The immobilized pH gradient (IPG) s

The immobilized pH gradient (IPG) strips [broad range pH 3e10 (Invitrogen)] were equilibrated
for 1 h at RT with the lysed samples (36 mg protein) in rehydration buffer [143 ml 1  ZOOM 2D Protein Solubilizer 2 (Invitrogen), 0.7 ml 2 M DTT, 0.8 ml Carrier ampholytes pH 3e10 (Invitrogen), and 0.5 ml 0.2% bromophenol blue in EtOH].

Isoelectric focusing was performed using a stepwise program 175 V for 15 min, 1500 V for 45 min, and 2000 V for 45 min.

Samples were run on NuPAGE Novex 4e12% Bis-Tris ZOOM gels (Invitrogen) during SDS-PAGE. The strips were restrained on the gel with 0.5% agarose in Tris buffer (124 mM Tris, 960 mM glycine, 17.3 mM SDS in H2O) and resolved in 1 NuPAGE MES SDS Running buffer (Invitrogen)
200 V for 45 min, with 0.5 ml NuPAGE Antioxidant (Invitrogen) in the upper chamber.

Mark12 unstained standard (Invitrogen) was used as the molecular weight standard

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การไล่ระดับแบบตรึง pH (IPG) แถบ [สิ่ง pH 3e10 (Invitrogen)] ถูก equilibratedสำหรับ h 1 ที่ RT กับตัวอย่าง lysed (36 มิลลิกรัมโปรตีน) ในแร่บัฟเฟอร์ [143 ml 1 ซูม 2D 2 Solubilizer โปรตีน (Invitrogen), 0.7 ml 2 ม. DTT, 0.8 ml 3e10 pH ampholytes ผู้ให้บริการ (Invitrogen), และ 0.5 ml 0.2% bromophenol blue ในคะแนน] โฟกัส isoelectric ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมศ 175 V 15 นาที 1500 V สำหรับ 45 นาที และ 2000 V สำหรับ 45 นาที ตัวอย่างถูกเรียกใช้บน NuPAGE Novex 4e12% ทริสเรทติ้ง Bis ซูมเจ (Invitrogen) ระหว่าง SDS-หน้า แถบเส้นเสี้ยวบนเจด้วย agarose 0.5% ในทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ (124 มม.ทริสเรทติ้ง 960 มม. glycine, 17.3 มม. SDS ใน H2O) และได้รับการแก้ไขในบัฟเฟอร์การเรียกใช้ SDS MES NuPAGE 1 (Invitrogen)200 V สำหรับ 45 นาที กับ 0.5 ml NuPAGE สารต้านอนุมูลอิสระ (Invitrogen) ในห้องด้านบนมาตรฐาน unstained Mark12 (Invitrogen) ใช้เป็นมาตรฐานของน้ำหนักโมเลกุล

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตรึงค่า pH ลาด (IPG) แถบ [กว้าง 3e10 ช่วงพีเอช (Invitrogen)] ถูก equilibrated
เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT กับตัวอย่าง lysed (โปรตีน 36 มก.) ในบัฟเฟอร์คืน [143 มล. 1? ZOOM 2D โปรตีนละลาย 2 (Invitrogen) 0.7 มล. 2 M DTT 0.8 มล. Carrier ampholytes ค่า pH 3e10 (Invitrogen) และ 0.5 มล. 0.2% bromophenol สีฟ้าใน EtOH].

Isoelectric โฟกัสได้รับการดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนโปรแกรม 175 V 15 นาที 1500 V 45 นาทีและ 2000 V สำหรับ 45 นาที.

ตัวอย่างที่ทำงานบน NuPAGE Novex 4e12% เจล Bis-Tris ซูม (Invitrogen) ในช่วง SDS-PAGE แถบถูกยับยั้งในเจลที่มี agarose 0.5% ทริสบัฟเฟอร์ (124 มิลลิ Tris, 960 มิลลิ glycine 17.3 มิลลิ SDS ใน H2O) และการแก้ไขใน 1? NuPAGE MES SDS เล่นบัฟเฟอร์ (Invitrogen)
200 V 45 นาที, 0.5 มล. NuPAGE สารต้านอนุมูลอิสระ (Invitrogen) ในห้องชั้นบน.

mark12 มาตรฐานไม่มีรอยเปื้อน (Invitrogen) ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุล