รูป 3 shows the comparison of the t

รูป 3 shows the comparison of the two different /สารละลาย บ่มs used in the present example (สารละลาย บ่ม 1: MRS medium containing increasing amounts of DMSO as ไครโอโพรเทกแทนต์, สารละลาย บ่ม 2 containing increasing amounts of skim milk with regard to survival of the bacteria during the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. As depicted in รูป 3, incubation with increasing concentration of skim milk (besides having กลีเซอรอล an additional ไครโอโพรเทกแทนต์) provides for unchanged survival rate compared to the freshly encapsulated bacterial cells that have not undergone การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, while the treatment of DMSO works but is less efficient with a survival rate of only 9 %.
Example 2: Effect of ทรีฮาโลส and skim milk as ไครโอโพรเทกแทนต์ on the survival of sodium cellulose sulphate encapsulated Lactobacillus
[0088] In this example, the survival of encapsulated Lactobacillus acidophilus freeze-
dried was tested with or without 10% ทรีฮาโลส as a supplementary ไครโอโพรเทกแทนต์ when stored under ambient conditions. The การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง solution that was also used for the consecutive incubation step was an aqueous solution containing 5% skimmed milk (w/v), 1% กลีเซอรอล (w/v), and 10% ทรีฮาโลส (w/v).

Experimental Details:
[0089] A previously frozen vial of the probiotic bacteria, Lactobacillus acidophilus was thawed out from -80°C and 20[11 was added into 50 ml of MRS media. The bacteria were subsequently cultured overnight at 37°C with a shaking speed of 50rpm. The next day, the

optical density of the bacterial culture was determined at 600nm (0D600) on a Tecan Infinite M200. Typically an OD600 reading of 1 corresponds to when the bacteria are in the exponential growth phase. The bacteria should be in the exponential growth phase when encapsulated.
[0090] For the encapsulation of the bacteria, 100u1 of a bacterial culture with an OD600 reading of 1 was mixed with 2ml 1.8% sodium cellulose sulphate containing 0.9% sodium chloride. A 5ml syringe and a 23G needle were used for the encapsulation process. The bacteria culture was mixed with the sodium cellulose sulphate and dropped into a gelation bath containing 150ml of 1.3% pDADMAC (24kDa), 0.9% sodium chloride. The capsules were allowed to gelate in the pDADMAC for 4mins. Subsequently, 300ml of lx Phosphate Buffered Saline (PBS) was added and the capsules washed for 8mins. 300ml of the washing solution was then removed and a further 400ml of PBS was added and the capsules washed for an additional 4mins. The washing solution was then drained and a further 3x 100ml washes with PBS then 3x 30ml washes with fresh MRS were performed. The capsules were then transferred to a 250ml conical flask with 100ml of fresh MRS media. These capsules were cultured overnight at 37°C with a shaking speed of 50rpm.
[0091] For the free bacteria, 5ml of the overnight culture of Lactobacillus cells at OD600=1 was transferred into a 15ml falcon tube and centrifuged at 3000g for 5mins The bacterial pellet was resuspended in 5ml cryopreservation medium (5% skim milk (w/v), 1% กลีเซอรอล (w/v) in water) with or without 10% (w/v) ทรีฮาโลส. The resuspended bacteria were then aliquotted into 10 x 0.5ml portions in 15ml falcon tubes. Sul of the resuspended cells were placed into each of 4 wells of a 96 well plate and an Alamar Blue assay was carried out to determine the metabolic activity of the bacterial cells. Alamar Blue® is a proven cell การอยู่รอดและเติบโตได้ indicator that uses the natural reducing power of living cells to convert resazurin to the fluorescent molecule, resorufin. Resazurin, a non-fluorescent indicator dye, is converted to bright red—fluorescent resorufin via the reduction reactions of metabolically active cells. The amount of fluorescence produced is proportional to the number of living cells. 100u1 of fresh MRS media and 1 Oul of the Alamar Blue reagent were added to the Sul bacterial sample and the samples incubated at 37°C with a shaking speed of 50rpm for lhr. The Alamar Blue assay plate was read on a Tecan Infinite M200. The rest of the free bacteria cells in the cryoprotective media are frozen in ethanol/dry ice bath and then stored at -80°C.
[0092] After overnight culture the bacteria containing capsules were washed with 3x 50ml fresh MRS media in the 250ml flask first and then placed in 15ml falcon tube with 10 ml of fresh MRS media. 5ml of MRS media was taken out and 5ml of cryopreservation
medium (as for free bacteria) with or without 10% (w/v) ทรีฮาโลส was added. The capsules were incubated in this สารแขวนลอย for 25 minutes then 5ml of the medium removed and replaced with 5ml of fresh cryopreservation medium (with or without 10% ทรีฮาโลส as appropriate). This procedure was repeated an additional 4 times, thus raising the proportion of cryopreservation medium from 50% after the first addition of cryopreservation medium to
98.5% finally. Subsequently, 1 capsule from the medium was placed into each of 4 wells of a
96 well plate and an Alamar Blue assay was carried out to detelinine the level of metabolic activity of the bacterial cells in the capsules. lOul of Alamar Blue reagent and 100u1 of fresh MRS medium was added to each well containing the capsules and the samples incubated at 37°C with a shaking speed of 50rpm for lhr. The Alamar Blue assay plate was read on a Tecan Infinite M200. 4 capsules from the cryopreservation medium were placed into 15 ml falcon tubes with 500u1 of aqueous การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง solution containing 5% skim milk, 1% with or without 10% ทรีฮาโลส (as appropriate). These capsules were then frozen in an ethanol/dry ice bath and then stored at -80°C.
[0093] The falcon tubes containing either the free bacteria or capsules with the skim milk ไครโอโพรเทกแทนต์ with or without 10% ทรีฮาโลส were freeze-dried overnight using a ThermoScientific Modulyo D-230 freeze-drier. To test the survival of the freeze-dried bacteria, at each point of time duplicate samples of freeze-dried free Lactobacillus and encapsulated Lactobacillus were rehydrated using 500u1 of Millipore water, or 5-10ml of MRS media respectively, for 5mins An Alamar Blue assay was then performed on both the free Lactobacillus and Lactobacillus capsules. The assay consisted of quadruplicate replicates of each of the following conditions for each of the duplicate samples:

1. Blank samples (100u1 MRS media + lOul alamar blue)

2. Free Lactobacillus samples freeze-dried with ทรีฮาโลส (Sul of rehydrated culture
+ 100u1 MRS media +10u1 Alamar Blue)

3. Free Lactobacillus samples freeze-dried without ทรีฮาโลส culture + 100u1 MRS media +10u1 Alamar Blue)
4. Encapsulated bacteria samples freeze dried with ทรีฮาโลส +100u1 MRS media + lOul alamar blue)




21


(5u1 of rehydrated



(1 capsule per well







5. Encapsulated bacteria samples freeze dried without ทรีฮาโลส (1 capsule per well
+100u1 MRS media + lOul alamar blue)
[0094] The samples were incubated at 37°C with a shaking speed of 50rpm for lhr. The Alamar Blue assay plate was read on a Tecan Infinite M200. The points of time at which the samples were rehydrated were at weeks 1, 2, 3, 4, 6, 7 and 8 post การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง to assess the การอยู่รอดและเติบโตได้ of bacteria after cryopreservation with 5% skim milk, 1% กลีเซอรอล and with or without 10% ทรีฮาโลส at room temperature over a period of 2 months after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.
[0095] The results of this experiment are shown in รูป 10. Each data point in รูป 10 represents the average of duplicate freeze-dried samples (each sample tested in quadruplicate) with two exceptions: free bacteria with 10% ทรีฮาโลส at week 6 and encapsulated bacteria with 10% ทรีฮาโลส at week 8 where, in both cases, one sample of the duplicate was completely degraded (the reason for which is unclear) and has not been included. The survival rate was determined in relative fluorescent units (RFU). As can be seen from รูป 10, the inventive การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง method in which the encapsulated bacterial cells are consecutively incubated in a solution that contains increasing concentrations of the freezing medium (containing 5% skimmed milk, 1% กลีเซอรอล, 10% ทรีฮาโลส) as ไครโอโพรเทกแทนต์ provides a survival rate of more than 60 % of the cells and thus a significant improvement to the survival rate of the free cells. While this survival rate of more than 60 % was achieved for a storage period of two weeks for treatment of the cells with increasing concentrations of skim milk only, the addition of ทรีฮาโลส in a concentration of 10 % (w/v) achieved to maintain this significantly increased survival rate for the entire test period of 8 weeks, meaning to extend the shelf-life of the capsules/เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. This results also shows that the method of the การประดิษฐ์ and the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ที่ผ่าน การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง that can be obtained by this method have promising prospects for commercial applications for cells such as probiotic cells (but also other cells) for which the cells are stored for a certain period of time till used.

Example 3: การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง of encapsulated Lactobacillus casei using a composition ซึ่งประกอบรวมด้วย skim milk, ทรีฮาโลส and กลีเซอรอล as ไครโอโพรเทกแทนต์
[0096] A previously frozen vial of the probiotic ba

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รูป 3 แสดงการเปรียบเทียบ บ่มs /สารละลายแตกต่างกันสองที่ใช้ในตัวอย่างที่นำเสนอ (สารละลายบ่ม 1: นางกลางที่ประกอบด้วยการเพิ่มจำนวนของ DMSO เป็นไครโอโพรเทกแทนต์ สารละลายบ่ม 2 ประกอบด้วยจำนวน skim นมตามการอยู่รอดของเชื้อแบคทีเรียในระหว่างการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งเพิ่มขึ้น ตามที่แสดงในรูปที่ 3 คณะทันตแพทยศาสตร์ ด้วยเพิ่มความเข้มข้นของนม skim (นอกจากมีกลีเซอรอลไครโอโพรเทกแทนต์การเพิ่มเติม) ให้สำหรับอัตรารอดไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อเทียบกับเซลล์แบคทีเรียสดสรุปที่ไม่มีระดับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง ในขณะที่การรักษาของ DMSO ทำงาน แต่มีประสิทธิภาพต่ำ มีอัตรารอดตายเพียง 9%ตัวอย่างที่ 2: ผลของทรีฮาโลสและ skim นมเป็นไครโอโพรเทกแทนต์ความอยู่รอดของโซเดียมซัลเฟตเซลลูโลสนึ้ราคาแลคโตบาซิลลัส[0088] ในตัวอย่างนี้ ความอยู่รอดของนึ้แลคโตบาซิลลัส acidophilus หยุด -แห้งได้รับการทดสอบ หรือ ไม่ทรีฮาโลส 10% เป็นไครโอโพรเทกแทนต์ส่งเสริมการขายถูกเก็บไว้ภายใต้สภาพแวดล้อม โซลูชั่นการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งที่ถูกใช้สำหรับขั้นตอนการบ่มต่อเนื่องมีการละลายที่ประกอบด้วยน้ำนมขาดมันเนย 5% (w/v), กลีเซอรอล 1% (w/v), และทรีฮาโลส 10% (w/v)รายละเอียดการทดลอง:[0089] A เคย แช่คอนแทคของโปรไบโอติกส์แบคทีเรีย แลคโตบาซิลลัส acidophilus เป็น thawed ออกจาก-80 ° C และ 20 [11 ถูกเพิ่มเป็น 50 ml สื่อนาง แบคทีเรียมีต่ออ่างค้างคืนที่ 37° C ด้วยความเร็ว 50 rpm งก ๆ ในวันถัดไป การกำหนดความหนาแน่นออปติคัลของวัฒนธรรมแบคทีเรียที่ 600nm (0D 600) บน M200 เป็นอนันต์ Tecan โดยทั่วไปการอ่าน OD600 1 ตรงกับเมื่อแบคทีเรียอยู่ในระยะเรขา แบคทีเรียต้องการเรขาเมื่อนึ้[0090] สำหรับ encapsulation ของแบคทีเรีย 100u1 ของวัฒนธรรมจากแบคทีเรีย ด้วยการอ่าน OD600 1 ถูกผสมกับ 2ml โซเดียม 1.8% เซลลูโลสซัลเฟตประกอบด้วย 0.9% โซเดียมคลอไรด์ เข็ม 5 มล.และเข็ม 23 กรัมถูกใช้สำหรับการ encapsulation วัฒนธรรมแบคทีเรียผสมกับซัลเฟตเซลลูโลสโซเดียม และทิ้งลงในน้ำ gelation ประกอบด้วย 150ml ของ 1.3% pDADMAC (24kDa), 0.9% โซเดียมคลอไรด์ แคปซูลได้รับอนุญาตให้ gelate ใน pDADMAC สำหรับ 4mins ในเวลาต่อมา 300ml ของ lx เพิ่มฟอสเฟต Buffered Saline (PBS) และแคปซูลล้างสำหรับ 8mins 300ml ของโซลูชันซักผ้าถูกเอาออกแล้ว และเข้ามาเป็น ml 400 เพิ่มเติมของ PBS และแคปซูลล้างสำหรับการ 4mins เพิ่มเติม โซลูชันการล้างนั้นหมดกำลังแล้ว และแบบเพิ่มเติม 3 x 100ml ต่อผิวหน้า ด้วย PBS แล้วดำเนิน washes 3 x 30ml กับนางสด แคปซูลมีการถ่ายโอนแล้วจะหนาวทรงกรวยเป็น 250ml กับสื่อนางสด 100 มล แคปซูลเหล่านี้มีอ่างค้างคืนที่ 37° C ด้วยความเร็ว 50 rpm งก ๆ[0091] For the free bacteria, 5ml of the overnight culture of Lactobacillus cells at OD600=1 was transferred into a 15ml falcon tube and centrifuged at 3000g for 5mins The bacterial pellet was resuspended in 5ml cryopreservation medium (5% skim milk (w/v), 1% กลีเซอรอล (w/v) in water) with or without 10% (w/v) ทรีฮาโลส. The resuspended bacteria were then aliquotted into 10 x 0.5ml portions in 15ml falcon tubes. Sul of the resuspended cells were placed into each of 4 wells of a 96 well plate and an Alamar Blue assay was carried out to determine the metabolic activity of the bacterial cells. Alamar Blue® is a proven cell การอยู่รอดและเติบโตได้ indicator that uses the natural reducing power of living cells to convert resazurin to the fluorescent molecule, resorufin. Resazurin, a non-fluorescent indicator dye, is converted to bright red—fluorescent resorufin via the reduction reactions of metabolically active cells. The amount of fluorescence produced is proportional to the number of living cells. 100u1 of fresh MRS media and 1 Oul of the Alamar Blue reagent were added to the Sul bacterial sample and the samples incubated at 37°C with a shaking speed of 50rpm for lhr. The Alamar Blue assay plate was read on a Tecan Infinite M200. The rest of the free bacteria cells in the cryoprotective media are frozen in ethanol/dry ice bath and then stored at -80°C.[0092] After overnight culture the bacteria containing capsules were washed with 3x 50ml fresh MRS media in the 250ml flask first and then placed in 15ml falcon tube with 10 ml of fresh MRS media. 5ml of MRS media was taken out and 5ml of cryopreservationmedium (as for free bacteria) with or without 10% (w/v) ทรีฮาโลส was added. The capsules were incubated in this สารแขวนลอย for 25 minutes then 5ml of the medium removed and replaced with 5ml of fresh cryopreservation medium (with or without 10% ทรีฮาโลส as appropriate). This procedure was repeated an additional 4 times, thus raising the proportion of cryopreservation medium from 50% after the first addition of cryopreservation medium to98.5% finally. Subsequently, 1 capsule from the medium was placed into each of 4 wells of a96 well plate and an Alamar Blue assay was carried out to detelinine the level of metabolic activity of the bacterial cells in the capsules. lOul of Alamar Blue reagent and 100u1 of fresh MRS medium was added to each well containing the capsules and the samples incubated at 37°C with a shaking speed of 50rpm for lhr. The Alamar Blue assay plate was read on a Tecan Infinite M200. 4 capsules from the cryopreservation medium were placed into 15 ml falcon tubes with 500u1 of aqueous การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง solution containing 5% skim milk, 1% with or without 10% ทรีฮาโลส (as appropriate). These capsules were then frozen in an ethanol/dry ice bath and then stored at -80°C.[0093] The falcon tubes containing either the free bacteria or capsules with the skim milk ไครโอโพรเทกแทนต์ with or without 10% ทรีฮาโลส were freeze-dried overnight using a ThermoScientific Modulyo D-230 freeze-drier. To test the survival of the freeze-dried bacteria, at each point of time duplicate samples of freeze-dried free Lactobacillus and encapsulated Lactobacillus were rehydrated using 500u1 of Millipore water, or 5-10ml of MRS media respectively, for 5mins An Alamar Blue assay was then performed on both the free Lactobacillus and Lactobacillus capsules. The assay consisted of quadruplicate replicates of each of the following conditions for each of the duplicate samples:1. Blank samples (100u1 MRS media + lOul alamar blue)2. Free Lactobacillus samples freeze-dried with ทรีฮาโลส (Sul of rehydrated culture+ 100u1 MRS media +10u1 Alamar Blue) 3. Free Lactobacillus samples freeze-dried without ทรีฮาโลส culture + 100u1 MRS media +10u1 Alamar Blue)4. Encapsulated bacteria samples freeze dried with ทรีฮาโลส +100u1 MRS media + lOul alamar blue)21 (5u1 of rehydrated(1 capsule per well 5. Encapsulated bacteria samples freeze dried without ทรีฮาโลส (1 capsule per well+100u1 MRS media + lOul alamar blue)[0094] The samples were incubated at 37°C with a shaking speed of 50rpm for lhr. The Alamar Blue assay plate was read on a Tecan Infinite M200. The points of time at which the samples were rehydrated were at weeks 1, 2, 3, 4, 6, 7 and 8 post การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง to assess the การอยู่รอดและเติบโตได้ of bacteria after cryopreservation with 5% skim milk, 1% กลีเซอรอล and with or without 10% ทรีฮาโลส at room temperature over a period of 2 months after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. [0095] The results of this experiment are shown in รูป 10. Each data point in รูป 10 represents the average of duplicate freeze-dried samples (each sample tested in quadruplicate) with two exceptions: free bacteria with 10% ทรีฮาโลส at week 6 and encapsulated bacteria with 10% ทรีฮาโลส at week 8 where, in both cases, one sample of the duplicate was completely degraded (the reason for which is unclear) and has not been included. The survival rate was determined in relative fluorescent units (RFU). As can be seen from รูป 10, the inventive การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง method in which the encapsulated bacterial cells are consecutively incubated in a solution that contains increasing concentrations of the freezing medium (containing 5% skimmed milk, 1% กลีเซอรอล, 10% ทรีฮาโลส) as ไครโอโพรเทกแทนต์ provides a survival rate of more than 60 % of the cells and thus a significant improvement to the survival rate of the free cells. While this survival rate of more than 60 % was achieved for a storage period of two weeks for treatment of the cells with increasing concentrations of skim milk only, the addition of ทรีฮาโลส in a concentration of 10 % (w/v) achieved to maintain this significantly increased survival rate for the entire test period of 8 weeks, meaning to extend the shelf-life of the capsules/เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. This results also shows that the method of the การประดิษฐ์ and the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ที่ผ่าน การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง that can be obtained by this method have promising prospects for commercial applications for cells such as probiotic cells (but also other cells) for which the cells are stored for a certain period of time till used.

Example 3: การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง of encapsulated Lactobacillus casei using a composition ซึ่งประกอบรวมด้วย skim milk, ทรีฮาโลส and กลีเซอรอล as ไครโอโพรเทกแทนต์
[0096] A previously frozen vial of the probiotic ba

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รูป 3 แสดงการเปรียบเทียบของทั้งสองที่แตกต่างกัน / สารละลายบ่ม S ใช้ในตัวอย่างปัจจุบัน ( สารละลายบ่ม 1 : คุณนายขนาดกลางที่มีปริมาณที่เพิ่มขึ้นของ DMSO เป็นไครโอโพรเทกแทนต์สารละลาย , บ่ม 2 ที่มีปริมาณที่เพิ่มขึ้นของหางนมเกี่ยวกับการอยู่รอดของแบคทีเรียในการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง .เหมือนในภาพรูป 3 , 4 ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของหางนม ( นอกจากมีกลีเซอรอลเป็นไครโอโพรเทกแทนต์เพิ่มเติม ) มีไม่เปลี่ยนแปลงอัตราการอยู่รอดเมื่อเทียบกับสดห่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียที่ได้รับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง ,ในขณะที่การรักษาของ DMSO ทำงานแต่ประสิทธิภาพน้อย มีอัตราการรอดตายเพียง 9% .
ตัวอย่างที่ 2 : ผลของทรีฮาโลส และ skim milk เป็นไครโอโพรเทกแทนต์ต่อความอยู่รอดของซัลเฟตโซเดียมเซลลูโลสห่อหุ้ม Lactobacillus
[ 0088 ] ในตัวอย่างนี้ การอยู่รอดของ Lactobacillus acidophilus แช่แข็ง -
3แห้งถูกทดสอบหรือไม่มี 10% ทรีฮาโลสเป็นไครโอโพรเทกแทนต์เพิ่มเติมเมื่อเก็บรักษาภายใต้สภาวะแวดล้อม การการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งโซลูชั่นที่ใช้สำหรับขั้นตอนการบ่มติดต่อกันเป็นสารละลายที่ประกอบด้วย 5 % นม ( w / v ) กลีเซอรอล 1% ( w / v ) และทรีฮาโลส 10% ( w / v )

