MATERIALS AND METHODSBacterial isol

MATERIALS AND METHODS
Bacterial isolates
A point-prevalence study involving 143 Spanish hospitals on a
single day during 2002 yielded a total of 439 clinical isolates of
S. aureus. Full details of the study design and identification of
the isolates have been described previously [26]. Of the total
isolates, 134 were MRSA; these were from blood (9.7%), urine
(9.7%), abscesses and wounds (42.5%), catheter tips (6.7%),
the lower respiratory tract (15.7%), soft-tissues (11.2%), sterile
fluids (1.5%) and other sites (3.0%). The isolates were
considered to be community-acquired if a positive culture
was obtained within 48 h of admission, and nosocomial if a
positive culture was obtained thereafter.
Susceptibility testing
Antimicrobial susceptibility testing was performed using the
MicroScan automated broth microdilution method and the Pos
Combo 1S panel (Dade Behring, Sacramento, CA, USA)
following the manufacturer’s guidelines. The antimicrobial
agents tested were penicillin, ampicillin, oxacillin, erythromycin,
clindamycin, gentamicin, tobramycin, ciprofloxacin, rifampicin,
trimethoprim–sulphamethoxazole, vancomycin and
teicoplanin. Susceptibility to mupirocin was determined by the
disk-diffusion method. Inducible clindamycin resistance (using
a disk approximation test) and MIC breakpoints were determined
following CLSI recommendations [27]. Breakpoints for
mupirocin were determined according to MENSURA criteria
[28]. The mecA gene was detected by PCR as described by Geha
et al. [29].
Phage typing
Phage typing was performed according to Blair and Williams
[30], using the group of 23 phages from the Basic International
Set of Typing Phages. All phages were used at routine test
dilution and 100 · routine test dilution. Interpretation was
based on lysis by at least two different phages [31,32]. The
Specific Set of Typing Phages for MRSA was also used [33].
Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
All 134 MRSA isolates were genotyped by PFGE following
SmaI digestion of chromosomal DNA, prepared using a
modification of the protocol described by Goering and Winters
[34]. The resulting agarose plugs were loaded on agarose 1.2%
w ⁄ v gels, and PFGE was performed in a CHEF-DRII apparatus
(Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) in 0.5 · TBE buffer (1 · TBE
is 89 mM Tris, 89 mM boric acid, 1 mM EDTA), with a ramped
pulse time of 1–80 s, and 6 V ⁄ cm for 30 h at 12–14C. The gels
were stained with ethidium bromide, visualised under UV
illumination and photographed. Following analysis according
to the criteria of Tenover et al. [35], a dendrogram was
constructed with Molecular Analyst Software (Bio-Rad) using
the Dice correlation coefficient [36] and the unweighted pairgroup
method with averages (UPGMA), with a tolerance position
of 0.8%. According to a previous study [16], each PFGE type
was designated with the letter E, followed by a number that
correlated with the date of isolation, while each subtype was
designated by the letter of the main pulsotype to which it was
closest. Sporadic strains were assigned a number. In a previous
study [16], PFGE type E1 corresponded to ST247-MRSA-I,
types E3 and E10 corresponded to ST146-MRSA-IV, types E6,
E15 and E17 corresponded to ST228-MRSA-I, types E7, E8 and
E11 corresponded to ST125-MRSA-IV, and type E12 corresponded
to ST36-MRSA-II.
Multiplex PCR SCCmec typing
SCCmec types were determined using a multiplex PCR
strategy that generated a specific amplification pattern for
each SCCmec structural type [37]. This method does not
identify the ccrAB alleles, but an excellent correlation has been
demonstrated between the full characterisation of SCCmec and
this strategy [37]. Additional typing of isolates that were nontypeable
by this method was performed as described by Zhang
et al. [38].
