Preparation and treatment of RBCs a

Preparation and treatment of RBCs and hemoglobin purification

Human RBCs were collected with EDTA as anticoagulant, after obtaining informed consent, according to procedures approved by the University of Puerto Rico-Rio Piedras Campus Institutional Review Board (San Juan, PR). The cells were used within 1 week of collection. Prior to study, the RBCs were washed three times by centrifugation with a minimum of a fivefold excess of phosphate-buffered saline (PBS) containing 500 μM diethylenetriaminepentaacetic acid, to chelate extraneous transition metals. RBCs were resuspended to a final hematocrit of about 10%. Deoxygenated RBCs were prepared by extensive cycling of vacuum treatments and argon flushing, in rubber-stoppered 5-mL tubes. Deoxygenation was ascertained spectrophotometrically (i.e., deoxyhemoglobin peak at 555 nm vs. oxyhemoglobin peaks at 540 and 576 nm). Garlic extracts were prepared as previously described.8 In brief, 2–3 g of garlic was ground together in a ceramic mortar and pestle with 2–3 mL of deionized water containing 500 μM diethylenetriaminepentaacetic acid (1 mL/g of garlic) and squeezed through cheesecloth, and the exudates were diluted with PBS containing diethylenetriaminepentaacetic acid (1:10 vol/vol). The garlic extract was aged at least 15 minutes after preparation and was always used within 2 hours. RBCs were incubated with garlic extract (100 μL/mL of RBCs) for 1 hour at room temperature. Iodoacetamide, which permeates through the RBC membrane, was used. Stock iodoacetamide solutions were prepared freshly in PBS containing DPTA and added to RBCs to a final concentration of 10 mM. RBCs were preincubated with iodoacetamide at room temperature for 30 minutes. Excess iodoacetamide was removed by multiple washings of the RBCs with PBS containing DPTA. RBCs were monitored visually and spectrophotometrically during the incubation with garlic extract at room temperature for 1 hour. At appropriate intervals, aliquots of RBC reaction mixtures were removed from the stoppered vials and centrifuged in 1.5-mL Eppendorf tubes. Lysates from washed RBCs were prepared inside the centrifuge tube, 3–5 volumes of cold deionized water containing diethylenetriaminepentaacetic acid were added, and the mixture was then centrifuged at 20,000 g for 5 minutes. The lysates were then spun down (3,000 g) on Sephadex G-25 spin columns equilibrated with 25 mM ammonium bicarbonate. Hemoglobin was collected in the void volume, its concentration was determined, and the preparation was then used for mass spectrometric analysis. For treatment with diallyl disulfide (DADS) (catalog number 32621, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), RBCs (1 mL) were incubated in the presence of 273 mmol of DADS at room temperature for 18 hours. DADS is partly soluble in aqueous solutions. Therefore, the solution containing RBCs and DADS was gently mixed to promote the diffusion of the insoluble compound. After the 18-hour incubation, RBCs were collected, and hemoglobin was purified as explained above.

Protein MS analysis

BioMass analysis
Purified human hemoglobin was diluted in a solution containing acetonitrile:water (50:50 vol/vol) and 0.2% formic acid. The diluted hemoglobin was directly infused into the electrospray ionization source at 1 pmol/μL. The ionization source was set at a spray voltage of 2.0 kV, capillary temperature of 250°C, and capillary voltage of 165 V. The ionized molecules were analyzed in a LTQ mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). The mass spectra were recorded for 2 minutes. The data acquired were then analyzed using the BioMass calculation and deconvolution tool of BioWorks software. The parameters for the BioMass calculation deconvolution were set as follow: enable averaging, enable smoothing (Gaussian; 3), deconvoluted spectrum (12,000–17,000), adduct ion mass [ + proton (+1.008)], and mass step size 0.25 units. The atomic mass obtained from the convoluted mass spectrum was verified manually using the equation (MW + nH+)/n = [MW + (n + 1)H+]/(n + 1), where MW is the molecular weight.

Tandem MS
Purified human hemoglobin (100 pmol) was subjected to trypsin digestion in digestion buffer (40 mM ammonium bicarbonate, 10% acetonitrile, and trypsin [1 μg]) overnight (18 hours) at 37°C. The reaction mixture was dried on a speed vacuum, and the tryptic peptides were resuspended in acetonitrile:water (50:50 vol/vol) containing 0.2% formic acid. The solution containing the tryptic peptides was infused directly into the electrospray ionization source at 1 pmol/μL (spray voltage, 1.5 kV; capillary temperature, 200°C). The ionized peptides were infused into the LTQ mass spectrometer for tandem MS analysis. The peptides were identified by correlating MS-MS spectra with sequences from the National Center for Biotechnology Information nonredundant protein and EST databases using SEQUEST (ThermoFisher) database search algorithms. Only those peptides identified that passed selection filters imposed to the database search were taken into consideration [Xcorr higher than 1.5 (+1), 2.0 (+2) or 2.5 (+3); Delta Score >0.1; 10 or more b and y ions; MS2 intensity of >5 × 10−4; peptide probability >E × 10−2].

Go to:
Results
Garlic extract modifies human beta-hemoglobin

Human RBCs incubated with garlic extract induced the rapid production of H2S. The production of H2S is derived from the decomposition of allicin. Allicin is the main organosulfur compound found in garlic, and it is produced from the amino acid alliin.11 The production of allicin from the decomposition of alliin depends on the enzyme alliinase, which is activated when garlic is crushed. Allicin by-products such as diallyl sulfide, DADS, and diallyl trisulfide are rapidly formed in aqueous solutions. Of these three allicin by-products, DADS is the most prevalent (66%) in comparison to the other sulfides produced.11 These organosulfur compounds could modify the reactive cysteine residues found in the alpha-chain (position 104) and beta-chain (positions 93 and 112) of the hemoglobin molecule. In order to determine if human hemoglobin is modified by garlic extract, freshly collected and prepared human RBCs were incubated with fresh garlic extract. After incubation in an argon atmosphere, RBCs were collected by centrifugation and washed. As negative control, hemoglobin was extracted from untreated RBCs. The purified hemoglobin molecules were subjected to BioMass analyses. The mass spectrum of hemoglobin purified from control-treated RBCs showed the two major subunits of the hemoglobin molecule, the alpha- (15,130.5) and beta- (15,870.5) chains, as expected (Fig. 1A). Interestingly, however, the hemoglobin purified from the garlic-treated RBCs showed a mass shift of the peak representing the beta-chain but not the alpha-chain (Fig. 1B). The detected mass shift was, approximately, 71 atomic mass units (amu). The result indicates that a compound present in garlic extract can modify intraerythrocytic human hemoglobin, specifically the beta-chain.

FIG. 1.
FIG. 1.
Garlic extract modifies human beta-hemoglobin (Hb). Freshly prepared human red blood cells were treated with either (A) water or (B) garlic extract. Hb was purified from the treated red blood cells and subjected to BioMass analysis. (A) Hb purified from ...
Garlic extract modifies human beta-hemoglobin inside RBCs

The modification of beta-hemoglobin was obtained after incubation of RBCs with raw garlic extract. The result suggests that a compound present in the garlic extract could diffuse (actively or passively) through the plasma membrane and modify the hemoglobin inside the RBCs. In order to demonstrate that hemoglobin is modified inside RBCs, the cells were preincubated with iodoacetamide. Iodoacetamide is a membrane-permeable compound that is known to modify cysteine residues. After incubation with iodoacetamide, garlic extract was added to the preparation. The RBCs were collected and washed, and the hemoglobin molecules were purified. As the control, RBCs were treated with vehicle solution and garlic extract alone. As expected, hemoglobin purified from control samples did not show a change in the molecular mass of the alpha- or beta-chain (Fig. 2A), and the garlic extract-treated samples produced the previously detected mass shift on the beta-chain (Fig. 2B). Conversely, the hemoglobin purified from the RBCs treated with iodoacetamide and garlic extract showed a mass shift of 53 amu (Fig. 2C). The expected change in mass for iodoacetamide-cysteine is 58 amu, 5 mass units more than the calculated mass. The mass deviation could be due to decomposition during the ionization process and/or accuracy of the deconvoluted mass spectrum because incubation with iodoacetamide alone results in the same molecular shift (data not shown). Nevertheless, the results indicate that the hemoglobin beta-chain is modified by a membrane-permeable compound present in garlic extract, which could be blocked by iodoacetamide.