รายละเอียด :
1 [ 0089 ] ก่อนหน้านี้แช่เย็นขวดของแบคทีเรียโปรไบโอติก , Lactobacillus acidophilus ถูกละลายออกไปจาก - 80 ° C และ 20 [ 11 มีเพิ่มเป็น 50 ml ของนางสื่อ แบคทีเรียถูกต่อมาเลี้ยงค้างคืนที่ 37 ° C เขย่าที่ความเร็วของ 50rpm . วันถัดไป ,

แสงความหนาแน่นของแบคทีเรียวัฒนธรรมถูกกำหนดที่ 600nm ( 0d600 ) บน TECAN อนันต์ m200 .โดยปกติจะเป็น od600 อ่าน 1 สอดคล้องกับเมื่อแบคทีเรียในขั้นตอนการเจริญเติบโตที่ชี้แจง แบคทีเรียควรในการเจริญเติบโตที่ชี้แจงขั้นตอนที่ 3 .
[ 0090 ] สำหรับ encapsulation ของแบคทีเรีย 100u1 ของแบคทีเรียที่มี od600 อ่าน 1 ผสมกับโซเดียมเซลลูโลส ซัลเฟต 2ml 1.8% ที่ 0.9% โซเดียมคลอไรด์เข็ม 5 เข็ม และ 23g ใช้สำหรับกระบวนการ encapsulation . แบคทีเรียวัฒนธรรมผสมกับโซเดียมเซลลูโลส ซัลเฟต และลดลงในการเกิดเจลล้างหน้าอาบน้ำที่มี 1.3 % pdadmac ( 24kda ) 0.9% โซเดียมคลอไรด์ แคปซูลได้รับอนุญาตให้กลายเป็นเจลใน pdadmac สำหรับ 4mins . ต่อมา300 มล. เกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ LX ( PBS ) คือการเพิ่มและแคปซูลล้าง 8mins . รบกวนของการแก้ไขถูกลบออกแล้ว และ 400ml เพิ่มเติมของพีบีเอส ได้เพิ่มและแคปซูลล้างสำหรับ 4mins เพิ่มเติม ล้างในสารละลายแล้วระบาย และอีก 3 x 100 ล้างกับ PBS แล้วล้าง 30ml 3x กับนางสดแสดงแคปซูลถูกโอนให้กับ 250ml ขวด 100ml ของกรวยกับนางสดสื่อ แคปซูลเหล่านี้ถูกเลี้ยงค้างคืนที่ 37 ° C เขย่าที่ความเร็วของ 50rpm ก็ทํา .
[ ] สำหรับแบคทีเรียฟรีกของวัฒนธรรมในชั่วข้ามคืนของเซลล์ Lactobacillus ที่ od600 = 1 ถูกย้ายเข้าไปในหลอดทา Falcon ไฟฟ้าที่ 3000g สำหรับนาทีเม็ดแบคทีเรียอยู่ในการเก็บรักษา resuspended 5ml ปานกลาง ( หางนม 5% ( w / v ) กลีเซอรอล 1% ( w / v ) ในน้ำ ) มีหรือไม่มี 10% ( w / 5 ) ทรีฮาโลส . การ resuspended แบคทีเรียแล้ว aliquotted เป็น 10 x 05 ส่วนในหลอดฟอลคอน 15ml . ซูลของ resuspended เซลล์ที่ถูกวางไว้ในแต่ละ 4 บ่อของ 96 ดีจานและใช้สีฟ้า Alamar มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษากิจกรรมการสลายของเซลล์แบคทีเรีย® Alamar สีฟ้าได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นเซลล์การอยู่รอดและเติบโตได้ตัวบ่งชี้ที่ใช้ธรรมชาติลดพลังงานของเซลล์ที่มีชีวิตเพื่อแปลงรีซาซูรินไปยังโมเลกุลเรืองแสง resorufin . รีซาซูริน ไม่เรืองแสง ตัวบ่งชี้ที่ย้อมจะถูกแปลงเป็น resorufin เรืองแสงสีแดงเจิดจ้า ผ่านการลดปฏิกิริยาของ metabolically เซลล์ที่ใช้งานอยู่ .ปริมาณการผลิตเป็นสัดส่วนกับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต นาง 100u1 สดสื่อ 1 oul ของสารเคมีสีฟ้า Alamar ถูกเพิ่มไปยังซุลแบคทีเรียตัวอย่างและตัวอย่างที่บ่มที่ 37 ° C เขย่าที่ความเร็วของ 50rpm สำหรับ LHR . การใช้สีฟ้า คืออ่าน Alamar จานบน TECAN อนันต์ m200 .