2. Materials and methods2.1. Soil s

2. Materials and methods
2.1. Soil samples
Soil samples were collected from an urban area close to a fuel station
with a history of contamination by heavy metals and petroleum hydrocarbons, mostly diesel. Samples were taken with a drill auger, which
allowed collecting soil from different depths between 0 and 100 cm.
This soil was sieved to pass through a 6 mm mesh and homogenized.
To limit the level of pollutants, the contaminated soil was mixed (1:1
w/w) with soil from the same site but characterized by negligible hydrocarbon contamination. Before mixing, this soil was sieved through a
2 mm mesh. Selected chemical and physical properties of this unique
composite sample (1:1 w/w mix of both soils) are presented in
Table 1. Initial physicochemical characterization of soil samples was
performed by a certified laboratory: ALcontrol Laboratories (The
Netherlands). ALcontrol is accredited by the Cofrac (Comité français
d'accréditation) and by the RvA (Raad voor Accreditatie) under number
L028, in accordance with the criteria of laboratory analysis: ISO/IEC
17025:2005.
2.2. Plants
Alfalfa seeds (M. sativa L. v. La Bella Campagnola, purity: 99%,
germinability: 85%) were surface disinfected by immersion in 2% (v/v)
hydrogen peroxide for 8 min (Qu et al., 2011), in order to avoid the addition of non-indigenous microorganisms to the system. Then, seeds
were thoroughly rinsed three times with sterile water and used for
the pot experiment.
694 A.C. Agnello et al. / Science of the Total Environment 563–564 (2016) 693–703
2.3. Bacteria
The bacterial strain P. aeruginosa ATCC® 9027 was used as inoculum
for the bioaugmentation treatments. This strain was bought as
Vitroids™ discs of bacteria (Sigma-Aldrich Chimie S.a.r.l., Lyon, France)
containing 1000 CFU (colony forming units).
2.4. Pot experiment
Disinfected alfalfa seeds were sown in a commercial soil (organic
carbon: 20%, organic nitrogen: 0.4%, organic matter: 40%, dry matter
content: 58%), where seedlings grew for 21 days in a growth chamber
(Sanyo Versatile Environmental Test Chamber MLR-352). Growth
conditions were as follows: photoperiod of 16 h light at 22 °C and
8 h dark at 18 °C, photosynthetic photon flux density (PPFD) of
130 μmol m−2 s−1. Subsequently, ten seedlings of uniform size
were selected and transplanted in plastic pots (8 × 10 cm) filled
with 200 g of the contaminated soil. A pre-growth phase in the commercial soil allowed seedlings to develop certain biomass and favoured a better establishment in the co-contaminated soil after transplanting. Pots
containing the transplants were put in the growth chamber (same conditions as described above) and received water daily. The location of pots
was randomly changed daily. The experimental design included four experimental conditions: (a) natural attenuation (NA, intrinsic clean up
ability of the soil), (b) phytoremediation (PR, soil vegetated with alfalfa),
(c) bioaugmentation (BA, soil inoculated with P. aeruginosa strain), and
(d) bioaugmentation-assisted phytoremediation (BA + PR, soil vegetated with alfalfa and inoculated with P. aeruginosa strain). Bioaugmentation was performed every 15 days, i.e., up to six times during the
experiment, with the aim to maintain an elevated number of microorganisms throughout the experiment, as described by Huguenot et al.
(2015). P. aeruginosa was added to pots as 5 ml of cell suspension
(4.0 × 1011–1.0 × 1012 CFU ml−1). Non-bioaugmented pots received
the same amount of sterile distilled water. Each condition was performed in triplicates. Plants were harvested after 30, 60 and 90 days of
growth in the co-contaminated soil (the different treatments were
grown in parallel) and every time bioaugmentation was performed
three days before. Plants were removed from pots, and roots and shoots
were separated. A fraction of fresh shoots was kept for subsequent analyses. Roots were first washed with distilled water to remove attached
soil particles and with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 10 mM)
afterwards to remove adsorbed metals. Roots were further rinsed with
distilled water and blotted with tissue paper. The plant material was
put at 70 °C for 3 days (Tabatabai, 1998) and dry weights of shoots and
roots were recorded. Dried plant material was used for further analyses.
Soil samples were collected at the end of the experiment (90 days) and
kept at 4 °C until further microbiological and chemical analyses. In the
case of vegetated pots, rhizosphere soil samples were taken. In order to
collect rhizosphere soil, plant roots were vigorously shaken by hand, taking care of the roots' integrity. The external soil not attached to roots was
removed, while the soil in the immediate vicinity of roots was kept for
analyses.
2.5. Plant analyses
2.5.1. Parameters to assess plant physiology
Chlorophyll and flavonol contents were measured every 15 days
during the course of the experiment using the sensor DUALEX
SCIENTIF

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. ตัวอย่างดินตัวอย่างดินที่ถูกเก็บรวบรวมจากตัวเมืองใกล้กับสถานีน้ำมันเชื้อเพลิงมีประวัติของการปนเปื้อนจากโลหะหนักและสารไฮโดรคาร์บอนปิโตรเลียม ดีเซลเป็นส่วนใหญ่ ตัวอย่างที่ถ่าย ด้วยการเจาะสว่าน ซึ่งอนุญาตให้เก็บดินจากความลึกที่แตกต่างระหว่าง 0 และ 100 ซม.ดินนี้แหลกลาญผ่านแบบตาข่าย 6 มม. และ homogenizedการจำกัดระดับของสารมลพิษ ดินปนเปื้อนถูกผสม (1:1w/w) กับดินจากไซต์เดียวกันแต่โดยไฮโดรคาร์บอนเล็กน้อยปนเปื้อน ก่อนที่จะผสม ดินนี้แหลกลาญผ่านการตาข่าย 2 mm คุณสมบัติทางเคมี และกายภาพที่เลือกไม่ซ้ำกันนี้จะแสดงตัวอย่างคอมโพสิต (1:1 ผสม w/w ของดินทั้งสอง)ตารางที่ 1 สมบัติทางเคมีกายภาพเริ่มต้นของตัวอย่างดินคือดำเนินการ โดยได้รับการรับรองห้องปฏิบัติการ: ALcontrol ห้องปฏิบัติการ(เนเธอร์แลนด์) ALcontrol ได้รับการรับรอง โดย Cofrac (Comité ฝรั่งเศสd'accréditation) และ โดย RvA (ศตอฟาเราะอฺด์พลาสติกแบบ Accreditatie) ภายใต้หมายเลขL028 ตามหลักเกณฑ์ของการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการ: มาตรฐาน ISO/IEC17025:20052.2. พืชเมล็ดฟา (M. sativa L. v. Campagnola ลาเบลล่า ความบริสุทธิ์: 99%germinability: 85%) ถูกพื้นผิวฆ่าเชื้อ โดยแช่ใน 2% (v/v)ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์สำหรับ 8 นาที (Qu et al. 2011), เพื่อหลีกเลี่ยงการเพิ่มของจุลินทรีย์ไม่ใช่ชนพื้นเมืองให้เป็นระบบ เมล็ดแล้วกระเด็นเมื่อจะสามครั้งน้ำผ่านการฆ่าเชื้อให้สะอาด และใช้สำหรับทดลองหม้อ694 เอซีเยี่ยมร้อยเอ็ด / วิทยาศาสตร์สิ่งแวดล้อมรวม 563-564 (2016) 693-7032.3. แบคทีเรียใช้สายพันธุ์แบคทีเรีย P. aeruginosa ATCC® 9027 เป็น inoculumสำหรับการรักษา bioaugmentation สายพันธุ์นี้ถูกซื้อมาเป็นดิสก์ Vitroids™ ของแบคทีเรีย (Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l. ลียง ฝรั่งเศส)ประกอบด้วย 1000 CFU (อาณานิคมหน่วยการขึ้นรูป)2.4. หม้อทดลองฆ่าฟาเมล็ดถูกหว่านในดินการพาณิชย์ (อินทรีย์คาร์บอน: 20% อินทรีย์ไนโตรเจน: 0.4% อินทรีย์: 40% แห้งเนื้อหา: 58%), ที่ต้นกล้าเติบโต 21 วันในการเจริญเติบโต(ซันโยทดสอบสิ่งแวดล้อมที่หลากหลายห้อง MLR-352) เจริญเติบโตเงื่อนไขมีดังนี้: ช่วงแสงของไฟที่ 22 ° C 16 ชม. และ8 ชั่วโมงมืดที่ 18 ° C ความหนาแน่นฟลักซ์ที่สังเคราะห์แสงโฟตอน (PPFD) ของไมโครโมล 130 m−2 s−1 ต่อมา สิบต้นกล้าของขนาดเต็มไปเลือก และปลูกถ่ายในกระถางพลาสติก (8 × 10 ซม.)มี 200 กรัมของดินที่ปนเปื้อน ขั้นตอนการเจริญเติบโตก่อนในดินพาณิชย์อนุญาตต้นกล้าพัฒนาชีวมวลบาง และชื่นชอบการจัดตั้งขึ้นในดินปนเปื้อนร่วมหลังจากทำการย้าย หม้อประกอบด้วยปลูกถูกวางในหอเจริญเติบโต (เงื่อนไขเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) และรับน้ำทุกวัน ตำแหน่งที่ตั้งของหม้อสุ่มการเปลี่ยนแปลงทุกวัน ออกแบบการทดลองรวมเงื่อนไขการทดลองที่ 4: ลดทอนธรรมชาติ (a) (นา intrinsic สะอาดขึ้นความสามารถในของดิน), (b) phytoremediation (PR ดินปลูกพืชกับฟา),(ค) bioaugmentation (BA ดิน inoculated กับสายพันธุ์ P. aeruginosa), และ(d) bioaugmentation ช่วย phytoremediation (BA + PR ค้นกับฟา และ inoculated กับสายพันธุ์ P. aeruginosa ดิน) Bioaugmentation ดำเนินการทุก 15 วัน นั่นคือ ถึงหกครั้งในระหว่างการทดสอบ การรักษาหมายเลขสูงของจุลินทรีย์ตลอดทดลอง ตามที่อธิบายไว้โดยอโนต์ et al(2015) . P. aeruginosa ถูกหม้อเป็น 5 มล.ของระงับเซลล์(4.0 × 1011 – 1.0 × 1012 CFU ml−1) Bioaugmented ไม่ใช่หม้อที่ได้รับกันน้ำกลั่นที่ฆ่าเชื้อ เงื่อนไขแต่ละเงื่อนไขได้ดำเนินการใน triplicates พืชเก็บเกี่ยวหลังจากวันที่ 30, 60 และ 90 ของเจริญเติบโตในดินร่วมปนเปื้อน (รักษาแตกต่างกันได้ปลูกแบบขนาน) และทุก ครั้งที่ทำการ bioaugmentationสามวันก่อน พืชที่ถูกเอาออกจาก กระถาง และราก และหน่อแยกจากกัน ส่วนของหน่อสดถูกเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง รากถูกแรกล้าง ด้วยน้ำกลั่นเพื่อแนบอนุภาคของดินและ มีกรด ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 10 มม)หลังจากนั้นให้เอาซับโลหะ รากต่อมาล้างด้วยน้ำกลั่น และ blotted กับเยื่อกระดาษ วัสดุที่ใช้พืชมีใส่ 70 ° c สำหรับ 3 วัน (Tabatabai, 1998) และแห้งน้ำหนักของหน่อ และรากที่มีบันทึก วัสดุโรงงานอบแห้งถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมตัวอย่างดินที่ถูกเก็บรวบรวมเมื่อสิ้นสุดการทดลอง (90 วัน) และเก็บที่ 4 ° C จนถึงการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยา และเคมี ในกรณีของกระถางค้น ไรโซสเฟียร์ดินตัวอย่างที่ถ่าย เพื่อเป็นการเก็บไรโซสเฟียร์ดิน รากพืชถูกเขย่าแรง ๆ ด้วยมือ การดูแลความสมบูรณ์ของราก ดินภายนอกรากแนบไม่ได้เอาออก ในขณะที่ดินในบริเวณใกล้เคียงของรากเอาไว้วิเคราะห์2.5. พืชวิเคราะห์2.5.1. พารามิเตอร์เพื่อประเมินสรีรวิทยาของพืชคลอโรฟิลและ flavonol เนื้อหาถูกวัดทุก ๆ 15 วันในระหว่างการทดลองใช้เซ็นเซอร์ DUALEXSCIENTIF

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 ตัวอย่างดิน
เก็บตัวอย่างดินจากเขตเมืองใกล้กับสถานีน้ำมันเชื้อเพลิง
ที่มีประวัติของการปนเปื้อนโลหะหนักและสารไฮโดรคาร์บอนปิโตรเลียมส่วนใหญ่ดีเซล ตัวอย่างที่ถูกถ่ายด้วยสว่านเจาะซึ่ง
. อนุญาตให้เก็บรวบรวมดินจากความลึกที่แตกต่างกันระหว่าง 0 และ 100 ซม
. ดินนี้ถูกร่อนผ่านตาข่าย 6 มิลลิเมตรและหดหาย
ต้องการ จำกัด ระดับของสารมลพิษที่ปนเปื้อนดินผสม (1: 1
w / w) ด้วยดินจากเว็บไซต์เดียวกัน แต่ที่โดดเด่นด้วยการปนเปื้อนสารไฮโดรคาร์บอนเล็กน้อย ก่อนที่จะผสมดินนี้ที่ร่อนผ่าน
ตาข่าย 2 มม สารเคมีที่เลือกและคุณสมบัติทางกายภาพของที่ไม่ซ้ำกัน
ตัวอย่างคอมโพสิต (1: 1 W / W การผสมผสานของทั้งสองดิน) ถูกแสดงไว้ใน
ตารางที่ 1 ลักษณะทางเคมีกายภาพเบื้องต้นของตัวอย่างดินถูก
ดำเนินการโดยได้รับการรับรองห้องปฏิบัติการ: ALcontrol ห้องปฏิบัติการ (ใน
เนเธอร์แลนด์) ALcontrol รับการรับรองโดย Cofrac (Comitéfrançais
d'Accreditation) และโดย RvA (Raad voor Accreditatie) ภายใต้หมายเลข
L028, ตามหลักเกณฑ์ของการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการ: มาตรฐาน ISO / IEC
17025:. 2005
2.2 พืช
เมล็ด Alfalfa (. เอ็ม sativa L. V La Bella Campagnola ความบริสุทธิ์: 99%
งอก: 85%) ได้รับการฆ่าเชื้อพื้นผิวโดยการแช่ใน 2% (v / v)
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นเวลา 8 นาที (Qu et al, 2011. ) ในการสั่งซื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการเพิ่มของจุลินทรีย์ที่ไม่ใช่ชนพื้นเมืองไปยังระบบ จากนั้นเมล็ด
ถูกล้างให้สะอาดสามครั้งด้วยน้ำหมันและใช้สำหรับ
การทดลองหม้อ.
694 AC Agnello et al, / วิทยาศาสตร์ของสิ่งแวดล้อมรวม 563-564 (2016) 693-703
2.3 แบคทีเรีย
แบคทีเรียสายพันธุ์ P. aeruginosa ATCC® 9027 ถูกใช้เป็นหัวเชื้อ
สำหรับการรักษา bioaugmentation สายพันธุ์นี้ถูกซื้อเป็น
แผ่น Vitroids ™ของเชื้อแบคทีเรีย (Sigma-Aldrich Chimie Sarl, ลียง, ฝรั่งเศส)
มี 1000 (หน่วยอดีตอาณานิคม) CFU.
