2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant materialsIn vitro cultured pear (Pyrus communis) plants infected with ASGV, ACLSV and ASPV were used for the optimization of all RT-PCRassays.Plasmids containing cloned cDNAs of a 582 bp CP gene (Acces-sion no. AY728180) of an ACLSV isolate from peach, a 500 bp fragment covering 62.7% of the CP gene of a ASGV isolate from pear(Zheng et al., 2005), and a fragment of the CP gene of a ASPV iso-late from pear, respectively, were used as templates to optimizethe PCR conditions and evaluate its sensitivity for the detection of those three viruses.Samples of field-grown sandy pear (Pyrus pyrifolia cv. Cuiguanand Yuanhuang), of which the infections with ASGV, ACLSV andASPV were confirmed by uniplex RT-PCR (uRT-PCR), together with in vitro cultured plants of P. communis, were used for the validation of the efficiency and specificity of mRT-PCR. Some other pear and apple samples randomly collected from different fields were included in the validation of the efficiency of optimized mRT-PCRapplied for the detection of the three viruses in field-grown plants.In vitro virus-free plants of Pyrus betulifolia were used as negative controls for all assays.
2.2. Design of virus-specific primers Our previous studies indicated that ASGV-specific primer setASGV-U/ASGV-2 (James, 1999) could give reliable detections of ASGV in pear plants. Preliminary experiments performed in our laboratory revealed that ASPV isolates were highly variable and there were problems with RT-PCR detection of some ASPV iso-lates by using primers reported previously (MacKenzie et al., 1997;Malinowski et al., 1998; Schwarz and Jelkmann, 1998; Komorowskaet al., 2010). Thereby, in this study, three primer pairs specific for ACLSV and four primer pairs specific for ASPV (Table S1) werede signed based on the sequences specific for each virus availablein GenBank and tested in our laboratory (unpublished), and those primer sets were designed to have similar annealing temperatures(50–58◦C). The primer sets ACLSV-52/ACLSV-53 specific for ACLSV(German et al., 1990) and ASPV370-F/ASPV370-R specific for ASPV reported previously (Menzel et al., 2002) were also included in theassays. The specificity of each primer set was analyzed by comparisons and Blastn search (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).Supplementary material related to this article can be found,in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.11.005.2.3

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 ลูกแพร์เครื่องอ่าง materialsIn พืชพืช (Pyrus communis) ติดกับ ASGV, ACLSV และ ASPV ใช้สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ RT-PCRassays.Plasmids ทั้งหมดที่ประกอบด้วย cDNAs โคลนของยีน bp CP 582 (sion เดินไม่ AY728180) ของการ ACLSV แยกจากพีช 500 bp ส่วนครอบคลุม 62.7% ของยีน CP ของ ASGV แยกจากลูกแพร์ (เจิ้ง et al., 2005), และชิ้นส่วนของยีน CP ของ ASPV ที่ iso สายจากลูกแพร์ ถูกใช้เป็นแม่แบบที่ optimizethe PCR เงื่อนไข และประเมินความสำคัญของการตรวจพบไวรัสที่สามตามลำดับตัวอย่างของฟิลด์โตทรายลูกแพร์ (Pyrus pyrifolia พันธุ์ Cuiguanand Yuanhuang), ซึ่งติดเชื้อกับ ASGV, ACLSV andASPV ถูกยืนยัน โดย uniplex RT-PCR (uRT-PCR), กับในอ่างพืชของ P. communis ถูกใช้สำหรับการตรวจสอบประสิทธิภาพและ specificity mRT PCR บางอื่น ๆ ลูกแพร์แอปเปิ้ลตัวอย่างและสุ่มเก็บจากต้นได้รวมอยู่ในการตรวจสอบประสิทธิภาพของรถไฟ PCRapplied เพิ่มประสิทธิภาพในการตรวจพบไวรัสสามในเขตข้อมูลที่มีปลูกพืชเพาะเลี้ยงไวรัสพืชของ Pyrus betulifolia ใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบสำหรับทั้งหมด assays
