For hormonal analysis, plant materi

For hormonal analysis, plant material grown on
flowering inductive and non-inductive media was
collected at the beginning of the experiment
(day 0) and at 5-d intervals up to 40 d. One-gram
samples of fresh tissue, obtained from a compound
mixture of nine randomly selected shoots, were
collected at each harvesting time, frozen in liquid
nitrogen and maintained at
20 1C. The endogenous
levels of the CKs Z, [9R]Z, iP, and [9R]iP were
determined using the immunoenzymatic method
performed according to Maldiney et al. (1986) with
a few modifications. The procedure used in the present study allowed for determination of the CKs
in the same extract. The previously frozen samples
were macerated in cold 80% (v/v) methanol
containing butylhydroxytoluene (0.18 mM) as an
antioxidant. Tritiated radiolabeled standards ([3H]
IAA, Amershams and [3H]Z, Isotope Laboratorys
with specific activity of 9.25103 and 1.85
107 Bq, respectively) were added to the samples
for recovery estimation after purification. Also,
550 ng of [13C6]-IAA (Cambridge Isotopes, Inc.) was
added as an internal standard for the GC-MS-SIM
quantification. After 60 h of constant shaking at 4 1C
in the dark, the methanolic extracts were filtered
through 0.45 and 0.22 mm cellulose acetate membranes
(Millipores) and then passed through a Sep-
Pak C-18 (Waterss) cartridge. After filtration,
eluates were reduced to dryness in a speed vacuum
concentrator (Speed Vac, Hetos, CT 100) and the
residues redissolved in 100 mL acid water (ultrapure
water+0.2% formic acid, pH 3.0). The hormones
were then separated over 80 min by high-performance
liquid chromatography (HPLC) using a
reverse phase, semi-preparative, C-18 column
(Waterss, Prep Nova-Pak, 6 mm, 7.8300 mm), at
a flow rate of 3 mL/min with a methanol: acid
water gradient. The gradient consisted of 5%
methanol: 95% acid water, v/v (0–15 min), 30%
methanol: 70% acid water, v/v (16–50 min), and 45%
methanol: 55% acid water, v/v (51–80 min). Fractions
were collected at 30-s intervals and reduced
to dryness in a speed vacuum concentrator. The
measurements of Z, [9R]Z, iP and [9R]iP were
carried out by the enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) method with polyclonal rabbit anti-
[9R]Z (for Z and [9R]Z) and anti-[9R]iP (for iP and
[9R]iP) antibodies. The hormone level in each
sample was measured four times and the standard
error was calculated. Calculations were made by
reference to a calibration curve established on
each microtitration plate with a fourth-order
polynomial regression obtained from four experimental
standard curves.
IAA quantification was carried out by GC-MS-SIM
based on Chen et al. (1988). HPLC fractions
correspondent to IAA were methylated with 1mL
etheric diazomethane for 5 min and reduced to
dryness at room temperature. The methylated
extracts were redissolved in 100 mL ethyl acetate
and analyzed in a gas chromatograph Hewlett-
Packards 6890 connected to a mass spectrometer
detector model 5973. The column used for separation
was an HP-1701 (30 m, I.D. 0.25 mm, I.T.
0.5 mm) and helium was the carrier gas, with a flux
of 4 mL/min. The injected volume for each sample
was 5 mL. Ions with a mass/charge (m=z) ratio
between 130 and 136 (endogenous IAA), and between 136 and 195 (internal standard) were
monitored. The endogenous IAA concentration was
obtained by comparing the peak areas of the
chromatograms extracted in m=z 130–136 and
136–195.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับการวิเคราะห์ของฮอร์โมนพืชที่ปลูกในดอกสื่ออุปนัยและไม่อุปนัยถูกเก็บรวบรวมไว้ที่จุดเริ่มต้นของการทดสอบ(วันที่ 0) และในช่วงเวลา 5 วันถึง 40 วัน หนึ่งแกรมตัวอย่างของเนื้อเยื่อสดที่ได้จากการผสมส่วนผสมของเก้าหน่อสุ่มเลือกถูกเรียกเก็บเมื่อเวลาเก็บเกี่ยวแต่ละแช่แข็งในของเหลวไนโตรเจนและเก็บรักษาไว้ที่20 1C ภายนอกระดับของ CKs Z [9R] Z, IP, และ [9R] iP ถูกกำหนดโดยใช้วิธีimmunoenzymatic ดำเนินการตาม Maldiney et al, (1986) ที่มีการปรับเปลี่ยนไม่กี่ ขั้นตอนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้รับอนุญาตให้กำหนด CKs ในสารสกัดเดียวกัน กลุ่มตัวอย่างที่แช่แข็งก่อนหน้านี้ถูกหมักในเย็น 80% (v / v) เมทานอลที่มีbutylhydroxytoluene (0.18 มม) เป็นสารต้านอนุมูลอิสระ Tritiated มาตรฐาน radiolabeled ([3H] IAA, Amershams และ [3H] Z, ไอโซโทป Laboratorys กับกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงของ 9.25? 1.85 และ 103? 107 Bq ตามลำดับ) ถูกเพิ่มเข้าไปในกลุ่มตัวอย่างสำหรับการประมาณการกู้คืนหลังจากที่บริสุทธิ์ นอกจากนี้550 นาโนกรัมของ [13C6] -IAA (เคมบริดจ์ไอโซโทป, Inc) ได้เพิ่มเป็นมาตรฐานภายในสำหรับGC-MS-SIM ปริมาณ หลังจาก 60 ชั่วโมงคงสั่นที่ 4 1C ในที่มืด, สารสกัดเมทานอลได้รับการกรองผ่าน0.45 และ 0.22 มมเยื่อเซลลูโลสอะซิเตท(Millipores) และผ่านไปแล้วผ่าน ก.ย. ปาก C-18 (Waterss) ตลับหมึก หลังจากการกรองeluates ถูกลดความแห้งกร้านในสุญญากาศความเร็วหัว(ความเร็ว Vac, Hetos, CT 100) และสารตกค้างในน้ำredissolved กรด 100 มิลลิลิตร (บริสุทธิ์น้ำ+ 0.2% กรดค่า pH 3.0) ฮอร์โมนที่ถูกแยกออกแล้วกว่า 80 นาทีโดยมีประสิทธิภาพสูงของเหลวchromatography (HPLC) โดยใช้ขั้นตอนกลับกึ่งเตรียมคอลัมน์C-18 (Waterss, เตรียมโนวาปาก, 6 มม 7.8? 300 มิลลิเมตร) ที่ไหลอัตรา 3 มิลลิลิตร / นาทีด้วยเมทานอลกรดลาดน้ำ การไล่ระดับสีประกอบด้วย 5% เมทานอล: กรดน้ำ 95% ปริมาตร / ปริมาตร (0-15 นาที) 30% เมทานอล: กรดน้ำ 70% ปริมาตร / ปริมาตร (16-50 นาที) และ 45% เมทานอลกรด 55% น้ำปริมาตร / ปริมาตร (51-80 นาที) เศษส่วนที่ถูกเก็บรวบรวมในช่วงเวลา 30 วินาทีและลดความแห้งกร้านในหัวสูญญากาศความเร็ว วัด Z [9R] Z, IP และ [9R] iP ถูกดำเนินการโดยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงอิมมูโนทดสอบ(ELISA) วิธีการที่มีกระต่ายโพลีต่อต้าน[9R] Z (Z และสำหรับ [9R] Z) และป้องกัน - [9R] IP (IP และสำหรับ[9R] IP) แอนติบอดี ระดับฮอร์โมนในแต่ละตัวอย่างวัดครั้งที่สี่และมาตรฐานข้อผิดพลาดที่คำนวณได้ การคำนวณที่ถูกสร้างขึ้นโดยการอ้างอิงถึงเส้นโค้งการสอบเทียบจัดตั้งขึ้นเมื่อแผ่นmicrotitration แต่ละคนมีสี่เพื่อการถดถอยพหุนามที่ได้รับจากการทดลองสี่เส้นโค้งมาตรฐาน. ปริมาณ IAA ได้ดำเนินการโดย GC-MS-SIM บนพื้นฐานของเฉินและอัล (1988) HPLC เศษส่วนสอดคล้องกับIAA ถูก methylated กับ 1 mL etheric diazomethane เวลา 5 นาทีและลดลงไปแห้งที่อุณหภูมิห้อง สารสารสกัดถูก redissolved ใน 100 มลเอทิลอะซิเตทและวิเคราะห์ในก๊าซChromatograph Hewlett-Packards 6890 เชื่อมต่อกับสเปกโตรมิเตอร์มวลตรวจจับรูปแบบ5973. คอลัมน์ที่ใช้ในการแยกเป็นHP-1701 (30 เมตร, ID 0.25 มมไอที0.5 มม ) และฮีเลียมเป็นก๊าซที่มีฟลักซ์4 มิลลิลิตร / นาที ปริมาณการฉีดในแต่ละตัวอย่าง5 มิลลิลิตร ไอออนมีมวล / ค่าใช้จ่าย (m = ซี) อัตราระหว่าง130 และ 136 (ภายนอก IAA) และระหว่าง 136 และ 195 (มาตรฐานภายใน) ได้รับการตรวจสอบ ความเข้มข้น IAA ภายนอกได้รับโดยการเปรียบเทียบพื้นที่จุดสูงสุดของchromatograms สกัดใน m = z ที่ 130-136 และ136-195

