A putative laccase gene was cloned

A putative laccase gene was cloned from Shigella dysenteriae W202 and expressed in Escherichia coli as a soluble fusion protein with high yield. The purified product (Wlac) was characterized as the CueO-like laccase from E. coli, a monomer of molecular mass 55 kDa, with a maximum activity of 24.4 U/mg (Km = 0.086) and a pH optimum of 2.5, in a standard assay using ABTS (2,2′-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonate) as the substrate. Activity was stable at 0–25 °C but inhibited above 40 °C. Purified Wlac was completely inhibited by 200 mM EDTA and partially by 32 mM SDS, 50 mM NaN3 and 60 mM thioglycolic acid. Activity was stimulated by Cu2+; other metal ions had only slight or negative effects. Two mutated variants, WlacS and WlacD, were obtained by substituting Glu 106 with Phe 106, and adding a deletion of an α-helix domain (from Leu 351 to Gly 378). WlacS had a 2.2-fold (52.9 U/mg) and WlacD a 3.5-fold (85.1 U/mg) higher enzyme activity than the wild-type laccase and WlacD showed greater thermostability at higher temperatures. Sce VMA intein-associated fusion proteins maintained ∼80% of total enzyme activity. Thus, deletion and site-directed mutagenesis of laccases are capable of promoting both enzymatic activity and thermostability.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยีน putative laccase โคลนจาก Shigella dysenteriae W202 และแสดงใน Escherichia coli เป็นโปรตีนหลอมละลายกับผลตอบแทนสูง ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ (Wlac) มีลักษณะเป็น laccase CueO เหมือนจาก E. coli น้ำยาของมวลโมเลกุล 55 kDa มีกิจกรรมสูงสุดของ U 24.4 มิลลิกรัม (Km = 0.086) และค่า pH เหมาะสม 2.5 ในการทดสอบมาตรฐานที่ใช้รเรียน (2,2′-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonate) เป็นพื้นผิว กิจกรรมมีเสถียรภาพที่ 0 – 25 ° C แต่ห้ามสูงกว่า 40 องศาเซลเซียส Wlac บริสุทธิ์ถูกห้ามทั้งหมด 200 mM EDTA และบางส่วน โดย 32 mM SDS, 50 mM NaN3 และกรด thioglycolic 60 มม. กิจกรรมที่ถูกกระตุ้น โดย Cu2 + ประจุอื่น ๆ โลหะมีผลเพียงเล็กน้อย หรือลบ สองกลายแปร WlacS และ WlacD ได้รับ โดยแทน Glu 106 กับเพ 106 และการเพิ่มการลบโดเมนα-เกลียว (จากลือ 351 ไป Gly 378) WlacS ได้ 2.2-fold (52.9 U/มิลลิกรัม) และ WlacD เป็น 3.5-fold (85.1 U/มิลลิกรัม) กิจกรรมเอนไซม์สูงกว่าป่าชนิด laccase และ WlacD พบ thermostability มากที่อุณหภูมิสูง โปรตีน intein เชื่อมโยงฟิวชั่น Sce VMA รักษา ∼80% ของเอนไซม์ทั้งหมด ดังนั้น ลบและ mutagenesis ไซต์โดยตรงของ laccases มีความสามารถในการส่งเสริมกิจกรรมของเอนไซม์ในระบบและ thermostability

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยีนแลคเคสสมมุติเป็นโคลนจาก Shigella dysenteriae W202 และแสดงในเชื้อ Escherichia coli เป็นโปรตีนที่ละลายน้ำได้ฟิวชั่นที่มีผลตอบแทนสูง ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ (WLAC) ก็มีลักษณะเช่นแลคเคส CueO เหมือนจากเชื้อ E. coli, โมโนเมอร์ของมวลโมเลกุล 55 kDa มีกิจกรรมสูงสุด 24.4 U / มิลลิกรัม (กม = 0.086) และค่า pH ที่เหมาะสม 2.5 ใน การทดสอบมาตรฐานโดยใช้ ABTS (2,2'-azino-di (3 เอทิล benzthiazoline-6​​-sulfonate) เป็นสารตั้งต้น. ความเคลื่อนไหวมีความเสถียรที่ 0-25 ° C แต่ยับยั้งสูงกว่า 40 ° C. บริสุทธิ์ WLAC ถูกยับยั้งโดยสิ้นเชิง . 200 มิลลิ EDTA และบางส่วนจาก 32 มิลลิเมตร SDS, 50 มิลลิ NaN3 และ 60 มิลลิกรด Thioglycolic กิจกรรมได้รับการกระตุ้นโดย Cu2 +; ไอออนโลหะอื่น ๆ ที่มีผลกระทบเพียงเล็กน้อยหรือเชิงลบสองสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์, WlacS และ WlacD, ได้รับโดยการแทน Glu 106 ด้วย. เพ 106, และการเพิ่มการลบโดเมนα-เกลียว (จาก 351 ลื้อเพื่อ Gly 378). WlacS มี 2.2 เท่า (52.9 U / มก.) และ WlacD 3.5 เท่า (85.1 U / มก.) การทำงานของเอนไซม์ที่สูงกว่า แลคเคสชนิดป่าและ WlacD แสดงให้เห็นมากขึ้นทนร้อนที่อุณหภูมิสูง. Sce VMA intein เกี่ยวข้องโปรตีนบำรุงรักษา ~80% ของเอนไซม์ทั้งหมด. ดังนั้นการลบและฉับเว็บไซต์กำกับของ laccases มีความสามารถในการส่งเสริมทั้งเอนไซม์และทนร้อน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยีนแลคเคสซึ่งถูกโคลนชิเกลลา dysenteriae w202 และแสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli โปรตีนที่ละลายน้ำได้เป็นฟิวชั่นที่มีผลผลิตสูง และผลิตภัณฑ์ ( wlac ) มีลักษณะเป็น cueo เหมือนแลคเคสจากเชื้อ E . coli , มอนอเมอร์ของมวลโมเลกุล 55 กิโล กับกิจกรรมสูงสุดถ U / mg ( km = 0.086 ) และ pH ที่เหมาะสมของ 2.5 ในมาตรฐานการทดสอบโดยใช้ Abbr ( 22 ดูแล - azino ตี้ ( 3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonate ) เป็นสับสเตรท กิจกรรมมีความคงตัวที่ 0 – 25 ° C แต่ห้ามเกิน 40 องศา และ wlac ถูกยับยั้งได้โดย 200 mM EDTA และบางส่วน โดยเฉพาะ nan3 32 mm , 50 mm และ 60 mm thioglycolic กรด กิจกรรมที่ถูกกระตุ้นโดย CU2 ; ไอออนโลหะอื่น ๆมีเพียงผลกระทบเล็กน้อย หรือลบ สองสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ wlacs wlacd , และ ,ที่ได้รับจาก GLU 106 กับเพ 106 , และการเพิ่มการลบของแอลฟาเฮลิกซ์เมน ( จากลิว 351 ถึง GLY 378 ) wlacs มี 2.2-fold ( 52.9 U / mg ) และ wlacd เป็น 3.5-fold ( ขวาง U / mg ) เอนไซม์แลคเคส และสูงกว่าของ wlacd ทดลพบมากขึ้นที่อุณหภูมิที่สูงขึ้น วีเ มเอ SCE อินทีอินฟิวชั่นเกี่ยวข้องโปรตีนรักษา∼ 80% ของกิจกรรมเอนไซม์รวม ดังนั้นการลบเว็บไซต์กำกับการของ laccases สามารถส่งเสริมทั้งเอนไซม์ และทดล .