Detection of Panton–Valentine leukocidin (PVL) genes
The PVL genes (lukS-PV and lukF-PV) were detected by PCR as
described by Lina et al. [39]. S. aureus ATCC 49775 (a PVLpositive
strain) was used as a positive amplification control.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการแบคทีเรียที่แยกได้จุดชุกศึกษาพยาบาลสเปน 143 เกี่ยวข้องกับการวันเดียวในระหว่าง 2002 ผลจำนวน 439 ทางคลินิกแยกของหมอเทศข้างลาย S. รายละเอียดทั้งหมดของการศึกษาออกแบบและรหัสของแยกมีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26] ของผลรวมล 134 ถูก MRSA เหล่านี้ได้จากเลือด (9.7%), ปัสสาวะ(9.7%), ให้ฝีและบาดแผล (42.5%), พัฒนาโปรแกรมฐานข้อมูลเคล็ดลับ (6.7%),การหายใจส่วนล่าง (15.7%), น้ำอัดลมเนื้อเยื่อ (11.2%), กอซของเหลว (1.5%) และเว็บไซต์อื่น ๆ (3.0%) แยกได้พิจารณาชุมชนมาถ้าวัฒนธรรมบวกได้รับภายใน 48 h น่าชม nosocomial เป็นรับวัฒนธรรมบวกหลังจากนั้นทดสอบภูมิไวรับภูมิไวรับยับยั้งจุลินทรีย์ทดสอบทำโดยใช้การMicroScan อัตโนมัติวิธี microdilution ซุปและ Posผสมแผง 1S (Dade Behring แซคราเมนโต CA, USA)ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การยับยั้งจุลินทรีย์ตัวแทนทดสอบถูกยาเพนนิซิลลิน แอมพิซิลลิน oxacillin, erythromycinclindamycin, gentamicin, tobramycin, ciprofloxacin, rifampicinไตรเมโทพริม – sulphamethoxazole, vancomycin และteicoplanin ง่าย mupirocin ถูกกำหนดโดยการวิธีการแพร่ดิสก์ (ใช้ความต้านทานของ inducible clindamycinทดสอบประมาณดิสก์) และมีกำหนดจุดพักไมค์ตาม CLSI แนะนำ [27] จุดสั่งหยุดสำหรับmupirocin ถูกกำหนดตามเกณฑ์ MENSURA[28] ยีน mecA พบ PCR ตามที่อธิบายไว้ โดย Gehaal. ร้อยเอ็ด [29]พิมพ์ phageพิมพ์ phage ทำตามแบลร์วิลเลียมส์[30], การใช้กลุ่มของ phages 23 ห้องพื้นฐานชุดพิมพ์ Phages Phages ทั้งหมดถูกใช้ทดสอบเป็นประจำเจือจางและขาด 100 ทดสอบประจำเจือจาง ตีความได้ตาม lysis ด้วย phages แตกต่างกันน้อยสอง [31,32] ที่การตั้งค่าของการพิมพ์ Phages สำหรับ MRSA ได้ยังใช้ [33]Electrophoresis ฟิลด์สูงเจ (PFGE)ทั้งหมด 134 MRSA ที่แยกได้ genotyped PFGE ตามย่อยอาหาร SmaI ของ DNA ของโครโมโซม ใช้เป็นปรับเปลี่ยนโพรโทคอลโดย Goering และหนาว[34] . ปลั๊ก agarose ได้ถูกโหลดใน agarose 1.2%ทำเจ w ⁄ v และ PFGE ในเครื่อง DRII พ่อครัว(ไบโอราษฎร์ โรงแรม สหราชอาณาจักร) ใน 0.5 · TBE บัฟเฟอร์ (1 · TBEมี 89 มม.ตรี กรด boric 89 mM, 1 mM EDTA), กับมี rampedเวลาชีพจร s 1-80 และ 6 V ⁄ซม. h 30 ที่ C 12-14 เจมีสี ด้วยโบรไมด์ ethidium, visualised ภายใต้ UVแสงสว่าง และการถ่ายภาพ ต่อไปนี้วิเคราะห์ตามเป็น dendrogram ถูกเงื่อนไขของ Tenover et al. [35],สร้างขึ้น ด้วยการใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์โมเลกุล (ไบ-Rad)สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของลูกเต๋า [36] และ unweighted pairgroupวิธี มีค่าเฉลี่ย (UPGMA), กับตำแหน่งการยอมรับ0.8% ตามก่อนหน้านี้ศึกษา [16], แต่ละชนิด PFGEถูกกำหนด ด้วยตัวอักษร E ตาม ด้วยหมายเลขที่correlated ที่แยก ขณะที่อยู่ในชนิดย่อยแต่ละกำหนดตามตัวอักษรของ pulsotype หลักที่ที่มันเป็นใกล้เคียงกัน มีสายพันธุ์ถูกกำหนดหมายเลข ในการก่อนหน้านี้ศึกษา [16], ชนิด PFGE corresponded E1 ให้กับ ST247-MRSA-IE3 และ E10 corresponded การ ST146-MRSA-IV, E6 ชนิดE15 และ E17 corresponded การ ST228-MRSA-ฉัน ชนิด E7, E8 และE11 corresponded กับ ST125 MRSA IV และ corresponded ชนิด E12การ ST36-MRSA-IIMultiplex PCR SCCmec พิมพ์SCCmec ชนิดถูกกำหนดโดยใช้ multiplex PCRกลยุทธ์ที่สร้างรูปแบบการขยายเฉพาะสำหรับแต่ละ SCCmec โครงสร้างชนิด [37] วิธีนี้ไม่ได้ระบุ ccrAB alleles แต่ความสัมพันธ์ที่ดีได้แสดงระหว่างตรวจลักษณะเฉพาะของทั้งหมดของ SCCmec และกลยุทธ์ที่นี้ [37] พิมพ์เพิ่มเติมของแยกได้ที่ nontypeableโดยวิธีนี้ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ โดยเตียวร้อยเอ็ด al. [38]ตรวจยีน Panton – วาเลนไทน์ leukocidin (PVL)ตรวจพบ โดย PCR เป็นยีน PVL (lukS PV และ lukF PV)อธิบายโดยลีเอส al. [39] หมอเทศข้างลาย S. ATCC 49775 (มี PVLpositiveต้องใช้) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมขยายบวก