2.1. Generation of TILLING mutantsB

2.1. Generation of TILLING mutants
B. napus (canola cultivar DH12075) seeds were used to generate
three BnFUS3 TILLING mutant lines, CT1296-2 (M1), CT1508-3 (M2)
and CT0831-1 (M3) with the method described in http://www.
botany.ubc.ca/can-till/and Gilchrist et al. (2013). In short, surfacesterilized
seeds of B. napus were mutagenized with EMS (Ethyl
methanesulfonate) and allowed to grow and produce progeny.
Plants obtained from mutagenized seeds were transferred to soil
and grown in a greenhouse until maturity. Seeds were used to
produce second generation of plants which were grown until
flowering, at which point leaves were taken from each plant for
DNA extraction. Plants were allowed to grow until they had produced
a minimum of 100 seeds. Upon maturity, seeds were dried
and stored. Samples of DNA from leaf tissue were used as templates
in polymerase chain reactions (PCR) with the primers bn36-4R and
bn36-5L (Supplementary Table 1), as described by Gilchrist et al.
(2013) and Colbert et al. (2001). These PCR products were then
digested with Celery Juice Extract (CJE) (Till et al., 2004), which
contains an endonuclease that specifically cleaves the single base
pair mismatches resulting from heterozygous point mutations. The
digested DNA was run on a denaturing polyacrylamide Li-cor gel in
order to find DNA populations carrying a mutation in BnFUS3. Upon
the identification of the mutation, the procedure was repeated
using DNA from individuals that exhibited the mutation in the
primary screen.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1 การสร้างสายพันธุ์ TILLINGเมล็ดเกิด napus (คาโนลา cultivar DH12075) ถูกใช้เพื่อสร้างBnFUS3 TILLING เต่าบรรทัด CT1296-2 (M1), CT1508-3 (M2)และ CT0831-1 (M3) ด้วยวิธีการอธิบายไว้ใน http://wwwbotany.ubc.ca/can-till/and Gilchrist et al. (2013) ในระยะสั้น surfacesterilizedเมล็ดของ napus เกิดมี mutagenized ด้วย EMS (เอทิลmethanesulfonate) และสามารถเติบโต และผลิตลูกหลานมีการถ่ายโอนได้จาก mutagenized เมล็ดพืชในดินและปลูกในเรือนกระจกจนครบกำหนด ใช้เมล็ดพันธุ์ผลิตรุ่นที่สองของพืชซึ่งเติบโตจนถึงเวอร์ริ่ง ที่ออกจากจุดที่ถูกนำมาจากโรงงานผลิตแต่ละการสกัดดีเอ็นเอ พืชที่สามารถเจริญเติบโตจนกระทั่งมีผลิตขั้นต่ำ 100 เมล็ด เมื่อครบกำหนด เมล็ดที่แห้งและเก็บไว้ ตัวอย่างของดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อใบถูกใช้เป็นแม่แบบในพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) กับไพรเมอร์ bn36-4R และbn36 - 5 ลิตร (เสริมตารางที่ 1), ตามที่อธิบายไว้โดย Gilchrist et al(2013) และกอลแบร์ et al. (2001) ผลิตภัณฑ์ PCR ได้แล้วเจ่ากับขึ้นฉ่ายน้ำสกัด (CJE) (ลิ้นชักเอ็ด al., 2004), ซึ่งประกอบด้วย endonuclease ที่แยกออกฐานหนึ่งโดยเฉพาะเกิดจากการกลายพันธุ์จุด heterozygous mismatches คู่ ที่ดีเอ็นเอที่ต้องถูกรันใน denaturing polyacrylamide เจลี่ประกอบ ในสั่งหาดีเอ็นเอประชากรดำเนินการกลายพันธุ์ใน BnFUS3 เมื่อรหัสของการกลายพันธุ์ ขั้นตอนซ้ำใช้ดีเอ็นเอจากบุคคลที่กลายพันธุ์ในการจัดแสดงหน้าจอหลัก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1
รุ่นกระทั่งกลายพันธุ์บี napus (คาโนลาพันธุ์ DH12075)
เมล็ดพันธุ์ถูกนำมาใช้ในการสร้างสามBnFUS3 กระทั่งสายการกลายพันธุ์ CT1296-2 (M1) CT1508-3 (M2)
และ CT0831-1 (M3) ด้วยวิธีการที่อธิบายไว้ใน http: // www.
พฤกษศาสตร์ ubc.ca/can-till/and กิลคริสต์ et al, (2013) ในระยะสั้น surfacesterilized
เมล็ดของ napus บีถูก mutagenized กับระบบการจัดการสิ่งแวดล้อม (Ethyl
methanesulfonate) และได้รับอนุญาตที่จะเติบโตและผลิตลูกหลาน.
พืชที่ได้จากเมล็ด mutagenized
ถูกย้ายไปในดินและปลูกในเรือนกระจกจนครบกําหนด เมล็ดพันธุ์ถูกนำมาใช้ในการผลิตรุ่นที่สองของพืชที่ปลูกจนออกดอกที่ใบจุดถูกนำมาจากแต่ละโรงงานสำหรับการสกัดดีเอ็นเอ พืชที่ได้รับอนุญาตที่จะเติบโตจนกว่าพวกเขาจะมีการผลิตขั้นต่ำ 100 เมล็ด เมื่อครบกำหนดเมล็ดแห้งและเก็บไว้ ตัวอย่างดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อใบถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบในการเกิดปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) กับไพรเมอร์และ bn36-4R bn36-5L (เสริมตารางที่ 1) ตามที่อธิบายไว้โดยกิลคริสต์ et al. (2013) และฌ็อง et al, (2001) ผลิตภัณฑ์เหล่านี้แล้ว PCR ถูกย่อยด้วยสารสกัดจากน้ำผลไม้คื่นฉ่าย(CJE) (จนถึง et al., 2004) ซึ่งมีendonuclease ที่เฉพาะแข็งกระด้างฐานเดียวที่ไม่ตรงกันคู่ที่เกิดจากการกลายพันธุ์จุดheterozygous ดีเอ็นเอย่อยได้ทำงานบน denaturing polyacrylamide เจลลี่คอร์ในเพื่อหาประชากรดีเอ็นเอดำเนินการกลายพันธุ์ในBnFUS3 เมื่อบัตรประจำตัวของการกลายพันธุ์ที่ขั้นตอนซ้ำโดยใช้ดีเอ็นเอจากบุคคลที่ได้มีการกลายพันธุ์ในหน้าจอหลัก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . รุ่นของการไถพรวนกลายพันธุ์
B napus ( พันธุ์เมล็ดคาโนลา dh12075 ) ถูกใช้เพื่อสร้าง
3 bnfus3 เตรียมสายกลายพันธุ์ ct1296-2 ( M1 ) และ ct1508-3 ( M2 )
ct0831-1 ( M3 ) ด้วยวิธีที่อธิบายไว้ใน http : / / www .
botany.ubc.ca/can-till/and กิลคริสต์ et al . ( 2013 ) ในสั้น surfacesterilized
เมล็ดพ. napus เป็น mutagenized ด้วย EMS ( เอทิล
methanesulfonate ) และได้รับอนุญาตให้เติบโต และผลผลิตพืชที่ได้จากลูกหลาน
mutagenized เมล็ดถูกย้ายไปปลูกในเรือนกระจก และดิน
จนครบกำหนด เมล็ดใช้
ผลิตรุ่นที่สองของพืชที่ปลูกจนออกดอก
, ที่จุดแต่ละใบ นำมาจากพืช
การสกัดดีเอ็นเอ พืชได้รับอนุญาตให้เติบโตจนกว่าพวกเขาได้ผลิต
ขั้นต่ำ 100 เมล็ดเมื่อเก็บเกี่ยว เมล็ดแห้ง
และเก็บไว้ ตัวอย่างดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อใบถูกใช้เป็นแม่แบบ
ในวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ( พีซีอาร์ ) ด้วยไพรเมอร์ bn36-4r และ
bn36-5l ( ตารางประกอบ 1 ) ตามที่อธิบายไว้โดยกิลคริสต์ et al .
( 2013 ) และฌ็อง et al . ( 2001 ) ผลิตภัณฑ์ PCR เหล่านี้ถูกย่อยด้วยคื่นฉ่ายน้ำผลไม้สกัดแล้ว
( cje ) ( จน et al . , 2004 ) ซึ่ง
มีเอนโดนิวคลีเอสที่เฉพาะคลีฟส์เดียวฐาน
คู่ความไม่ที่เกิดจากการกลายพันธุ์จุดก่อน .
ย่อยดีเอ็นเอก็วิ่งบนโพลีอะคริลาไมด์เจลลี่ครี่ใน
เพื่อหาการกลายพันธุ์ในดีเอ็นเอพาหะประชากร bnfus3 . เมื่อ
ตัวของการกลายพันธุ์ กระบวนการทำซ้ำ
ใช้ดีเอ็นเอจากบุคคลที่มีการกลายพันธุ์ใน
หน้าจอหลัก