2.4 หม้อทดลอง
ฆ่าเชื้อเมล็ดหญ้าชนิตถูกหว่านในดินในเชิงพาณิชย์ (อินทรีย์
คาร์บอน: 20% ไนโตรเจนอินทรีย์: 0.4% สารอินทรีย์: 40% น้ำหนักแห้ง
ของเนื้อหา: 58%) ซึ่งต้นกล้าเติบโต 21 วันในห้องการเจริญเติบโต
(ซันโย อเนกประสงค์ทดสอบทางด้านสิ่งแวดล้อมหอการค้า MLR-352) การเจริญเติบโต
เงื่อนไขมีดังนี้ช่วงแสงของแสง 16 ชั่วโมงที่ 22 องศาเซลเซียสและ
8 ชั่วโมงที่มืดที่ 18 ° C, ความหนาแน่นของการสังเคราะห์แสงโฟตอนฟลักซ์ (PPFD) ของ
130 ไมโครโมล M-2 S-1 ต่อจากนั้นสิบต้นกล้าขนาดสม่ำเสมอ
ได้รับการคัดเลือกและปลูกในกระถางพลาสติก (8 × 10 ซม.) เต็มไป
ด้วย 200 กรัมของดินที่ปนเปื้อน เฟสก่อนการเจริญเติบโตในดินในเชิงพาณิชย์ได้รับอนุญาตให้ต้นกล้าเพื่อพัฒนาชีวมวลบางอย่างและได้รับการสนับสนุนสถานประกอบการที่ดีขึ้นในดินที่ปนเปื้อนร่วมหลังจากย้ายปลูก กระถาง
ที่มีการปลูกถูกวางในห้องการเจริญเติบโต (เงื่อนไขเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) และได้รับน้ำในชีวิตประจำวัน สถานที่ตั้งของหม้อ
ถูกสุ่มการเปลี่ยนแปลงทุกวัน การออกแบบการทดลองรวมสี่เงื่อนไขการทดลอง (ก) การลดทอนธรรมชาติ (NA, ทำความสะอาดภายใน
ความสามารถของดิน), (ข) การบำบัด (PR ดินโซกับหญ้าชนิต),
(c) bioaugmentation (BA ดินเชื้อด้วยพี aeruginosa สายพันธุ์) และ
(ง) bioaugmentation ช่วยบำบัด (BA + ประชาสัมพันธ์ดินโซกับหญ้าชนิตและเชื้อด้วยความเครียด P. aeruginosa) Bioaugmentation ได้ดำเนินการทุก 15 วันคือถึงหกครั้งในระหว่างการ
ทดลองโดยมีจุดมุ่งหมายในการรักษาเป็นจำนวนที่สูงของจุลินทรีย์ตลอดการทดลองตามที่อธิบายไว้โดยถือวิสาสะ et al.
(2015) P. aeruginosa ถูกบันทึกอยู่ในกระถางขนาด 5 ml ของเซลล์แขวนลอย
(4.0 × 1011-1.0 × 1012 CFU ML-1) หม้อปลอด bioaugmented ได้รับ
จำนวนเงินเดียวกันของน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ สภาพแต่ละคนได้ดำเนินการใน triplicates พืชเก็บเกี่ยวหลังจากที่ 30, 60 และ 90 วันของ
การเจริญเติบโตในดินที่ปนเปื้อนร่วม (การรักษาที่แตกต่างกันมีการ
เจริญเติบโตในแบบขนาน) และทุกครั้งที่ได้ดำเนินการ bioaugmentation
สามวันก่อน พืชที่ถูกถอดออกจากหม้อและรากและยอด
ที่ถูกแยกออก เศษของหน่อสดถูกเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง รากถูกล้างครั้งแรกกับน้ำกลั่นเพื่อลบแนบ
อนุภาคของดินและด้วยกรด Ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 10 มิลลิเมตร)
หลังจากนั้นก็จะดูดซับเอาโลหะ รากล้างต่อไปด้วย
น้ำกลั่นและเปื้อนด้วยกระดาษทิชชู วัสดุที่โรงงานได้รับการ
ใส่ที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 วัน (Tabatabai, 1998) และน้ำหนักแห้งของยอดและ
รากที่ถูกบันทึกไว้ วัสดุจากพืชแห้งที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ต่อไป.
เก็บตัวอย่างดินในตอนท้ายของการทดลอง (90 วัน) และ
เก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาและเคมีเพิ่มเติม ใน
กรณีของหม้อโซ, ตัวอย่างดินบริเวณรากถูกนำ เพื่อที่จะ
เก็บรวบรวมดินบริเวณราก, รากพืชถูกเขย่าแรง ๆ ด้วยมือการดูแลความสมบูรณ์ของราก ' ดินภายนอกไม่ยึดติดกับรากถูก
ลบออกในขณะที่ดินในบริเวณใกล้เคียงของรากถูกเก็บไว้สำหรับ
การวิเคราะห์.
2.5 พืชวิเคราะห์
2.5.1 พารามิเตอร์ในการประเมินสรีรวิทยาพืช
คลอโรฟิลและ flavonol เนื้อหาถูกวัดทุก 15 วัน
ในช่วงของการทดลองโดยใช้เซ็นเซอร์ DUALEX
scientif