MethodsCells and virusesVero cells

Methods
Cells and viruses

Vero cells were maintained in high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) supplemented with 10% fetal calf serum (Atlanta Biologicals, Norcross, GA) and 0.1 mg/ml Normocin (Invivogen, San Diego, CA). The previously described Vero-adapted Beaudette strain of IBV [45] was used in all IBV infection experiments. Infections and titers were performed with Vero cells.

Preparation of plant extracts

0.6 g of R. rosea powdered root (Starwest Botanicals Sacramento, CA) was incubated in 5 ml of 70% ethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for 24 h at room temperature [32]. 1.5 g of N. sativa seeds (Frontier Natural Products Co-op, Norway, IA) was homogenized in 10 ml of 85% ethanol and incubated for 7 d at room temperature [46,47]. 32.0 g of S. nigra fruit (San Francisco Herb Company, San Francisco, CA) was homogenized in 40 ml of 80% ethanol and incubated for 4 d at room temperature [48]. Following these incubations, extract solutions were centrifuged at 1900 × g for 5 min at room temperature to remove debris and the remaining supernatant was syringe filtered through a 0.22 μm polyvinylidene fluoride membrane (Fisher Scientific Company, Fair Lawn, NJ). All extract solutions were stored at 4°C.

Cytotoxicity assays

Cells were plated in 35-mm dishes in duplicate for approximately 1 d before being treated with plant extracts for 48 h. Concentrations ranged from 7.5 × 10-5 g/ml to 1.2 × 10-3 g/ml for R. rosea extract, from 9.4 × 10-5 g/ml to 1.5 × 10-3 g/ml for N. sativa extract, and from 5.0 × 10-4 g/ml to 8.0 × 10-3 g/ml for S. nigra extract. The final concentration of solvent was kept constant in all wells at 0.04% ethanol for R. rosea extract treatments, 0.2% ethanol for N. sativa extract treatments, and 0.4% ethanol for S. nigra extract treatments. At 48 h post-treatment, supernatants containing dead cells were collected and combined with adherent cells that had been harvested using 0.05% trypsin (Invitrogen Corporation) in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 20 ml of this solution was then combined with an equal volume of 0.6% trypan blue (Sigma-Aldrich). The number of live cells per ml in each dish was counted in duplicate using light microscopy and a hemocytometer. The relative cell viability was calculated as live cells per ml in extract-treated dishes relative to solvent-treated dishes.

Infection in the presence of plant extracts

To screen for anti-IBV effects, cells were plated in 35-mm dishes for approximately 2 d before being treated with 3.75 × 10-4 g/ml of N. sativa extract, 1.5 × 10-4 g/ml of R. rosea extract, or 4.0 × 10-3 g/ml of S. nigra extract for 24 h. Control cells for R. rosea, N. sativa, and S. nigra extract treatments were incubated in final concentrations of 0.04% ethanol, 0.2% ethanol and 0.4% ethanol, respectively. Prior to infection with IBV, virus was incubated with these same concentrations of plant extract (or solvent alone) for 20 min at room temperature. IBV infection was then performed at a multiplicity of infection (MOI) of either 1 or 0.1 by allowing virus to absorb to cells in a small volume of serum-free DMEM supplemented with plant extract or solvent alone for 1 h at 37°C. Cells were then transferred to fresh DMEM supplemented with 10% fetal calf serum, antibiotics, and plant extract or solvent for an additional 24 h. Viral cytopathic effect was then assessed visually using light microscopy, and virus-infected supernatants and cells were harvested separately. Supernatants were collected, centrifuged at 1900 × g for 5 min at room temperature to remove cellular debris, and stored at -80°C until virus titers could be determined. Cells were transferred to fresh DMEM supplemented with 10% fetal calf serum and antibiotics before being lysed by three rounds of freeze-thaw. Centrifugation at 1900 × g for 5 min at room temperature removed cellular debris and the remaining supernatant was stored at -80°C until virus titers could be determined.

After initial screening, the following S. nigra extract treatments were assessed for their ability to inhibit IBV either alone or in combination: (1) exposing cells to extract prior to infection, (2) exposing cells to extract following infection, (3) exposing virus to extract prior to infection, (4) exposing both cells and virus to extract during infection. Infections were done at an MOI of 0.1 as indicated above, except that exposure to solvent alone was substituted for exposure to S. nigra extract if a specific treatment was omitted. For example, to determine the effects of only exposing cells to S. nigra extract prior to infection, cells were first incubated with 4 mg/ml of S. nigra extract for 24 h prior to infection. Virus was then incubated in solvent alone for 20 min prior to infection and solvent was present during infection. Cells were then incubated in solvent alone for an additional 24 h following infection before being harvested, as described above.

Plaque assays

Virus titers were quantified via plaque assay. First, serial dilutions of virus were absorbed to confluent Vero cells for 1 h in a small amount of serum free DMEM. Virus was then removed from cells and an agarose overlay (equal volumes of 2× DMEM and 1.8% melted agarose (Invitrogen Corporation)) was added. After 2 d, an additional agarose overlay containing 0.015% neutral red (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH) was added to cells. Approximately 24 h later, clear plaques were counted and virus titers were calculated in particle forming units/ml (pfu/ml).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการเซลล์และไวรัสมีรักษาเซลล์ Vero ในกลูโคสสูง ดุลเบกโกของปรับเปลี่ยนกลางของอีเกิล (DMEM) (Invitrogen Corporation คาร์ลส CA) เสริม ด้วยเซรั่ม 10% ลูกและทารกในครรภ์ (Biologicals แอตแลนต้า Norcross, GA) และ Normocin (Invivogen, San Diego, CA) 0.1 mg/ml Beaudette องค์กรที่ปรับ Vero อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ต้องใช้ของ IBV [45] ถูกใช้ในการทดลองทั้งหมด IBV ติดเชื้อ ติดเชื้อและ titers ที่ทำเซลล์ Veroการเตรียมสารสกัดจากพืช0.6 g rosea อาร์ผงราก (Starwest Botanicals แซคราเมนโต CA) ถูก incubated ใน 5 ml ของเอทานอล 70% (Aldrich ซิก St. Louis, MO) ใน 24 ชมที่อุณหภูมิห้อง [32] 1.5 g ของเมล็ดซาตอนเหนือ (ชายแดนธรรมชาติผลิตภัณฑ์ Co-op นอร์เวย์ IA) homogenized เป็นกลุ่มใน 10 ml ของเอทานอล 85% และ incubated สำหรับ 7 d ที่อุณหภูมิห้อง [46,47] 32.0 g S. nigra ผลไม้ (บริษัทสมุนไพร San Francisco, San Francisco, CA) homogenized เป็นกลุ่มใน 40 ml ของเอทานอล 80% และ incubated สำหรับ 4 วันที่อุณหภูมิห้อง [48] ต่อ incubations สารสกัดจากโซลูชั่นเหล่านี้ได้ centrifuged ที่ 1900 ซื้อ g ใน 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อเอาเศษ และ supernatant ที่เหลือถูกเข็มที่ถูกกรองผ่าน 0.22 μm polyvinylidene ฟลูออไรด์เมมเบรน (Fisher วิทยาศาสตร์ บริษัท งานสนามหญ้า NJ) โซลูชั่นสารสกัดจากทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสCytotoxicity assaysเซลล์ถูกชุบในอาหาร 35 มม.ซ้ำสำหรับประมาณ 1 d ก่อนได้รับการรักษากับโรงงาน สารสกัดสำหรับ h. 48 มา 7.5 × 10-5 g / ml การ 1.2 × 10-3 g / ml สำหรับ rosea อาร์ความเข้มข้นสารสกัดจาก จาก 9.4 × 10-5 g / ml การ 1.5 × 10-3 g / ml สำหรับสารสกัดซาตอนเหนือ และ 5.0 × 10-4 g / ml การ 8.0 × 10-3 g / ml สำหรับ S. nigra สารสกัด ความเข้มข้นสุดท้ายของตัวทำละลายถูกเก็บคงที่ในบ่อทั้งหมดที่ 0.04% เอทานอลสำหรับบำบัดสารสกัด rosea อาร์ 0.2% เอทานอลสำหรับซาตอนเหนือแยกบำบัด และ 0.4% เอทานอลสำหรับ S. nigra แยกบำบัด ที่ 48 h หลังรักษา supernatants เซลล์ตายถูกรวบรวม และรวมกับเซลล์ที่มีการเก็บเกี่ยวใช้ 0.05% ทริปซิน (Invitrogen Corporation) นฤมลของดุลเบกโก buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (Aldrich ซิก St. Louis, MO) ปริมาณ 20 ml ของโซลูชันนี้ถูกแล้วรวมกับปริมาตรการเท่ากันของ 0.6% trypan blue (ซิก-Aldrich) จำนวนของเซลล์สดต่อมิลลิลิตรในอาหารแต่ละจานถูกนับในซ้ำใช้แสง microscopy และ hemocytometer การ ชีวิตเซลล์แบบสัมพัทธ์ได้คำนวณเป็นสดเซลล์ต่อมิลลิลิตรในอาหารรับสารสกัดเทียบกับอาหารถือว่าตัวทำละลายติดเชื้อในต่อหน้าของสารสกัดจากพืชกับหน้าจอในลักษณะต่อต้าน-IBV เซลล์ถูกชุบในอาหาร 35 มม.ประมาณ 2 d ก่อนถูกรับ 3.75 × 10-4 g / ml ของสารสกัดซาตอนเหนือ 1.5 × 10-4 g / ml ของ rosea อาร์แยก หรือ 4.0 × 10-3 g / ml ของ S. nigra แยกสำหรับ 24 h. เซลล์ควบคุม การ rosea อาร์ ซาตอนเหนือ S. nigra สารสกัดรักษาถูก incubated ในความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.04% เอทานอลเอทานอล 0.2% และ 0.4% เอทานอล ตามลำดับ ก่อนที่จะติดเชื้อกับ IBV ไวรัสถูก incubated กับความเข้มข้นเดียวกันนี้ของโรงงานสกัด (หรือตัวทำละลายเพียงอย่างเดียว) สำหรับ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ติดเชื้อ IBV แล้วทำที่มากมายหลายหลากของเชื้อ (อย) ของ 1 หรือ 0.1 โดยทำให้ไวรัสซึมเซลล์ในปริมาณขนาดเล็กของเซรั่มฟรี DMEM เสริม ด้วยสารสกัดจากพืชหรือตัวทำละลายสำหรับ h 1 ที่ 37 องศาเซลเซียส เซลล์แล้วได้โอนไป DMEM สดเสริม ด้วยเซรั่มและทารกในครรภ์ลูก 10% ยาปฏิชีวนะ และสารสกัดจากพืชหรือตัวทำละลายสำหรับการ h. 24 เพิ่มเติมลักษณะพิเศษ cytopathic ไวรัสได้แล้วประเมินเห็นใช้ microscopy แสง และ supernatants ไวรัสและเซลล์เก็บเกี่ยวต่างหาก Supernatants ได้รวบรวม centrifuged ที่ 1900 ซื้อ g ใน 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อเอาเศษโทรศัพท์มือถือ และเก็บไว้ที่-80 ° C จนกว่าไวรัส titers สามารถถูกกำหนด เซลล์ถูกโอนย้ายไปที่ DMEM สดเสริม ด้วยเซรั่มลูกครรภ์ 10% และยาปฏิชีวนะก่อนการ lysed โดยแช่แข็ง-thaw รอบที่สาม Centrifugation ที่ 1900 ซื้อ g ใน 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเอาเศษโทรศัพท์มือถือ และ supernatant ที่เหลือถูกเก็บไว้ที่-80 ° C จนกระทั่งสามารถกำหนด titers ไวรัสหลังจากคัดกรองเบื้องต้น ต่อ S. nigra สารสกัดรักษาได้ประเมินความสามารถในการยับยั้ง IBV คนเดียว หรือรวม: (1) เปิดเผยเซลล์แยกก่อนที่จะติดเชื้อ, (2) เซลล์แยกต่อเชื้อเปิดเผย, (3) เปิดเผยแยกก่อนที่จะติดเชื้อไวรัส (4) เปิดเผยการแยกระหว่างการติดเชื้อไวรัสและเซลล์ ติดเชื้อได้แล้วที่มีอยของ 0.1 ตามที่ระบุข้างต้น การสัมผัสกับตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวถูกแทนสำหรับสัมผัสกับสารสกัดจาก S. nigra ถ้ารักษาเฉพาะถูกละเว้น ตัวอย่าง เพื่อกำหนดผลกระทบของการเปิดเผยเฉพาะ S. nigra สารสกัดก่อนติดเชื้อเซลล์ เซลล์ได้ก่อน incubated ด้วย 4 mg/ml ของ S. nigra สารสกัดใน 24 ชมก่อนที่จะติดเชื้อ ไวรัสแล้วมี incubated ในตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวสำหรับ 20 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อและตัวทำละลายอยู่ในระหว่างการติดเชื้อ เซลล์ได้แล้ว incubated ในตัวทำละลายสำหรับ h 24 เพิ่มเติมดังต่อไปนี้ก่อนการเก็บเกี่ยว การติดเชื้อตามที่อธิบายไว้ข้างต้นหินปูน assaysไวรัส titers มี quantified ผ่านทดสอบหินปูน แรก ประจำ dilutions ไวรัสถูกดูดซึมเซลล์ Vero confluent สำหรับ 1 h ในซีรั่มน้อยฟรี DMEM ไวรัสถูกลบออกจากเซลล์แล้ว และเพิ่มซ้อนทับ agarose (ปริมาณเท่ากับ 2 × DMEM และ 1.8% หลอม agarose (Invitrogen Corporation)) หลัง 2 d ซ้อนทับเพิ่มเติม agarose ประกอบด้วย 0.015% กลางสีแดง (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH) ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ นับได้ประมาณ 24 ชมหลัง ล้าง plaques และไวรัส titers ที่คำนวณในอนุภาคเป็นหน่วย/มล (pfu/มล.)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการ
เซลล์และไวรัสเซลล์เวโรได้รับการเก็บรักษาไว้ในกลาง Dulbecco สูงกลูโคสของการปรับเปลี่ยนของนกอินทรี (DMEM) (Invitrogen คอร์ปอเรชั่นคาร์ลส, แคลิฟอร์เนีย) เสริมด้วย 10% ซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ (แอตแลนตา Biologicals, แอตแลนตา, จอร์เจีย) และ 0.1 mg / ml Normocin (Invivogen , ซานดิเอโก) อธิบายไว้ก่อนหน้าเวโรปรับความเครียด Beaudette ของ IBV [45] ถูกนำมาใช้ในทุกการทดลองการติดเชื้อหลอดลมอักเสบติดต่อ การติดเชื้อและการก่อการได้ดำเนินการกับเซลล์เวโร. การเตรียมสารสกัดจากพืช0.6 กรัมของอาร์ Rosea รากผง (STARWEST Botanicals แซคราเมนโต) ถูกบ่มใน 5 มิลลิลิตรของเอทานอล 70% (Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์) 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง [32] 1.5 กรัมเมล็ด sativa N. (ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ Frontier Co-op, นอร์เวย์, IA) ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน 10 มิลลิลิตรของเอทานอล 85% และบ่มเป็นเวลา 7 วันที่อุณหภูมิห้อง [46,47] 32.0 กรัมของผลไม้ S. นิโกร (ซานฟรานซิสมุนไพร บริษัท , San Francisco, CA) ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน 40 มิลลิลิตรของเอทานอล 80% และบ่มเป็นเวลา 4 วันที่อุณหภูมิห้อง [48] ดังต่อไปนี้ฟักตัวของเชื้อที่การแก้ปัญหาสารสกัดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1900 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อเอาเศษและสารละลายที่เหลือได้รับการกรองผ่านเข็มฉีดยาที่ 0.22 ไมโครเมตร Polyvinylidene เมมเบรนฟลูออไร (ฟิชเชอร์ บริษัท วิทยาศาสตร์แฟร์ลอว์, นิวเจอร์ซีย์) สารสกัดจากโซลูชั่นทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ° C. การตรวจพิษเซลล์ที่ถูกชุบในอาหาร 35 มมซ้ำกันในเวลาประมาณ 1 วันก่อนที่จะถูกรับการรักษาด้วยสารสกัดจากพืช 48 ชั่วโมง ความเข้มข้นตั้งแต่ 7.5 × 10-5 g / ml ถึง 1.2 × 10-3 g / ml สำหรับอาร์สีชมพูสารสกัดจาก 9.4 × 10-5 g / ml ถึง 1.5 × 10-3 g / ml สำหรับ N. สารสกัด sativa, และจาก 5.0 × 10-4 g / ml 8.0 × 10-3 g / ml สำหรับเอสนิโกรสารสกัดจาก ความเข้มข้นสุดท้ายของตัวทำละลายถูกเก็บไว้อย่างต่อเนื่องในหลุมทั้งหมดในเอทานอล 0.04% สำหรับการรักษาสารสกัดจากอาร์สีชมพู, เอทานอล 0.2% สำหรับการรักษาสารสกัด N. sativa และเอทานอล 0.4% สำหรับเอสนิโกรการรักษาสารสกัดจาก 48 ชั่วโมงหลังการรักษา, supernatants มีเซลล์ที่ตายแล้วถูกเก็บรวบรวมและรวมกับเซลล์สานุศิษย์ที่ได้รับการเก็บเกี่ยวโดยใช้ trypsin% 0.05 (Invitrogen คอร์ปอเรชั่น) ในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ Dulbecco ของ (Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์) 20 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหานี้คือการรวมกันแล้วที่มีปริมาณเท่ากับ 0.6% ทริแพนสีฟ้า (Sigma-Aldrich) จำนวนของเซลล์ที่มีชีวิตอยู่ต่อมิลลิลิตรในอาหารแต่ละจานถูกนับในที่ซ้ำกันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงและ hemocytometer มีชีวิตเซลล์ญาติที่คำนวณได้เป็นเซลล์ที่มีชีวิตต่อมิลลิลิตรในอาหารสารสกัดที่ได้รับเมื่อเทียบกับตัวทำละลายที่ได้รับอาหาร. การติดเชื้อในการปรากฏตัวของพืชสารสกัดเพื่อหน้าจอสำหรับผลการต่อต้าน IBV เซลล์ถูกชุบในอาหาร 35 มมประมาณ 2 วัน ก่อนที่จะถูกรับการรักษาด้วย 3.75 × 10-4 g / ml ของสารสกัดจาก N. sativa 1.5 × 10-4 g / ml ของสารสกัดจากอาร์สีชมพูหรือ 4.0 × 10-3 g / ml ของเอสนิโกรสกัดเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ควบคุมสำหรับอาร์สีชมพู, N. sativa และ S. นิโกรสารสกัดจากการรักษาที่ถูกบ่มในความเข้มข้นสุดท้ายของเอทานอล 0.04% เอทานอล 0.2% และเอทานอล 0.4% ตามลำดับ ก่อนที่จะมีการติดเชื้อหลอดลมอักเสบติดต่อไวรัสถูกบ่มที่มีความเข้มข้นเดียวกันนี้ของสารสกัดจากพืช (หรือตัวทำละลายที่อยู่คนเดียว) เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง IBV การติดเชื้อที่ได้ดำเนินการแล้วที่หลายหลากของการติดเชื้อ (MOI) ของ 1 หรือ 0.1 โดยให้ไวรัสที่จะดูดซับไปยังเซลล์ในปริมาณเล็ก ๆ ของซีรั่ม DMEM ฟรีเสริมด้วยสารสกัดจากพืชหรือตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C เซลล์ที่ถูกโอนไปแล้ว DMEM สดเสริมด้วย 10% ซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์, ยาปฏิชีวนะและสารสกัดจากพืชหรือตัวทำละลายสำหรับเพิ่มเติม 24 ชั่วโมง ผลไวรัส cytopathic แล้วได้รับการประเมินสายตาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์และ supernatants ที่ติดเชื้อไวรัสและเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวแยกต่างหาก supernatants ถูกเก็บรวบรวม, หมุนเหวี่ยงที่ 1900 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อเอาเศษโทรศัพท์มือถือและเก็บไว้ที่ -80 ° C จนเชื้อไวรัสอาจได้รับการพิจารณา เซลล์ที่ถูกถ่ายโอนไปยัง DMEM สดเสริมด้วยซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ 10% และยาปฏิชีวนะก่อนที่จะถูก lysed โดยสามรอบของการแช่แข็งละลาย การหมุนเหวี่ยงที่ 1900 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องลบออกเศษเซลล์และสารละลายที่เหลือถูกเก็บไว้ที่ -80 ° C จนเชื้อไวรัสอาจได้รับการพิจารณา. หลังจากการตรวจคัดกรองเบื้องต้นดังต่อไปนี้ S. นิโกรสารสกัดจากการรักษาที่ได้รับการประเมินความสามารถในการยับยั้ง IBV เพียงอย่างเดียวหรือรวมกัน (1) การเปิดเผยเซลล์เพื่อแยกก่อนที่จะมีการติดเชื้อ (2) การเปิดเผยเซลล์เพื่อแยกการติดเชื้อต่อไปนี้ (3) การเปิดเผยไวรัสเพื่อดึงก่อนที่จะมีการติดเชื้อ (4) การเปิดเผยทั้งเซลล์และไวรัสเพื่อแยกระหว่าง การติดเชื้อ การติดเชื้อที่ได้รับการทำที่กระทรวงมหาดไทย 0.1 ตามที่ระบุไว้ข้างต้นยกเว้นการสัมผัสที่ตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวแทนการสัมผัสกับสารสกัดจากเอสนิโกรถ้ารักษาที่เฉพาะเจาะจงได้รับการละเว้น ตัวอย่างเช่นในการตรวจสอบผลกระทบของการเปิดเผยเพียงเซลล์เอนิโกรสารสกัดก่อนที่จะมีการติดเชื้อเซลล์ถูกบ่มแรกมี 4 mg / ml ของสารสกัดจากเอสนิโกรเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะมีการติดเชื้อ ไวรัสถูกบ่มแล้วในตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวเป็นเวลา 20 นาทีก่อนที่จะมีการติดเชื้อและตัวทำละลายเป็นของขวัญระหว่างการติดเชื้อ เซลล์ที่ถูกบ่มแล้วในตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวสำหรับการเพิ่มการติดเชื้อ 24 ชั่วโมงต่อไปก่อนที่จะถูกเก็บเกี่ยวตามที่อธิบายไว้ข้างต้น. การตรวจโล่titers ไวรัสถูกวัดผ่านการทดสอบการมอบโล่ประกาศเกียรติคุณ ครั้งแรกที่เจือจางอนุกรมของไวรัสถูกดูดกลืนไปไหลมารวมกันเซลล์เวโรเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในปริมาณเล็กน้อยของ DMEM ฟรีซีรั่ม ไวรัสจะถูกลบออกแล้วจากเซลล์และซ้อนทับ agarose (ปริมาณที่เท่ากันของ 2 × DMEM และ 1.8% ละลาย agarose (Invitrogen คอร์ปอเรชั่น)) ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากนั้น 2 วันซ้อนทับ agarose เพิ่มเติมที่มีสีแดงเป็นกลาง 0.015% (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH) ถูกบันทึกอยู่ในเซลล์ ประมาณ 24 ชั่วโมงต่อมาโล่ชัดเจนนับและเชื้อไวรัสจะถูกคำนวณในการขึ้นรูปอนุภาคหน่วย / ml (PFU / ml)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีการเซลล์และไวรัส

