืดตัว
ซับซ้อน ( EC ) ติดอยู่ที่จุดต่าง ๆในช่วงเร่งรอบ

แสดงว่า ไวรัสrdrps ปิดเว็บไซต์ที่ใช้งานของพวกเขาผ่านการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์
ในปาล์มโดเมน [ 8 ]
rdrps ก็แตกต่างจากอื่น ๆที่ polymerases

พวกเขาไม่ประกอบด้วย B School - แม่ลายเกลียวอยู่ข้างบน
เว็บไซต์การใช้งานและดังนั้นจึงขาดการอนุรักษ์
ซีนสารตกค้างที่ mediates โยกย้ายใน templated
ดีเอ็นเอเอนไซม์ น่าสนใจ , โปลิโอไวรัสโดย EC โครงสร้าง พบว่า

เอนไซม์สามารถ re เปิดเว็บไซต์ใช้งานหลังจากที่
เร่งโดยไม่โยกย้าย [ 8 ] ส่งผลให้โครงสร้างของรัฐ
เฉพาะไม่ได้ถูกจับใน
polymerases อื่น ๆ ที่เหตุการณ์ทั้งสองนี้ปรากฏ
จะให้คู่ การเปรียบเทียบโครงสร้าง rdrp ไวรัส
หลายได้แสดงให้เห็นว่าวงภายใน
b-motif จัดแสดงของโครงสร้างที่สำคัญและ
เว็บไซต์นี้อาจเปิดเผยเป้าหมายใหม่สำหรับการพัฒนาของไวรัสโดยตัวยับยั้ง [ 9 ] .
ขึ้นอยู่กับความยืดหยุ่นและอยู่ใกล้กับแม่แบบ
rna เกลียววงนี้ยังเป็นวิธีที่สำคัญในการเล่น

บางทีผ่านกิจกรรมของ polymerase ต่อการโยกย้าย แต่ตรง
หลักฐานนี้ได้ไม่ ยังได้รับ .
ในหลักสูตรของการตรวจสอบต่ำความแรงไอออน
เงื่อนไขเพื่อรักษา 3dpol ผลึกที่ปลูก
โดยไม่ต้องนี้เราค้นพบอิเล็กตรอนความหนาแน่น
หลักฐานสำหรับโครงสร้างอื่นนี้
สั้นห่วงที่เชื่อมต่อกับฐานตรงกลาง
นิ้วหลักเป็นเกลียวแอลฟาของ b-motif ในปาล์ม
โดเมน ( รูปที่ 1A ) ประกอบด้วยสารตกค้าง 288 ( 292
ห่วงคือในความใกล้ชิดโดยตรงไปยังเว็บไซต์ของการใช้งานและอยู่ติดกันทันที

ใช้ไป templating rna เกลียวในโปลิโอไวรัส
3dpol – RNA ของ EC วงนี้เป็นอย่างสูงที่สามารถเป็นส่วนหนึ่งของ rdrp

b-motif ที่แตกต่างโครงสร้างจากบี’ - แม่ลายของดีเอ็นเอ templated polymerases
, และเราตั้งสมมุติฐานว่าห่วงการเคลื่อนไหว
สามารถเล่นบทบาทในขณะเคลื่อนย้าย
.ต่อปฏิกิริยา ไปที่อยู่นี้เราสร้าง
ชุด 12 การกลายพันธุ์ในห่วงตัวเองที่จะ
การปฏิสัมพันธ์มันให้กับ
ที่เหลือใช้ มารายงาน
โครงสร้างและชีวเคมีวิเคราะห์ของสายพันธุ์เหล่านี้

โครงสร้างของผลึกของเราบ่งชี้ว่า สามารถอยู่ในอันดับสองห่วง

บุตร และข้อมูลทางชีวเคมีที่แสดงให้เห็นว่าการจำกัด interconversion
ระหว่างโครงสร้างเหล่านี้มีผลต่อ RNA
ผูกพันและกิจกรรมโดยรวมมีการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในการเคลื่อนย้ายขาด

polymerases .