Preparation and treatment of RBCs and hemoglobin purification

Human RBCs were collected with EDTA as anticoagulant, after obtaining informed consent, according to procedures approved by the University of Puerto Rico-Rio Piedras Campus Institutional Review Board (San Juan, PR). The cells were used within 1 week of collection. Prior to study, the RBCs were washed three times by centrifugation with a minimum of a fivefold excess of phosphate-buffered saline (PBS) containing 500 μM diethylenetriaminepentaacetic acid, to chelate extraneous transition metals. RBCs were resuspended to a final hematocrit of about 10%. Deoxygenated RBCs were prepared by extensive cycling of vacuum treatments and argon flushing, in rubber-stoppered 5-mL tubes. Deoxygenation was ascertained spectrophotometrically (i.e., deoxyhemoglobin peak at 555 nm vs. oxyhemoglobin peaks at 540 and 576 nm). Garlic extracts were prepared as previously described.8 In brief, 2–3 g of garlic was ground together in a ceramic mortar and pestle with 2–3 mL of deionized water containing 500 μM diethylenetriaminepentaacetic acid (1 mL/g of garlic) and squeezed through cheesecloth, and the exudates were diluted with PBS containing diethylenetriaminepentaacetic acid (1:10 vol/vol). The garlic extract was aged at least 15 minutes after preparation and was always used within 2 hours. RBCs were incubated with garlic extract (100 μL/mL of RBCs) for 1 hour at room temperature. Iodoacetamide, which permeates through the RBC membrane, was used. Stock iodoacetamide solutions were prepared freshly in PBS containing DPTA and added to RBCs to a final concentration of 10 mM. RBCs were preincubated with iodoacetamide at room temperature for 30 minutes. Excess iodoacetamide was removed by multiple washings of the RBCs with PBS containing DPTA. RBCs were monitored visually and spectrophotometrically during the incubation with garlic extract at room temperature for 1 hour. At appropriate intervals, aliquots of RBC reaction mixtures were removed from the stoppered vials and centrifuged in 1.5-mL Eppendorf tubes. Lysates from washed RBCs were prepared inside the centrifuge tube, 3–5 volumes of cold deionized water containing diethylenetriaminepentaacetic acid were added, and the mixture was then centrifuged at 20,000 g for 5 minutes. The lysates were then spun down (3,000 g) on Sephadex G-25 spin columns equilibrated with 25 mM ammonium bicarbonate. Hemoglobin was collected in the void volume, its concentration was determined, and the preparation was then used for mass spectrometric analysis. For treatment with diallyl disulfide (DADS) (catalog number 32621, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), RBCs (1 mL) were incubated in the presence of 273 mmol of DADS at room temperature for 18 hours. DADS is partly soluble in aqueous solutions. Therefore, the solution containing RBCs and DADS was gently mixed to promote the diffusion of the insoluble compound. After the 18-hour incubation, RBCs were collected, and hemoglobin was purified as explained above.

Protein MS analysis

BioMass analysis
Purified human hemoglobin was diluted in a solution containing acetonitrile:water (50:50 vol/vol) and 0.2% formic acid. The diluted hemoglobin was directly infused into the electrospray ionization source at 1 pmol/μL. The ionization source was set at a spray voltage of 2.0 kV, capillary temperature of 250°C, and capillary voltage of 165 V. The ionized molecules were analyzed in a LTQ mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). The mass spectra were recorded for 2 minutes. The data acquired were then analyzed using the BioMass calculation and deconvolution tool of BioWorks software. The parameters for the BioMass calculation deconvolution were set as follow: enable averaging, enable smoothing (Gaussian; 3), deconvoluted spectrum (12,000–17,000), adduct ion mass [ + proton (+1.008)], and mass step size 0.25 units. The atomic mass obtained from the convoluted mass spectrum was verified manually using the equation (MW + nH+)/n = [MW + (n + 1)H+]/(n + 1), where MW is the molecular weight.

Tandem MS
Purified human hemoglobin (100 pmol) was subjected to trypsin digestion in digestion buffer (40 mM ammonium bicarbonate, 10% acetonitrile, and trypsin [1 μg]) overnight (18 hours) at 37°C. The reaction mixture was dried on a speed vacuum, and the tryptic peptides were resuspended in acetonitrile:water (50:50 vol/vol) containing 0.2% formic acid. The solution containing the tryptic peptides was infused directly into the electrospray ionization source at 1 pmol/μL (spray voltage, 1.5 kV; capillary temperature, 200°C). The ionized peptides were infused into the LTQ mass spectrometer for tandem MS analysis. The peptides were identified by correlating MS-MS spectra with sequences from the National Center for Biotechnology Information nonredundant protein and EST databases using SEQUEST (ThermoFisher) database search algorithms. Only those peptides identified that passed selection filters imposed to the database search were taken into consideration [Xcorr higher than 1.5 (+1), 2.0 (+2) or 2.5 (+3); Delta Score >0.1; 10 or more b and y ions; MS2 intensity of >5 × 10−4; peptide probability >E × 10−2].

Go to:
Results
Garlic extract modifies human beta-hemoglobin

Human RBCs incubated with garlic extract induced the rapid production of H2S. The production of H2S is derived from the decomposition of allicin. Allicin is the main organosulfur compound found in garlic, and it is produced from the amino acid alliin.11 The production of allicin from the decomposition of alliin depends on the enzyme alliinase, which is activated when garlic is crushed. Allicin by-products such as diallyl sulfide, DADS, and diallyl trisulfide are rapidly formed in aqueous solutions. Of these three allicin by-products, DADS is the most prevalent (66%) in comparison to the other sulfides produced.11 These organosulfur compounds could modify the reactive cysteine residues found in the alpha-chain (position 104) and beta-chain (positions 93 and 112) of the hemoglobin molecule. In order to determine if human hemoglobin is modified by garlic extract, freshly collected and prepared human RBCs were incubated with fresh garlic extract. After incubation in an argon atmosphere, RBCs were collected by centrifugation and washed. As negative control, hemoglobin was extracted from untreated RBCs. The purified hemoglobin molecules were subjected to BioMass analyses. The mass spectrum of hemoglobin purified from control-treated RBCs showed the two major subunits of the hemoglobin molecule, the alpha- (15,130.5) and beta- (15,870.5) chains, as expected (Fig. 1A). Interestingly, however, the hemoglobin purified from the garlic-treated RBCs showed a mass shift of the peak representing the beta-chain but not the alpha-chain (Fig. 1B). The detected mass shift was, approximately, 71 atomic mass units (amu). The result indicates that a compound present in garlic extract can modify intraerythrocytic human hemoglobin, specifically the beta-chain.

FIG. 1.
FIG. 1.
Garlic extract modifies human beta-hemoglobin (Hb). Freshly prepared human red blood cells were treated with either (A) water or (B) garlic extract. Hb was purified from the treated red blood cells and subjected to BioMass analysis. (A) Hb purified from ...
Garlic extract modifies human beta-hemoglobin inside RBCs

The modification of beta-hemoglobin was obtained after incubation of RBCs with raw garlic extract. The result suggests that a compound present in the garlic extract could diffuse (actively or passively) through the plasma membrane and modify the hemoglobin inside the RBCs. In order to demonstrate that hemoglobin is modified inside RBCs, the cells were preincubated with iodoacetamide. Iodoacetamide is a membrane-permeable compound that is known to modify cysteine residues. After incubation with iodoacetamide, garlic extract was added to the preparation. The RBCs were collected and washed, and the hemoglobin molecules were purified. As the control, RBCs were treated with vehicle solution and garlic extract alone. As expected, hemoglobin purified from control samples did not show a change in the molecular mass of the alpha- or beta-chain (Fig. 2A), and the garlic extract-treated samples produced the previously detected mass shift on the beta-chain (Fig. 2B). Conversely, the hemoglobin purified from the RBCs treated with iodoacetamide and garlic extract showed a mass shift of 53 amu (Fig. 2C). The expected change in mass for iodoacetamide-cysteine is 58 amu, 5 mass units more than the calculated mass. The mass deviation could be due to decomposition during the ionization process and/or accuracy of the deconvoluted mass spectrum because incubation with iodoacetamide alone results in the same molecular shift (data not shown). Nevertheless, the results indicate that the hemoglobin beta-chain is modified by a membrane-permeable compound present in garlic extract, which could be blocked by iodoacetamide.

5000/5000

จาก: อังกฤษ

เป็น: ไทย

ผลลัพธ์ (ไทย) 1: [สำเนา]

คัดลอก!

