2.6. Detection of sperm in spermath

2.6. Detection of sperm in spermathecae
Grasshopper females were anesthetized by cooling. The
spermatheca was removed and fixed overnight in 0.1 M PO4
buffer (pH 7.4), containing 4% paraformaldehyde at 4 8C. After
fixation, the spermatheca was embedded in gelatine albumine
followed by another overnight fixation in 4% paraformaldehyde in
0.1 M PO4 buffer (pH 7.4). Gelatine albumine blocks were briefly
rinsed with PO4 buffer and cut with a vibratome (LEICA, VT1000S)
into 50 mm thick sections. Those were rinsed with PO4 buffer
overnight. After blocking with 1% normal goat serum (Amersham
Biosciences), 0.5% bovine serum albumine (MP Biomedicals Inc.),
and 1% Triton X-100 (Sigma–Aldrich) in 0.1 M PO4 buffer for 3 h,
the first antibody directed against acetylated a-tubulin (Sigma, T-
6793, monoclonal, mouse) was applied 1:1000 in blocking buffer
for 72 h at 4 8C. After washing in PO4 buffer the secondary
antibody, Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (Invitrogen) was
applied 1:100 in blocking buffer for 3 h. Sections were rinsed with
PO4 buffer several times, transferred to a mixture of PO4 with
glycerol (1:1) and mounted on microscope slides. Immunofluorescence
was analysed with a confocal laser scan microscope (LEICA
TCS SP2). Maximal intensities of image stacks were extracted with
Leica Confocal Software Lite. Brightness and contrast of projections
were adjusted with Photoshop (Adobe). Sperm was identified after
the description of Winterton et al. (1999).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การตรวจอสุจิใน spermathecaeหญิงตั๊กแตนได้ด้วย โดยการทำความเย็น ที่spermatheca ถูกเอาออก และคงค้างคืนใน 0.1 M PO4บัฟเฟอร์ (pH 7.4), มี 4% paraformaldehyde ที่ 4 8C. หลังจากเบี spermatheca ถูกฝังใน gelatine albumineตาม ด้วยอีก 4% paraformaldehyde ในค้างคืนเบี0.1 M PO4 บัฟเฟอร์ (pH 7.4) บล็อก albumine gelatine ได้สั้น ๆrinsed ด้วยบัฟเฟอร์ PO4 และตัดกับ vibratome (ไล VT1000S)เป็นหลาย ๆ ส่วนหนา 50 มม. ผู้ถูก rinsed ด้วยบัฟเฟอร์ PO4นอน หลังจากบล็อกด้วยเซรั่มครีมปกติ 1% (Amershamเวลาออก), albumine ซีรั่มวัว 0.5% (MP Biomedicals Inc.),และ 1% ไตรตั้น X-100 (ซิก-Aldrich) ใน 0.1 M PO4 มีบัฟเฟอร์สำหรับ 3 hแอนติบอดีตัวแรกตรงกับ acetylated ได้-tubulin (ซิก T-6793 โมโน เมาส์) 1:1000 ใช้ในการบล็อคบัฟเฟอร์สำหรับ h 72 ที่ 4 8C. หลังจากการซักผ้าในบัฟเฟอร์ PO4 รองมีแอนติบอดี Alexa Fluor 488 เมาส์ป้องกันแพะ IgG (Invitrogen)1: 100 ใช้ในการบล็อคบัฟเฟอร์สำหรับส่วน 3 h. ถูก rinsed ด้วยบัฟเฟอร์ PO4 หลายครั้ง การโอนย้ายไปส่วนผสมของ PO4 ด้วยกลีเซอร (1:1) และกล้องจุลทรรศน์ที่ติดอยู่บนภาพนิ่ง Immunofluorescenceมี analysed ด้วยกล้องจุลทรรศน์ confocal เลเซอร์สแกน (ไลTCS SP2) ปลดปล่อยก๊าซสูงสุดของกองรูปถูกสกัดด้วยไลก้า Confocal ซอฟต์แวร์ Lite ความสว่างและความคมชัดของประมาณถูกปรับปรุง ด้วย Photoshop (Adobe) ระบุหลังจากอสุจิคำอธิบายของ Winterton et al. (1999)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การตรวจสอบของสเปิร์มใน spermathecae