เวโรเซลล์ถูกเก็บรักษาไว้ในกลูโคสสูงดัลเบโค่การนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ) ( Invitrogen Corporation , Carlsbad , CA ) เสริมด้วย 10% เซรั่มของลูกวัว ( แอตแลนตาทุกอย่าง Norcross , GA , ) และ 0.1 มก. / มล. normocin ( invivogen , San Diego , CA ) ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ เวโรดัดแปลงโบเด็ตสายพันธุ์ของ IBV [ 45 ] ถูกใช้ในการทดลองเชื้อ IBV .และมีการปฏิบัติกับเชื้อโดยเวโรเซลล์ การเตรียมสารสกัดจากพืช



0.6 g R . rosea รากผง ( starwest botanicals Sacramento , CA ) คือ ) 5 ml 70% เอทานอล ( ซิกม่า Aldrich St . Louis , MO ) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิที่ [ 32 ] 1.5 g . sativa เมล็ด ( พรมแดนธรรมชาติผลิตภัณฑ์ Co op , นอร์เวย์IA ) เป็นโฮโม 10 ml ของเอทานอล 85% และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 7 D [ 46,47 ] คือ g S . ไนกร้าผลไม้ ( ซานฟรานซิสโก สมุนไพร บริษัท , ซานฟรานซิสโก , CA ) เป็นโฮโม 40 มิลลิลิตรเอทานอล 80% และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 D [ 48 ] ต่อไปนี้ incubations เหล่านี้สกัดไฟฟ้าโซลูชั่นที่ 1900 × G สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อเอาเศษที่เหลือ คือ นำเข็มฉีดยาและกรองผ่านเมมเบรน ( 0.22 μ M ีนฟลูออไรด์บริษัทฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , สนามหญ้า , ยุติธรรม NJ ) โซลูชั่นสกัดทั้งหมดเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C )



