Quantitative Real-time PCR Analysis

Quantitative Real-time PCR Analysis
Lactobacilli were added to non-confluent ME-180 cells.
Unbound bacteria were removed after 2 hours of incubation,
and the cells were incubated for an additional 22 hours. The cells
were washed in PBS, and RNA was isolated with an RNeasy Mini
Kit in accordance with the manufacturer’s recommendations
(Qiagen, Hilden, Germany). The total RNA (up to 1 mg) from
three independent experiments was reverse transcribed using the
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Basel,
Switzerland); oligo-dT primers were employed for this process in
accordance with the manufacturer’s recommendations. PCR
amplification was performed using a LightCycler 480 (Roche,
Basel, Switzerland) and a LightCycler 480 SYBR Green I Master
kit (Roche, Basel, Switzerland) with 0.1 mM of each gene-specific
primer and 1 ml of cDNA. The primers that were used were as
follows: the CDKN1A forward primer, 59-TGA GCT GCG CCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เชิงปริมาณแบบ Real-time PCR วิเคราะห์
Lactobacilli ถูกเพิ่มเข้าไปในที่ไม่ได้ไหลมารวมกัน ME-180 เซลล์.
แบคทีเรียหลุดถูกลบออกหลังจาก 2 ชั่วโมงของการบ่ม
และเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 22 ชั่วโมงเพิ่มเติม เซลล์
ถูกล้างในพีบีเอสและอาร์เอ็นเอที่แยกกับ RNeasy มินิ
ชุดให้สอดคล้องกับคำแนะนำของผู้ผลิต
(Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) อาร์เอ็นเอทั้งหมด (สูงสุดถึง 1 มก.) จาก
การทดลองสามอิสระคัดลอกกลับใช้
Transcriptor Strand แรกยีนสังเคราะห์ Kit (Roche, บาเซิล,
สวิตเซอร์); ไพร Oligo-dT ถูกจ้างสำหรับกระบวนการนี้ใน
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR
ขยายได้รับการดำเนินการโดยใช้ LightCycler 480 (Roche,
บาเซิลวิตเซอร์แลนด์) และ LightCycler 480 สีเขียว SYBR ฉันโท
ชุด (Roche, บาเซิล, สวิตเซอร์) 0.1 มิลลิของแต่ละยีนเฉพาะ
ไพรเมอร์และ 1 มิลลิลิตรของยีน ไพรเมอร์ที่ใช้มีดัง
ต่อไปนี้: ไพรไปข้างหน้า CDKN1A, 59-TGA GCT GCG CCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์เชิงเวลาจริง แลคโตบาซิลัส
PCR เพิ่มไม่ me-180 กระจู๋กระจี๋เซลล์
หลุดแบคทีเรียถูกลบออกหลังจาก 2 ชั่วโมงระยะเวลา
และเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลาอีก 22 ชั่วโมง เซลล์
ถูกล้างใน PBS และ RNA ถูกแยกกับ rneasy มินิ
ชุดตามคําแนะนําของผู้ผลิต
( เพิ่มฮิลเดน , เยอรมนี ) ยีนทั้งหมด ( ถึง 1 มิลลิกรัม ) จาก
3 การทดลองค้นคว้าย้อนกลับและใช้
transcriptor เกลียวยีนสังเคราะห์ชุดแรก ( โรช บาเซิล , สวิสเซอร์แลนด์ ,
) ; โอลิโก DT โดยใช้กระบวนการนี้ใน
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดย
( การใช้ lightcycler 480 ( โรเช่ ,
Basel , Switzerland ) และ lightcycler 480 SYBR สีเขียวต้นแบบ
Kit ( โรเช่ , Basel ,สวิตเซอร์แลนด์ ) 0.1 มม. ของแต่ละยีนเฉพาะที่
รองพื้น 1 มิลลิลิตร และยีน . ไพรเมอร์ที่ใช้เป็นดังนี้ :
cdkn1a ไปข้างหน้าก่อน , 59-tga GCT gcg CCA