หญิงตั๊กแตนถูกดมยาสลบโดยการระบายความร้อน
spermatheca ถูกลบออกและคงค้างคืนใน 0.1 M PO4
บัฟเฟอร์ (pH 7.4) ที่มี paraformaldehyde 4% 4 8C หลังจากการตรึงที่ spermatheca ถูกฝังอยู่ในเจลาติน albumine ตามมาด้วยอีกตรึงค้างคืนใน 4% paraformaldehyde ใน0.1 M PO4 บัฟเฟอร์ (pH 7.4) เจลาติน albumine บล็อกสั้น ๆ ถูกล้างด้วยPO4 buffer และตัดกับ vibratome (LEICA, VT1000S) เข้า 50 มิลลิเมตรส่วนหนา เหล่านั้นถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ PO4 ในชั่วข้ามคืน หลังจากที่ปิดกั้นด้วยเซรั่มแพะปกติ 1% (Amersham ชีววิทยาศาสตร์), 0.5% albumine ซีรั่มวัว (MP Biomedicals อิงค์) และ 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) ใน 0.1 M PO4 บัฟเฟอร์เวลา 3 ชั่วโมง, แอนติบอดีแรกที่กำกับ กับ acetylated A-tubulin (Sigma, T-6793, โมโนโคลนอลเมาส์) ถูกนำมาใช้ 1: 1,000 ในการป้องกันบัฟเฟอร์72 ชั่วโมงที่ 4 8C หลังจากล้างใน buffer PO4 รองแอนติบอดีAlexa Fluor 488 แพะต่อต้านเมาส์ IgG (Invitrogen) ถูกนำมาใช้1: 100 ในการป้องกันบัฟเฟอร์เวลา 3 ชั่วโมง ส่วนที่ถูกล้างด้วยPO4 buffer หลายครั้งย้ายไปเป็นส่วนผสมของ PO4 กับกลีเซอรอล(1: 1) และติดตั้งอยู่บนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ อิมมูโนได้รับการวิเคราะห์ด้วยเลเซอร์สแกนกล้องจุลทรรศน์ confocal (LEICA TCS SP2) ความเข้มสูงสุดของกองภาพที่ถูกสกัดด้วยLeica Confocal ซอฟท์แว Lite ความสว่างและความคมชัดของการคาดการณ์การปรับกับ Photoshop (Adobe) สเปิร์มที่ถูกระบุว่าหลังจากที่รายละเอียดของ Winterton et al, (1999)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การตรวจหาเชื้ออสุจิใน spermathecae
ตั๊กแตนตัวเมียที่ถูกวางยาสลบ โดยระบายความร้อน
spermatheca ถูกเอาออก และคงค้างคืนใน 0.1 M po4
บัฟเฟอร์ pH 7.4 ) ประกอบด้วย 4 % พาราฟอร์มาลดิไฮด์ ที่ 4 8C หลังจาก
การตรึง , spermatheca อยู่ในวุ้น albumine
ตามมาอีกในชั่วข้ามคืน การตรึงในพาราฟอร์มาลดิไฮด์ 4% ใน 0.1 M
po4 บัฟเฟอร์ pH 7.4 )วุ้น albumine บล็อกสั้น
ล้างด้วย po4 บัฟเฟอร์ และตัดด้วย vibratome ( Leica , vt1000s )
เป็น 50 mm หนาส่วน ผู้ที่ถูกล้างด้วย po4 บัฟเฟอร์
ค้างคืน หลังจากการปิดกั้นด้วย 1% เลือดแพะปกติ ( ที่
Biosciences ) 0.5% albumine วัว เซรั่ม ( MP biomedicals อิงค์ )
1 % Triton X-100 ( Sigma ) ดิช ) ใน 0.1 โมลาร์ po4 บัฟเฟอร์ 3 H ,
แอนติบอดีแรกกำกับกับยาว a-tubulin ( Sigma , T -
6793 โมโนโคลนอล , เมาส์ , 000 ) ใช้ในบล็อกบัฟเฟอร์
72 H 4 8C . หลังจากล้าง po4 buffer มัธยม
แอนติบอดี , Alexa Fluor 488 แพะ IgG anti เมาส์ ( Invitrogen ) ถูกใช้ในบล็อกบัฟเฟอร์ 100
3 H . ส่วน ถูกล้างด้วย
po4 บัฟเฟอร์หลายครั้ง ย้ายไป ผสมกับกลีเซอรอล po4
( 11 ) และติดบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์
วิธีวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ( สแกนด้วยเลเซอร์ Leica
งาน SP2 ) ความเข้มของภาพสูงสุดกองสกัดกับ
Leica ด้วยซอฟต์แวร์ Lite ความสว่างและความคมชัดของการประมาณการ
มีปรับด้วย Photoshop ( Adobe ) อสุจิที่ถูกระบุว่าหลังจาก
รายละเอียดของวินเทอร์ทั่น et al .
( 1999 )