เซลล์เซลล์มีการชุบใน 35 มม. จานในซ้ำประมาณ 1 D ก่อนที่จะได้รับการรักษาด้วยสารสกัดจากพืชที่เวลา 48 ชั่วโมง ความเข้มข้นระหว่าง 7.5 × 1.2 × 10-5 g / ml 10-3 g / ml . rosea สกัด จาก 9.4 × 10-5 กรัม / มิลลิลิตร 1.5 × 10-3 g / ml . , สารสกัดจาก 5.0 × 10-4 g / ml ถึง 8.0 × 10-3 g / ml เอสไนกร้าแยกความเข้มข้นของสารละลายสุดท้ายคงที่ในอัตรา 0.04 % สารสกัดเอทานอลอาร์ rosea รักษาเอทานอล 0.2% สำหรับเอ็น , สารสกัด , การรักษาและ 0.4 % เอทานอลสำหรับเอสไนกร้าแยกการรักษา ที่ 48 ชั่วโมงหลังการรักษา supernatants ประกอบด้วยเซลล์ที่ตายแล้วถูกรวบรวมและรวมกับเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวสานุศิษย์ใช้ 005 % ซิน ( Invitrogen Corporation ) ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ของดัลเบโค่น้ำเกลือ ( ซิกม่า Aldrich St . Louis , MO ) 20 มิลลิลิตรของสารละลายนี้แล้วรวมกับปริมาณเท่ากันของไตรแพน 0.6% สีฟ้า ( ซิกม่า Aldrich ) จํานวนอยู่เซลล์ต่อมิลลิลิตร ในแต่ละจานถูกนับในการทำซ้ำการใช้กล้องจุลทรรศน์แสงและ hemocytometer .ความมีชีวิตของเซลล์เมื่อคำนวณเป็นมีชีวิตเซลล์ต่อมิลลิลิตรในอาหารเมื่อเทียบกับตัวทำละลายสกัดการรักษาอาหาร