เตรียมการและการรักษาของ RBCs และฟอกฮีโมโกลบินRBCs มนุษย์ถูกเก็บรวบรวม ด้วย EDTA เป็น anticoagulant หลังจากได้รับแจ้งความยินยอม ตามขั้นตอนที่มหาวิทยาลัยเปอร์โตริโกริโอ Piedras วิทยาเขตสถาบันทบทวนคณะกรรมการธนาคาร (San Juan, PR) เซลล์ถูกใช้ภายใน 1 สัปดาห์ของคอลเลกชัน ก่อนที่จะศึกษา RBCs ถูกล้างสามครั้ง โดย centrifugation กับต่ำสุดของการเกิน fivefold ของ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) ประกอบด้วย 500 μM diethylenetriaminepentaacetic กรด การ chelate โลหะเปลี่ยนไม่ RBCs ที่ resuspended ให้ hematocrit สุดท้ายประมาณ 10% Deoxygenated RBCs ได้เตรียม โดยการปั่นจักรยานอย่างละเอียดและอาร์กอนลบ ในยาง stoppered 5 mL หลอดสูญญากาศ Deoxygenation เป็น ascertained spectrophotometrically (เช่น deoxyhemoglobin สูงสุดที่ 555 nm เทียบกับยอด oxyhemoglobin ที่ 576 และ 540 nm) สารสกัดจากกระเทียมเตรียมไว้เป็นก่อนหน้านี้ described.8 สังเขป 2 – 3 กรัมกระเทียมถูกพื้นกันในเป็นเซรามิคโกร่ง ด้วย 2 – 3 mL ประกอบด้วยกรด diethylenetriaminepentaacetic μM 500 (1 mL/g กระเทียม) น้ำ deionized และคั้นผ่าน cheesecloth และ exudates ถูกผสมกับ PBS ประกอบด้วยกรด diethylenetriaminepentaacetic (1:10 vol/vol) สารสกัดจากกระเทียมมีอายุอย่างน้อย 15 นาทีหลังจากเตรียม และมักจะใช้ภายใน 2 ชั่วโมง RBCs ที่ incubated สกัดจากกระเทียม (100 μL/mL ของ RBCs) 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ใช้ Iodoacetamide ซึ่งบริเวณห่างออกไปผ่านเมมเบรน RBC โซลูชั่น iodoacetamide หุ้นถูกเตรียมสดใน PBS ที่ประกอบด้วย DPTA และเพิ่มการ RBCs เข้มข้นสุดท้ายของ 10 มม. RBCs ที่ preincubated กับ iodoacetamide ที่อุณหภูมิห้อง 30 นาที Iodoacetamide ส่วนเกินถูกเอาออก โดย washings หลายของ RBCs ด้วย PBS ที่ประกอบด้วย DPTA RBCs ตรวจสอบเห็น และ spectrophotometrically ในระหว่างการบ่มด้วยกระเทียมสกัดที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง ในช่วงเวลาที่เหมาะสม aliquots ของน้ำยาผสมปฏิกิริยา RBC ถูกเอาออกจาก stoppered vials และ centrifuged ในหลอด Eppendorf 1.5 mL Lysates จาก RBCs หินเตรียมไว้ภายในเครื่องหมุนเหวี่ยงท่อ เพิ่มปริมาณ 3 – 5 ประกอบด้วยกรด diethylenetriaminepentaacetic น้ำ deionized และส่วนผสมแล้วได้ถูก centrifuged ที่ 20000 g 5 นาที แล้ว lysates ถูกปั่นลง (3000 g) คอลัมน์หมุน Sephadex G-25 equilibrated กับแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 25 มม. ฮีโมโกลบินรวบรวมปริมาณโมฆะ กำหนดความเข้มข้นของ และเตรียมถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์จำนวนมาก spectrometric การรักษาด้วย diallyl ไดซัลไฟด์ (DADS) (แค็ตตาล็อกเลข 32621 ซิก Aldrich, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา), RBCs (1 มล.) ได้จัด incubated ในต่อหน้าของ mmol 273 ของ DADS อุณหภูมิห้อง 18 ชั่วโมง DADS มีบางส่วนละลายในโซลูชั่นอควี ดังนั้น โซลูชัน RBCs และ DADS ถูกเบา ๆ ผสมกันเพื่อส่งเสริมการแพร่ของสารประกอบไม่ละลายน้ำ หลังจากบ่ม 18 ชั่วโมง RBCs ถูกเก็บรวบรวม และฮีโมโกลบินที่บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นวิเคราะห์โปรตีน MSการวิเคราะห์ชีวมวลฮีโมโกลบินมนุษย์บริสุทธิ์ถูกทำให้เจือจางในโซลูชันที่ประกอบด้วย acetonitrile:water (คนละครึ่ง vol/vol) และกรด 0.2% ฮีโมโกลบินแตกออกที่ลงตัวโดยตรงเป็นต้น ionization วิธีพ่นละอองไฟฟ้าที่ 1 pmol/μL ตั้งต้น ionization ในสเปรย์แรงดันของ 2.0 kV เส้นเลือดฝอยอุณหภูมิ 250° C และ 165 V แรงเส้นเลือดฝอย โมเลกุล ionized ได้วิเคราะห์ในแบบ LTQ โดยรวมสเปกโตรมิเตอร์ (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์) แรมสเป็คตรามวลถูกบันทึกใน 2 นาที ได้ข้อมูลมาแล้ววิเคราะห์โดยใช้ชีวมวลคำนวณและ deconvolution มือของซอฟแวร์ BioWorks มีการตั้งค่าพารามิเตอร์สำหรับ deconvolution คำนวณชีวมวลดัง: ใช้หาค่าเฉลี่ย การเปิดใช้งานการปรับให้เรียบ (Gaussian; 3), สเปกตรัม deconvoluted (12000 – 17,000), adduct ไอออนมวล [+ โปรตอน (+1.008)], และขั้นตอนโดยรวมขนาด 0.25 หน่วย มวลอะตอมที่ได้รับจากคลื่นใหญ่คดเคี้ยวถูกตรวจสอบด้วยตนเองโดยใช้ /n%1 /n สมการ (MW + เอ็น +) = [MW + (n + 1) H +] / (n + 1), น้ำหนักโมเลกุล MWMS ตัวตามกันไปฮีโมโกลบินมนุษย์บริสุทธิ์ (100 pmol) ถูกยัดเยียดให้ทริปซินย่อยอาหารในบัฟเฟอร์การย่อยอาหาร (40 มม.แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต acetonitrile 10% และทริปซิน [1 μg]) นอน (18 ชั่วโมง) ที่ 37 องศาเซลเซียส ผสมปฏิกิริยาถูกอบแห้งในสุญญากาศความเร็ว และเปปไทด์ tryptic ถูก resuspended ใน acetonitrile:water (คนละครึ่ง vol/vol) ประกอบด้วยกรด 0.2% โซลูชันที่ประกอบด้วยเปปไทด์ tryptic ถูกผสมผสานลงต้น ionization วิธีพ่นละอองไฟฟ้าที่ 1 pmol/μL (สเปรย์แรงดัน 1.5 kV อุณหภูมิเส้นเลือดฝอย 200° C) เปปไทด์ ionized ได้ผสมผสานเข้าไปในสเปกโตรมิเตอร์ของมวล LTQ สำหรับการวิเคราะห์ MS ตัวตามกันไป เปปไทด์ได้ระบุ โดยกำลังรวบรวมแรมสเป็คตรา MS MS มีลำดับจากแห่งชาติศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ nonredundant โปรตีนและฐานข้อมูล EST โดยใช้อัลกอริทึมค้นหาฐานข้อมูล SEQUEST (ThermoFisher) ระบุเท่านั้นเปปไทด์ที่ผ่านการเลือกตัวกรองที่กำหนดเพื่อค้นหาฐานข้อมูลถูกนำมาพิจารณา [สูงกว่า 1.5 (+ 1), (+ 2) 2.0 หรือ 2.5 (+ 3); Xcorr เดลต้าคะแนน > 0.1 อย่าง น้อย 10 b และ y กัน MS2 ความเข้มของ > 5 × 10−4 ความน่าเป็นเพปไทด์ > E × 10−2]ลุยเลย:ผลลัพธ์สารสกัดจากกระเทียมปรับเปลี่ยนเบต้าฮีโมโกลบินมนุษย์มนุษย์ RBCs incubated สกัดจากกระเทียมทำให้เกิดการผลิตไข่เน่าอย่างรวดเร็ว การผลิตไข่เน่าจะมาจากการเน่าของ allicin Allicin หลัก organosulfur ผสมพบในกระเทียม และผลิตจาก alliin.11 กรดอะมิโนที่ผลิตจากการเน่าของ alliin allicin พึ่ง alliinase เอนไซม์ ซึ่งถูกเรียกใช้เมื่อบดกระเทียม สินค้าพลอย Allicin เช่น trisulfide ซัลไฟด์ DADS และ diallyl diallyl จะก่อตั้งขึ้นในโซลูชั่นอควีอย่างรวดเร็ว ของเหล่านี้สินค้าพลอย allicin สามได้ DADS ได้แพร่หลายมากที่สุด (66%) เมื่อเปรียบเทียบกับอื่น ๆ sulfides produced.11 organosulfur สารเหล่านี้สามารถปรับเปลี่ยนตก cysteine ปฏิกิริยาพบอัลฟาโซ่ (ตำแหน่ง 104) และเบต้าโซ่ (ตำแหน่ง 93 และ 112) ของโมเลกุลฮีโมโกลบิน เพื่อกำหนดถ้าฮีโมโกลบินมนุษย์ถูกปรับเปลี่ยน โดยสารสกัดจากกระเทียม RBCs มนุษย์สดรวบรวม และเตรียมถูก incubated สกัดจากกระเทียมสด หลังจากฟักตัวในบรรยากาศอาร์กอน RBCs ถูกรวบรวม โดย centrifugation และล้าง ลบตัวควบคุม ฮีโมโกลบินถูกสกัดจาก RBCs ไม่ถูกรักษา โมเลกุลของฮีโมโกลบินที่บริสุทธิ์ถูกต้องวิเคราะห์ชีวมวล คลื่นมวลของฮีโมโกลบินบริสุทธิ์จาก RBCs ถือว่าควบคุมพบ subunits หลักสองของโมเลกุลฮีโมโกลบิน อัลฟา (15,130.5) และเบต้า - โซ่ (15,870.5) ตามที่คาดไว้ (Fig. 1A) เป็นเรื่องน่าสนใจ แต่ ฮีโมโกลบินที่บริสุทธิ์จาก RBCs รักษากระเทียมพบว่าโดยรวมกะของสูงแทนสายเบต้าแต่ไม่อัลฟาห่วงโซ่ (Fig. 1B) กะโดยรวมพบได้ ประมาณ 71 หน่วยมวลอะตอม (แม่น้ำอามู) ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า ปัจจุบันผสมในสารสกัดกระเทียมสามารถปรับเปลี่ยน intraerythrocytic มนุษย์ฮีโมโกลบิน โดยเฉพาะเบต้าสายFIG. 1FIG. 1สารสกัดจากกระเทียมปรับเปลี่ยนมนุษย์เบต้าฮีโมโกลบิน (Hb) เซลล์เม็ดเลือดแดงมนุษย์ลิ้มได้รับการรักษา (A) น้ำหรือ (ข) กระเทียมสกัดจาก Hb บริสุทธิ์จากเซลล์เม็ดเลือดแดงบำบัด และการวิเคราะห์ของชีวมวล (A) Hb บริสุทธิ์จาก...สารสกัดจากกระเทียมปรับเปลี่ยนเบต้าฮีโมโกลบินมนุษย์ภายใน RBCsThe modification of beta-hemoglobin was obtained after incubation of RBCs with raw garlic extract. The result suggests that a compound present in the garlic extract could diffuse (actively or passively) through the plasma membrane and modify the hemoglobin inside the RBCs. In order to demonstrate that hemoglobin is modified inside RBCs, the cells were preincubated with iodoacetamide. Iodoacetamide is a membrane-permeable compound that is known to modify cysteine residues. After incubation with iodoacetamide, garlic extract was added to the preparation. The RBCs were collected and washed, and the hemoglobin molecules were purified. As the control, RBCs were treated with vehicle solution and garlic extract alone. As expected, hemoglobin purified from control samples did not show a change in the molecular mass of the alpha- or beta-chain (Fig. 2A), and the garlic extract-treated samples produced the previously detected mass shift on the beta-chain (Fig. 2B). Conversely, the hemoglobin purified from the RBCs treated with iodoacetamide and garlic extract showed a mass shift of 53 amu (Fig. 2C). The expected change in mass for iodoacetamide-cysteine is 58 amu, 5 mass units more than the calculated mass. The mass deviation could be due to decomposition during the ionization process and/or accuracy of the deconvoluted mass spectrum because incubation with iodoacetamide alone results in the same molecular shift (data not shown). Nevertheless, the results indicate that the hemoglobin beta-chain is modified by a membrane-permeable compound present in garlic extract, which could be blocked by iodoacetamide.

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:[สำเนา]

คัดลอก!