2.2 การออกแบบไพรเมอร์ไวรัสเฉพาะที่ของเราการศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่า ASGV เฉพาะพื้น setASGV-U/ASGV-2 (James, 1999) สามารถให้ detections เชื่อถือได้ของ ASGV ในต้นพืช เบื้องต้นทดลองดำเนินการในห้องปฏิบัติการของเราเปิดเผยว่า ASPV แยกถูกผันแปรสูง และมีปัญหาตรวจ iso ASPV บางปลากะพง RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์รายงานก่อนหน้านี้ (แมคและ al., 1997Malinowski et al., 1998 โรลด์และ Jelkmann, 1998 Komorowskaet al., 2010) ในการศึกษานี้ จึง คู่รองพื้นสามเฉพาะสำหรับ ACLSV และสี่พื้นคู่เฉพาะสำหรับ werede ASPV (ตาราง S1) ลงชื่อตามลำดับที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแต่ละไวรัส availablein GenBank และทดสอบในห้องปฏิบัติการของเรา (ยกเลิกประกาศ), และชุดรองพื้นนั้นถูกออกแบบให้มี temperatures(50–58◦C) คล้ายหลอม เฉพาะชุด ACLSV-52/ACLSV-53 รองพื้นสำหรับ ACLSV (เยอรมัน et al., ปี 1990) และ ASPV370-F/ASPV370-R เฉพาะสำหรับรายงานก่อนหน้านี้ ASPV (Menzel และ al., 2002) นอกจากนี้ยังรวมอยู่ใน theassays Specificity ของแต่ละชุดพื้นถูกวิเคราะห์ โดยเปรียบเทียบและค้นหา Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)วัสดุเสริมที่เกี่ยวข้องกับบทความนี้จะมา รุ่นออนไลน์ ที่ http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.11.005.2.3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . การเพาะเลี้ยงพืช materialsin ลูกแพร์ ( pyrus communis ) พืชที่ติดเชื้อ asgv aclsv aspv , และถูกใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของ rt-pcrassays.plasmids ที่มีโคลน cdnas ของยีนกับ BP CP ( ACCES ไซออนไม่ ay728180 ) ของ aclsv สกัดจากพีช , 500 BP ส่วนครอบคลุม 62.7 % ของ CP ยีนของ asgv แยกจากลูกแพร์ ( เจิ้ง et al . , 2005 )และส่วนของ CP ยีนของ aspv ISO สายจากลูกแพร์ ตามลำดับ ใช้เป็นแม่แบบในการ optimizethe เงื่อนไข PCR และประเมินความไวของการตรวจหาไวรัส สาม ตัวอย่างของเขตปลูกแซนดี้ลูกแพร์ ( รยางค์คือ cuiguanand yuanhuang ) ซึ่งเชื้อกับ asgv aclsv andaspv , ได้รับการยืนยันโดย uniplex RT-PCR ( URT ) )ร่วมกับการเพาะเลี้ยงพืชหน้า communis ถูกใช้เพื่อหาประสิทธิภาพ และ MRT PCR specificity บางอื่น ๆแอปเปิ้ลและลูกแพร์ตัวอย่างสุ่มเก็บข้อมูลจากเขตข้อมูลที่แตกต่างกันที่ใช้ในการตรวจสอบประสิทธิภาพของการรถไฟฟ้า pcrapplied เพื่อตรวจหาไวรัสใน 3 สนามที่ปลูกพืชในสภาพปลอดเชื้อ ปลอดจากไวรัสพืช pyrus betulifolia ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบทั้งหมด ) .
2.2 . การออกแบบของไวรัสที่เฉพาะเจาะจงจากการศึกษาของเราพบว่าไพรเมอร์ก่อนเฉพาะ asgv setasgv-u / asgv-2 ( เจมส์ , 1999 ) จะให้เรื่องความน่าเชื่อถือของ asgv ในพืชลูกแพร์เบื้องต้นมีการทดลองในห้องปฏิบัติการของเราพบว่าไอโซเลท aspv ตัวแปรสูง และมีปัญหากับวิธีการบางอย่าง aspv ISO ปลากะพงขาวโดยใช้ไพรเมอร์ที่รายงานก่อนหน้านี้ ( แม็คเคนซี่ et al . , 1997 ; มาลิ et al . , 1998 ; ชวาร์ซ และ jelkmann , 1998 ; komorowskaet al . , 2010 ) ดังนั้นในการศึกษานี้สามคู่ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ aclsv และสี่สีคู่ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ aspv ( ตาราง S1 ) werede ลงนามตามลําดับที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแต่ละ availablein พบไวรัสและทดสอบในห้องปฏิบัติการของเรา ( พิมพ์ ) และไพรเมอร์ชุดถูกออกแบบให้มีอุณหภูมิอบ ( 50 - 58 ◦ C ) ไพรเมอร์ชุด aclsv-52 / aclsv-53 เฉพาะ aclsv ( เยอรมัน et al . ,1990 ) และ aspv370-f / aspv370-r เฉพาะ aspv รายงานก่อนหน้านี้ ( Menzel et al . , 2002 ) ก็รวมอยู่ใน theassays . ความจำเพาะของแต่ละชุด วิเคราะห์ข้อมูลโดยการเปรียบเทียบกับรองพื้น blastn ค้นหา ( http : / / ระเบิด ncbi . nlm . NIH . gov / ระเบิด CGI ) วัสดุเสริมที่เกี่ยวข้องกับบทความนี้สามารถพบได้ในรุ่นออนไลน์ที่ http : / / DX ดอย . org / 10.1016 / 2013.11.005.2.3 j.jviromet .