การติดเชื้อในการปรากฏตัวของสารสกัดจากพืช

หน้าจอป้องกัน IBV ลักษณะเซลล์มีการชุบจาน 35 มม. ประมาณ 2 D ก่อนที่จะถูกรักษาด้วย 3.75 × 10-4 g / ml . , สารสกัด 1.5 × 10-4 g / ml . rosea สารสกัดหรือ 4.0 × 10-3 g / ml .ไนกร้าแยกเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ควบคุมเซลล์ R . rosea , เอ็น , และ S . ไนกร้าแยกการทดลองบ่มในขั้นสุดท้ายของเอทานอลความเข้มข้น 0.04 % 0.2 % เอทานอล เอทานอลและ 0.4 ตามลำดับ ก่อนมีการติดเชื้อไวรัสเชื้อ IBV เหล่านี้เดียวกัน , ความเข้มข้นของ สารสกัดจากพืช ( หรือตัวทำละลายอย่างเดียว ) สำหรับ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องการติดเชื้อ IBV ก็แสดงที่หลายหลากของการติดเชื้อ ( MOI ) ของทั้ง 1 หรือ 0.1 โดยอนุญาตให้ไวรัสดูดเซลล์ในปริมาณเล็ก ๆของ serum-free dmem เสริมด้วยสารสกัดจากพืช หรือตัวทำละลายคนเดียวเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา เซล แล้วย้ายไป dmem สดเสริมด้วยซีรัม 10 เปอร์เซ็นต์ของทารกในครรภ์ น่อง ยาปฏิชีวนะ และ สารสกัดจากพืช หรือตัวทำละลายในอีก 24 ชั่วโมงผล cytopathic ไวรัสแล้วประเมินทางสายตาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงและ supernatants ติดไวรัสและเซลล์เก็บแยกต่างหาก supernatants รวบรวมระดับที่ 1900 × G สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อเอาเศษเซลล์และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ - 80 องศา C โดยไวรัสจนสามารถวิเคราะห์ .เซลล์ คือ dmem สดเสริมด้วยซีรัมลูกโค และ 10% ของยาปฏิชีวนะก่อนที่จะถูก lysed 3 รอบตามเกิด . ปั่นที่ 1900 × G สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ลบเซลล์และนำเศษที่เหลือ คือที่อุณหภูมิ - 80 องศา C โดยไวรัสจนสามารถวิเคราะห์

หลังจากที่เริ่มต้นการคัดกรอง ดังต่อไปนี้ .ไนกร้าแยกการทดลองประเมินความสามารถในการยับยั้ง IBV อย่างใดอย่างหนึ่งเพียงอย่างเดียวหรือรวมกัน ( 1 ) เปิดเผยเซลล์เพื่อสกัดก่อนที่จะติดเชื้อ ( 2 ) การเปิดเผยเซลล์แยกดังต่อไปนี้การติดเชื้อไวรัส ( 3 ) การเปิดเผยเพื่อสกัดก่อนการติดเชื้อ ( 4 ) การเปิดเผยทั้งเซลล์และไวรัส เพื่อแยกระหว่างเชื้อ เชื้อ ทำที่ มท. 0.1 ตามที่ระบุไว้ข้างต้นยกเว้นการอยู่คนเดียวเป็นตัวทำละลายทดแทนการเอสไนกร้าแยกหากการรักษาที่เฉพาะเจาะจงถูกละเว้น . ตัวอย่างเช่น เพื่อศึกษาผลของการเปิดเผยเซลล์เอสไนกร้าแยกก่อนการติดเชื้อเซลล์ถูกบ่มด้วย 4 มก. / มล. ของเอสไนกร้าแยก 24 ชั่วโมงก่อนที่จะติดเชื้อไวรัสถูกบ่มในตัวทำละลายคนเดียว 20 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ และตัวทำละลายเป็นปัจจุบันในระหว่างการติดเชื้อ เซลล์แล้วบ่มในตัวทำละลายคนเดียวอีก 24 H ดังต่อไปนี้การติดเชื้อก่อนการเก็บเกี่ยวตามที่อธิบายไว้ข้างต้น .



โดยจุลินทรีย์หรือไวรัสมี quantified ผ่าน คราบแบคทีเรีย ครั้งแรกซีเรียลเจือจางของไวรัสถูกดูดซึมไปกระจู๋กระจี๋เวโรเซลล์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ใน จำนวนเล็ก ๆของ เซรั่ม dmem ฟรี ไวรัสถูกลบออกจากเซลล์และการ ( Overlay ( ปริมาณเท่ากับ 2 × dmem และ 1.8 % ละลาย ( ( Invitrogen Corporation ) ได้เพิ่ม หลังจาก 2 D , เพิ่มเติม , ซ้อนที่มี 0.015 % เป็นกลางสีแดง ( MP biomedicals , LLC , โซลอน , โอไฮโอ ) คือการเพิ่มเซลล์ประมาณ 24 ชั่วโมงต่อมา ล้างไวรัสและโล่ถูกนับโดยคำนวณในรูปหน่วย / มล. อนุภาค ( พีเอฟยู / ml )