การเตรียมและการรักษาของเม็ดเลือดแดงและการทำให้บริสุทธิ์ฮีโมโกลเม็ดเลือดแดงของมนุษย์ที่ถูกเก็บรวบรวมด้วย EDTA เป็นสารกันเลือดแข็งหลังจากการได้รับความยินยอมตามขั้นตอนที่ได้รับอนุมัติจากมหาวิทยาลัยเปอร์โตริโก-แดริโอวิทยาเขตคณะกรรมการสถาบัน (San Juan, PR) เซลล์ถูกนำมาใช้ภายใน 1 สัปดาห์ของการเก็บ ก่อนที่จะมีการศึกษาเม็ดเลือดแดงถูกล้างสามครั้งโดยการหมุนเหวี่ยงกับต่ำสุดของส่วนเกินห้าเท่าของเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) ที่มีกรด 500 ไมครอน diethylenetriaminepentaacetic เพื่อคีเลตโลหะการเปลี่ยนแปลงภายนอก เม็ดเลือดแดงถูก resuspended เพื่อฮีสุดท้ายของประมาณ 10% เม็ดเลือดแดง deoxygenated ถูกจัดทำขึ้นโดยการขี่จักรยานที่กว้างขวางของการรักษาสูญญากาศและล้างอาร์กอนในยางจุกหลอด 5 มิลลิลิตร ได้รับการตรวจสอบ Deoxygenation spectrophotometrically (เช่น deoxyhemoglobin สูงสุดที่ 555 นาโนเมตรเทียบกับยอด oxyhemoglobin ที่ 540 และ 576 นาโนเมตร) สารสกัดกระเทียมที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ described.8 ในช่วงสั้น ๆ 2-3 กรัมกระเทียมถูกบดเข้าด้วยกันในครกสากเซรามิกและ 2-3 มิลลิลิตรน้ำปราศจากไอออนที่มี 500 ไมครอนกรด diethylenetriaminepentaacetic (1 มิลลิลิตร / กรัมกระเทียม) และบีบ ผ่านผ้าและ exudates ถูกเจือจางด้วยพีบีเอสที่มีกรด diethylenetriaminepentaacetic (01:10 ปริมาตร / ปริมาตร) สารสกัดจากกระเทียมอายุอย่างน้อย 15 นาทีหลังจากการเตรียมการและถูกนำมาใช้เสมอภายใน 2 ชั่วโมง เม็ดเลือดแดงถูกบ่มด้วยสารสกัดจากกระเทียม (100 ไมโครลิตร / มิลลิลิตรของเม็ดเลือดแดง) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง Iodoacetamide ซึ่งแทรกซึมผ่านเมมเบรน RBC ถูกนำมาใช้ หุ้นโซลูชั่น iodoacetamide ถูกปรุงสดใหม่ในพีบีเอสที่มี DPTA และเพิ่มเข้าไปในเม็ดเลือดแดงจะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 10 มิลลิ เม็ดเลือดแดงถูก preincubated กับ iodoacetamide ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที iodoacetamide ส่วนเกินถูกลบออกโดยซักหลายเม็ดเลือดแดงที่มีพีบีเอสที่มี DPTA เม็ดเลือดแดงถูกตรวจสอบสายตาและ spectrophotometrically ในระหว่างการบ่มด้วยสารสกัดกระเทียมที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในช่วงเวลาที่เหมาะสม aliquots ของผสมปฏิกิริยา RBC ถูกถอดออกจากขวดจุกและปั่นใน 1.5 มิลลิลิตรหลอด Eppendorf lysates จากเม็ดเลือดแดงได้เตรียมล้างภายในหลอด centrifuge 3-5 ปริมาณน้ำปราศจากไอออนเย็นที่มีกรด diethylenetriaminepentaacetic เสริมและส่วนผสมที่ถูกปั่นแล้วที่ 20,000 กรัมเป็นเวลา 5 นาที lysates ถูกปั่นแล้วลง (3,000 กรัม) ใน Sephadex G-25 คอลัมน์หมุน equilibrated 25 มิลลิแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต เฮโมโกลบินถูกเก็บในปริมาณโมฆะความเข้มข้นที่ถูกกำหนดและการเตรียมถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์มวล spectrometric สำหรับการรักษาด้วยซัลไฟด์ diallyl (DADS) (ชื่อหมายเลข 32621, Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์, MO, USA) เม็ดเลือดแดง (1 มิลลิลิตร) ถูกบ่มในการปรากฏตัวของ 273 มิลลิโมลของ DADS ที่อุณหภูมิห้องนาน 18 ชั่วโมง DADS เป็นส่วนหนึ่งในการแก้ปัญหาที่ละลายในน้ำ ดังนั้นการแก้ปัญหาที่มีเม็ดเลือดแดงและพ่อผสมเบา ๆ เพื่อส่งเสริมการแพร่กระจายของสารที่ไม่ละลายน้ำ หลังจากบ่ม 18 ชั่วโมงเม็ดเลือดแดงที่ถูกเก็บรวบรวมและฮีโมโกลบริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น. โปรตีน MS วิเคราะห์การวิเคราะห์ชีวมวลมนุษย์ฮีโมโกลบริสุทธิ์ถูกเจือจางในสารละลายที่มี acetonitrile: น้ำ (50:50 ปริมาตร / ปริมาตร) และ 0.2% กรด ฮีโมโกลถูกปรับลด infused โดยตรงในแหล่ง electrospray ไอออนไนซ์วันที่ 1 pmol / ไมโครลิตร แหล่งที่มาของไอออนไนซ์ตั้งอยู่ที่แรงดันสเปรย์ 2.0 กิโลโวลต์อุณหภูมิฝอย 250 ° C และแรงดันของเส้นเลือดฝอย 165 โวลต์โมเลกุลแตกตัวเป็นไอออนวิเคราะห์ในสเปกโตรมิเตอร์มวล LTQ (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) สเปกตรัมมวลที่ถูกบันทึกไว้เป็นเวลา 2 นาที ข้อมูลที่ได้มานั้นถูกวิเคราะห์โดยใช้การคำนวณชีวมวลและเครื่องมือ deconvolution ของซอฟต์แวร์ BioWorks พารามิเตอร์สำหรับการคำนวณ deconvolution ชีวมวลที่ตั้งดังนี้ค่าเฉลี่ยการใช้งานให้เปิดใช้งานเรียบ (เสียน 3) สเปกตรัม deconvoluted (12,000-17,000) ไอออนมวลดึงเข้าหา [โปรตอน + (1.008)] และขนาดขั้นตอนมวล 0.25 หน่วย มวลอะตอมที่ได้รับจากสเปกตรัมมวลซับซ้อนถูกตรวจสอบด้วยตนเองโดยใช้สมการ (MW + nH +) / n = [เมกะวัตต์ + (n + 1) H +] / (1 + n) ซึ่งเมกะวัตต์เป็นน้ำหนักโมเลกุล. ตีคู่ MS บริสุทธิ์ ฮีโมโกลของมนุษย์ (100 pmol) ได้ภายใต้การย่อยอาหาร trypsin ในบัฟเฟอร์การย่อยอาหาร (40 มิลลิแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต, acetonitrile 10% และ trypsin [1 ไมโครกรัม]) ในชั่วข้ามคืน (18 ชั่วโมง) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ผสมปฏิกิริยาถูกแห้งสูญญากาศในความเร็วและเปปไทด์ tryptic ถูก resuspended ใน acetonitrile: น้ำ (50:50 ปริมาตร / ปริมาตร) ที่มี 0.2% กรด วิธีการแก้ปัญหาที่มีเปปไทด์ tryptic ถูก infused โดยตรงในแหล่ง electrospray ไอออนไนซ์วันที่ 1 pmol / ไมโครลิตร (แรงดันสเปรย์ 1.5 กิโลโวลต์อุณหภูมิฝอย 200 ° C) เปปไทด์บริสุทธิ์ถูกผสมเข้าไปในสเปกโตรมิเตอร์มวล LTQ สำหรับการวิเคราะห์ควบคู่ MS เปปไทด์ที่ถูกระบุโดยเทียบเคียงสเปกตรัม MS-MS ที่ลำดับจากแห่งชาติศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพโปรตีน nonredundant และฐานข้อมูล EST ใช้ SEQUEST (ThermoFisher) ขั้นตอนวิธีการค้นหาฐานข้อมูล เฉพาะผู้ที่ระบุเปปไทด์ที่ผ่านการกรองการเลือกกำหนดที่จะค้นหาฐานข้อมูลถูกนำเข้าสู่การพิจารณา [Xcorr สูงกว่า 1.5 (1) 2.0 (2) หรือ 2.5 (3) คะแนนเดลต้า> 0.1; 10 หรือมากกว่าไอออนข y และ; ความเข้มของ MS2> 5 × 10-4; ความน่าจะเป็นเปปไทด์> E × 10-2]. ไปที่: ผลของสารสกัดกระเทียมปรับเปลี่ยนเบต้าฮีโมโกลมนุษย์เม็ดเลือดแดงของมนุษย์บ่มด้วยสารสกัดจากกระเทียมเหนี่ยวนำให้เกิดการผลิตอย่างรวดเร็วของ H2S การผลิตของ H2S ที่ได้มาจากการสลายตัวของอัลลิซิ allicin เป็นสาร organosulfur หลักที่พบในกระเทียมและจะมีการผลิตจากกรดอะมิโน alliin.11 การผลิตของอัลลิซิจากการสลายตัวของ alliin ขึ้นอยู่กับ alliinase เอนไซม์ซึ่งจะทำงานเมื่อกระเทียมบด allicin โดยผลิตภัณฑ์เช่นซัลไฟด์ diallyl, DADS และ trisulfide diallyl จะเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วในการแก้ปัญหาน้ำ ของทั้งสาม allicin โดยผลิตภัณฑ์ DADS เป็นที่แพร่หลายมากที่สุด (66%) เมื่อเทียบกับซัลไฟด์อื่น ๆ produced.11 สารเหล่านี้สามารถปรับเปลี่ยน organosulfur cysteine ตกค้างปฏิกิริยาที่พบในอัลฟาโซ่ (104 ตำแหน่ง) และเบต้าโซ่ ( ตำแหน่ง 93 และ 112) ของโมเลกุลฮีโมโกล เพื่อที่จะตรวจสอบว่าฮีโมโกลมนุษย์มีการแก้ไขโดยสารสกัดจากกระเทียมสดที่เก็บรวบรวมและเม็ดเลือดแดงของมนุษย์เตรียมที่ถูกบ่มด้วยสารสกัดจากกระเทียมสด หลังจากการบ่มในบรรยากาศอาร์กอนเม็ดเลือดแดงถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและล้าง การควบคุมเชิงลบฮีโมโกลถูกสกัดจากเม็ดเลือดแดงได้รับการรักษา โมเลกุลของฮีโมโกลบริสุทธิ์ถูกยัดเยียดให้การวิเคราะห์ชีวมวล สเปกตรัมมวลของฮีโมโกลบริสุทธิ์จากเม็ดเลือดแดงควบคุมที่ได้รับแสดงให้เห็นว่าทั้งสองหน่วยย่อยที่สำคัญของฮีโมโกลโมเลกุล, อัลฟา (15,130.5) และ beta- (15,870.5) โซ่เป็นไปตามคาด (รูป. 1A) ที่น่าสนใจ แต่ฮีโมโกลบริสุทธิ์จากเม็ดเลือดแดงกระเทียมที่ได้รับแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงมวลของยอดเขาที่เป็นตัวแทนของเบต้า แต่ไม่ห่วงโซ่อัลฟาโซ่ (รูป. 1B) การเปลี่ยนแปลงมวลตรวจพบได้ประมาณ 71 หน่วยมวลอะตอม (มวลอะตอม) ผลที่ได้แสดงให้เห็นว่าปัจจุบันสารในสารสกัดจากกระเทียมสามารถปรับเปลี่ยน intraerythrocytic ฮีโมโกลของมนุษย์โดยเฉพาะเบต้าโซ่. มะเดื่อ 1. มะเดื่อ 1. สารสกัดกระเทียมปรับเปลี่ยนเบต้าฮีโมโกลของมนุษย์ (Hb) สดที่เตรียมมนุษย์เซลล์เม็ดเลือดแดงได้รับการรักษาด้วย (A) น้ำหรือ (ข) สารสกัดจากกระเทียม Hb บริสุทธิ์จากการรักษาเซลล์เม็ดเลือดแดงและอยู่ภายใต้การวิเคราะห์ชีวมวล (A) Hb บริสุทธิ์จาก ... สารสกัดกระเทียมปรับเปลี่ยนเบต้าฮีโมโกลภายในเม็ดเลือดแดงของมนุษย์การปรับเปลี่ยนของเบต้าฮีโมโกลที่ได้รับหลังจากการบ่มของเม็ดเลือดแดงด้วยสารสกัดจากกระเทียมดิบ ผลที่ได้แสดงให้เห็นว่าปัจจุบันสารในสารสกัดจากกระเทียมสามารถกระจาย (แข็งขันหรือเฉยๆ) ผ่านเยื่อหุ้มและปรับเปลี่ยนฮีโมโกลภายในเม็ดเลือดแดง เพื่อที่จะแสดงให้เห็นว่าฮีโมโกลที่มีการแก้ไขภายในเม็ดเลือดแดงเซลล์ถูก preincubated กับ iodoacetamide Iodoacetamide เป็นสารดูดซึมเมมเบรนที่เป็นที่รู้จักในการปรับเปลี่ยน cysteine ตกค้าง หลังจากการบ่มด้วย iodoacetamide สารสกัดกระเทียมถูกบันทึกอยู่ในการเตรียมความพร้อม เม็ดเลือดแดงถูกเก็บรวบรวมและล้างและโมเลกุลของฮีโมโกลบริสุทธิ์ ในฐานะที่ควบคุมเม็ดเลือดแดงได้รับการรักษาด้วยวิธีการแก้ปัญหารถและสารสกัดจากกระเทียมเพียงอย่างเดียว เป็นที่คาดหวังฮีโมโกลบริสุทธิ์จากตัวอย่างควบคุมไม่ได้แสดงการเปลี่ยนแปลงในมวลโมเลกุลของอัลฟาหรือเบต้าโซ่ (รูป. 2A) และสารสกัดจากกระเทียมตัวอย่างที่ได้รับการผลิตที่ตรวจพบก่อนหน้านี้การเปลี่ยนแปลงมวลในเบต้าโซ่ ( รูปที่. 2B) ตรงกันข้ามฮีโมโกลบริสุทธิ์จากเม็ดเลือดแดงรับการรักษาด้วย iodoacetamide และกระเทียมสารสกัดที่แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงมวลของมวลอะตอม 53 (รูป. 2C) คาดว่าการเปลี่ยนแปลงในมวล iodoacetamide-cysteine เป็น 58 Amu, 5 หน่วยมวลมากกว่ามวลคำนวณ เบี่ยงเบนมวลอาจเกิดจากการสลายตัวในระหว่างกระบวนการไอออนไนซ์และ / หรือความถูกต้องของสเปกตรัมมวล deconvoluted เพราะการบ่มด้วย iodoacetamide ผลเพียงอย่างเดียวในการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลเดียวกัน (ไม่ได้แสดงข้อมูล) อย่างไรก็ตามผลการศึกษาพบว่าฮีโมโกลเบต้าโซ่มีการแก้ไขโดยปัจจุบันสารเมมเบรนซึมเข้าไปในสารสกัดจากกระเทียมซึ่งอาจจะถูกบล็อกโดย iodoacetamide

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:[สำเนา]

คัดลอก!

พ่อเป็นที่แพร่หลายมากที่สุด ( 66% ) ในการเปรียบเทียบกับ อื่น ๆสารประกอบซัลไฟด์ produced.11 แกโนซัลเฟอร์เหล่านี้สามารถปรับเปลี่ยนเป็นกรดอะมิโนที่พบตกค้างในอัลฟาโซ่ ( ตำแหน่ง 104 ) และโซ่เบต้า ( ตำแหน่งและ 112 ) ของฮีโมโกลบิน โมเลกุล เพื่อตรวจสอบว่า ฮีโมโกลบินของมนุษย์ดัดแปลง โดย สารสกัดกระเทียมการเตรียมการและการรักษาและบำบัดน้ำเสีย rbcs

ฮีโมโกลบินของมนุษย์ rbcs วัตถุประสงค์ EDTA เป็นเลือดหลังจากได้รับความยินยอมตามขั้นตอนการอนุมัติจากมหาวิทยาลัยเปอร์โตริโก Rio Piedras วิทยาเขตสถาบันคณะกรรมการตรวจสอบ ( San Juan , PR ) เซลล์ที่ใช้ภายใน 1 สัปดาห์ของคอลเลกชัน ก่อนที่จะศึกษาการ rbcs ได้ซักสามครั้งโดยการเหวี่ยงแยกกับต่ำสุดของส่วนเกินของเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์รับ ( PBS ) ที่ประกอบด้วย 500 μ M diethylenetriaminepentaacetic กรด , คีเลตไม่เกี่ยวข้องโลหะทรานซิชัน . rbcs เป็น resuspended ให้ก่อนสุดท้ายประมาณ 10 % deoxygenated rbcs เตรียมจักรยานที่กว้างขวางของการรักษาสิวและอาร์กอน ฟลัชชิงในยาง stoppered 5-ml หลอด คือการใช้นี้ ( เช่น deoxyhemoglobin สูงสุดที่ 555 nm และ oxyhemoglobin ยอด 540 และเป็น nm ) สารสกัดจากกระเทียมที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ ในช่วงสั้น ๆ2 – 3 กรัมกระเทียมถูกพื้นดินด้วยกันในครกและสากด้วยเซรามิก 2 – 3 มิลลิลิตรคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำที่มี 500 μ M diethylenetriaminepentaacetic acid ( 1 มิลลิลิตร / กรัมกระเทียม ) และบีบผ่านผ้า และสารที่หลั่งถูกเจือจางด้วย PBS ที่มี diethylenetriaminepentaacetic acid ( 1 : 10 Vol / Vol )กระเทียมสกัดคืออายุอย่างน้อย 15 นาทีหลังจากการเตรียมและมักจะใช้ภายใน 2 ชั่วโมง rbcs ถูกบ่มด้วยสารสกัดกระเทียม ( 100 μ L / มิลลิลิตร rbcs ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง iodoacetamide ซึ่งแทรกซึมผ่านเยื่อหุ้มเม็ดเลือดแดง คือใช้ หุ้น iodoacetamide โซลูชั่นเตรียมสดใน PBS ที่มี dpta และเพิ่ม rbcs กับความเข้มข้นสุดท้าย 10 มิลลิเมตรrbcs เป็น preincubated กับ iodoacetamide ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที iodoacetamide ส่วนเกินจะถูกลบออกโดยหลาย washings ของ rbcs กับ PBS ที่มี dpta . rbcs ตรวจวัดสายตาและนี้ในระหว่างการบ่มด้วยกระเทียมสกัดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในช่วงเวลาที่เหมาะสมเฉยๆของ RBC ปฏิกิริยาผสมถูกเอาออกจากขวด stoppered ไฟฟ้าใน 1.5-ml เพนดอร์ฟหลอด lysates จากล้าง rbcs เตรียมภายในหลอด centrifuge 3 – 5 เล่ม เย็นคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำที่มี diethylenetriaminepentaacetic กรดเพิ่มขึ้น และส่วนผสมก็ระดับที่ 20 , 000 G สำหรับ 5 นาที การ lysates แล้วปั่นลงมา ( 3000 กรัม ) ในคอลัมน์ Sephadex g-25 ปั่น equilibrated 25 มม. แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต ฮีโมโกลบิน เก็บข้อมูลในช่องว่างของปริมาณความเข้มข้นที่กำหนด และการเตรียมการใช้สำหรับการวิเคราะห์ความมวล สำหรับการรักษาด้วยไดอัลลิลซัลไฟด์ ( พ่อ ) ( หมายเลขบัญชีรายชื่อ 32621 ซิกม่า Aldrich , St . Louis , MO , USA )การวิเคราะห์ปริมาณฮีโมโกลบินมนุษย์
บริสุทธิ์เจือจางในสารละลายที่มีไนน้ำ ( 50 : 50 Vol / Vol ) และ 0.2% กรด . ฮีโมโกลบินอยู่ตรงผสมเจือจางในวิธีพ่นละอองไฟฟ้าไอแหล่งที่ 1 pmol / μล. ไอที่มาตั้งไว้ที่สเปรย์แรงดัน 2.0 KV หลอดเลือดฝอยที่อุณหภูมิ 250 องศา C และ C แรงดันไฟฟ้า 165 โวลต์rbcs ( 1 มิลลิลิตรบ่มในการแสดงตนของ 273 มิลลิโมลของพ่อที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 18 ชั่วโมง พ่อเป็นละลายในสารละลาย . ดังนั้นสารละลายที่มี rbcs และพ่อก็ค่อยๆผสมเพื่อส่งเสริมการแพร่กระจายของสารประกอบที่ละลายน้ำ หลังจาก 18 ชั่วโมง ระยะเวลาในการเก็บรวบรวม rbcs และฮีโมโกลบินบริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น .

นางสาวการวิเคราะห์โปรตีนการประจุโมเลกุลวิเคราะห์ใน ltq แมสสเปกโตรมิเตอร์ ( เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ) มวลสเปกตรัมได้ถูกบันทึกไว้สำหรับ 2 นาทีที่ . ข้อมูลที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้ชีวมวลและการคำนวณ bioworks ธีค โวลูชั่นของเครื่องมือซอฟต์แวร์ พารามิเตอร์สำหรับการคำนวณมวล ธีค โวลูชั่นกำหนดดังนี้ ให้เฉลี่ยให้เรียบ ( ) ; 3 )deconvoluted สเปกตรัม ( 12 , 000 – 12 , 000 ) , ปุ่มตัวเลือกไอออนมวล [ โปรตอน ( 1.008 ) ] และขั้นตอนมวลขนาด 0.25 หน่วย มวลอะตอมหาได้จากสเปกตรัมมวล convoluted ถูกยืนยันด้วยตนเองโดยใช้สมการ ( MW NH ) / N = [ MW ( N 1 ) H ] / ( N 1 ) ซึ่งบริษัทมีน้ำหนักโมเลกุล

ตีคู่นางสาวโซลูชั่นที่ประกอบด้วยเปปไทด์อาหารเป็น infused โดยตรงเป็นวิธีพ่นละอองไฟฟ้ามีประจุแหล่งที่ 1 pmol / μผม ( สเปรย์แรงดัน 1.5 KV ; อุณหภูมิ 200 องศา C C ) การประจุเปปไทด์ถูก infused ในสเปกโตรมิเตอร์มวล ltq การวิเคราะห์ MS พร้อมๆ กันฮีโมโกลบินของมนุษย์บริสุทธิ์ ( 100 pmol ) ภายใต้ทริปย่อยในการย่อยอาหาร บัฟเฟอร์ ( 40 มม. แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 10% ไนรูป [ 1 μ g ] ) คืน ( 18 ชั่วโมง ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C . ปฏิกิริยาผสมส่วนผสมแห้งในความเร็วในสุญญากาศและเปปไทด์อาหารอยู่ในน้ำ resuspended ไน ( 50 : 50 Vol / Vol ) ที่มี 0.2 % กรด .การระบุความสัมพันธ์ ms-ms เปปไทด์เป็นสเปกตรัมที่มีลำดับจากศูนย์แห่งชาติสำหรับข้อมูลและฐานข้อมูลโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ nonredundant โปรตีน EST sequest ( thermofisher ) ขั้นตอนวิธีการค้นหาฐานข้อมูล ผู้ที่ผ่านการคัดเลือกเฉพาะเปประบุตัวกรองที่กำหนดเพื่อค้นหาฐานข้อมูลคือการพิจารณา [ xcorr สูงกว่า ( 1 ) 1.5 2.0 2.5 ( 2 ) หรือ ( 3 )คะแนน Delta > 1 ; 10 หรือมากกว่า B Y ไอออน ; MS2 เข้ม > 5 × 10 − 4 ; เปปไทด์ความน่าจะเป็น > E × 10 − 2 ]

:

ไปผลกระเทียมสกัดปรับเปลี่ยนมนุษย์เบต้าฮีโมโกลบิน

มนุษย์ rbcs บ่มด้วยสารสกัดกระเทียมกระตุ้นการผลิตอย่างรวดเร็วของการผลิต h2s . ของ h2s ได้มาจากการย่อยสลายสาร . สารเป็นหลัก แกโนซัลเฟอร์สารประกอบที่พบในกระเทียมและเป็นกรดอะมิโนที่ผลิตจาก alliin.11 การผลิตสารจากการสลายตัวของอัลลิอินเนส ขึ้นอยู่กับเอนไซม์ ซึ่งจะทำงานเมื่อกระเทียมบด สารผลิตภัณฑ์เช่นไดอัลลิลซัลไฟด์ , dads และไดอัลลิล trisulfide อย่างรวดเร็วจะเกิดขึ้นในสารละลายน้ำ ของทั้งสามสารผลพลอยได้พ่อเป็นที่แพร่หลายมากที่สุด ( 66% ) ในการเปรียบเทียบกับ อื่น ๆสารประกอบซัลไฟด์ produced.11 แกโนซัลเฟอร์เหล่านี้สามารถปรับเปลี่ยนเป็นกรดอะมิโนที่พบตกค้างในอัลฟาโซ่ ( ตำแหน่ง 104 ) และโซ่เบต้า ( ตำแหน่งและ 112 ) ของฮีโมโกลบิน โมเลกุล เพื่อตรวจสอบว่า ฮีโมโกลบินของมนุษย์ดัดแปลง โดย สารสกัดกระเทียมรวบรวมและเตรียมสดมนุษย์ rbcs ถูกบ่มด้วยสารสกัดกระเทียมสด หลังจากบ่มในบรรยากาศอาร์กอน rbcs มีจำนวน 3 , และล้าง ควบคุมลบ ฮีโมโกลบิน สกัดจากสาร rbcs . ทำให้โมเลกุลของฮีโมโกลบินจะถูกวิเคราะห์ปริมาณมวลชีวภาพมวลสเปกตรัมของฮีโมโกลบินบริสุทธิ์จากการควบคุมการปฏิบัติ rbcs พบสองหน่วยหลักของโมเลกุลฮีโมโกลบิน อัลฟา - ( 15130.5 ) และเบต้า - ( 15870.5 ) โซ่ , ตามที่คาดไว้ ( รูปที่ 1A ) แต่อย่างไรก็ตาม เลือดบริสุทธิ์จากกระเทียมรักษา rbcs พบมวลเปลี่ยนจากยอดเขาแทนโซ่แต่ไม่ใช่อัลฟ่าเบต้าโซ่ ( รูปที่ 1A )พบมวลเปลี่ยนเป็นประมาณ 71 มวลอะตอมหน่วย ( อามุ ) ผลการศึกษาพบว่า สารสกัดจากกระเทียมสามารถปรับเปลี่ยนฮีโมโกลบินที่มีอยู่ในมนุษย์ intraerythrocytic โดยเฉพาะเบต้าโซ่

รูปที่ 1
รูปที่ 1
กระเทียมสกัดเบต้ามนุษย์ฮีโมโกลบิน ( Hb ) ปรับเปลี่ยน . เตรียมสดเซลล์เม็ดเลือดแดงของมนุษย์ ได้รับการรักษาด้วย ( ก ) หรือ ( ข ) น้ำสกัดกระเทียมHB บริสุทธิ์จากการรักษาเซลล์เม็ดเลือดแดง และภายใต้การวิเคราะห์ของชีวมวล ( 2 ) บริสุทธิ์จาก . . . . . . .
กระเทียมสกัดปรับเปลี่ยนเบต้าฮีโมโกลบินมนุษย์ภายใน rbcs

การปรับเปลี่ยนของเบต้าฮีโมโกลบินได้ หลังจากบ่ม rbcs กับกระเทียมดิบ สารสกัดผลการศึกษาพบว่า สารที่มีอยู่ในกระเทียมสกัดสามารถกระจาย ( งานหรือเฉยๆ ) ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์และปรับเปลี่ยนตำแหน่งภายใน rbcs . เพื่อแสดงให้เห็นว่านี้เป็นแก้ไขภายใน rbcs เซลล์ถูก preincubated กับ iodoacetamide . iodoacetamide เป็นเยื่อซึมผ่านสารประกอบที่เป็นที่รู้จักที่จะปรับเปลี่ยน ซิสเตอีนตกค้างหลังจากบ่มด้วย iodoacetamide , สารสกัดจากกระเทียม ได้เพิ่ม เพื่อเตรียมการ การ rbcs ถูกเก็บและล้าง และโมเลกุลของฮีโมโกลบินคือ บริสุทธิ์ เป็นโซลูชั่นการควบคุม rbcs การเก็บรักษายานพาหนะและกระเทียมสกัดอย่างเดียว อย่างที่คาดไว้ เลือดบริสุทธิ์จากตัวอย่างควบคุมไม่ได้แสดงการเปลี่ยนแปลงในมวลโมเลกุลของแอลฟา - เบต้า หรือโซ่ ( รูปที่ 2A )และกระเทียมสกัดตัวอย่างการปฏิบัติที่ตรวจพบก่อนหน้านี้มวลกะบนเบต้าโซ่ ( รูปที่ 2B ) ในทางกลับกัน ฮีโมโกลบินบริสุทธิ์จาก rbcs รักษาด้วย iodoacetamide และกระเทียมสกัด พบมวลเปลี่ยนจาก 53 อามุ ( รูปที่ 2 ) คาดว่าจะเปลี่ยนในมวล iodoacetamide เข้าไคลคือ 58 อามุ 5 หน่วยคำนวณมวลมากกว่ามวลมวลการเบี่ยงเบนอาจเกิดจากการสลายตัวในระหว่างกระบวนการไนเซชั่นและ / หรือความถูกต้องของ deconvoluted สเปกตรัมมวลเพราะบ่มด้วย iodoacetamide คนเดียวผลเปลี่ยนโมเลกุลเดียวกัน ( ข้อมูลไม่แสดง ) อย่างไรก็ตาม ผลการศึกษาพบว่า ฮีโมโกลบิน เบต้าโซ่ที่ดัดแปลงโดยเยื่อซึมผ่านสารประกอบที่มีอยู่ในสารสกัดกระเทียมซึ่งไม่สามารถจะถูกบล็อกโดย iodoacetamide .

การแปล กรุณารอสักครู่..

ภาษาอื่น ๆ

การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.