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับการวิเคราะห์ฮอร์โมน วัสดุปลูกที่ดอกไม่แบบอุปนัยและสื่อ

เก็บอยู่ที่จุดเริ่มต้นของการทดลอง
( วันที่ 0 ) และในช่วงเวลา 5-d ถึง 40 D หนึ่งกรัม
ตัวอย่างเนื้อเยื่อสด ที่ได้จากสารผสมของเก้า
สุ่มยิง ,
เก็บในแต่ละเวลาเก็บเกี่ยวแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว
และรักษาที่
20 c .
ภายนอกระดับของ CKS Z , [ 9R ] Z , IP , และ [ 9R ] IP คือใช้วิธี immunoenzymatic

ตั้งใจปฏิบัติตาม maldiney et al . ( 1986 )
การปรับเปลี่ยนไม่กี่ . ขั้นตอนที่ใช้ในการศึกษาที่ได้รับอนุญาตสำหรับการกำหนดของ CKS
ในแยกเหมือนกัน แช่แข็งก่อนหน้านี้มีตัวอย่าง
macerated ในเย็น 80 % ( v / v ) เมทานอล ( 0.18 มม. ) ที่มี butylhydroxytoluene

เป็นสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน radiolabeled tritiated ( [ 3 ]
IAA amershams และ [ 3 ] , Z , ไอโซโทป laboratorys
กับกิจกรรมจำเพาะของ 9.25  และ 1.85 
107 ( ตามลำดับ ) มีการเพิ่มตัวอย่าง
สำหรับการกู้คืนประมาณหลังจากบริสุทธิ์ นอกจากนี้
550 ng [ 13c6 ] - IAA ( เคมบริดจ์ไอโซโทป , Inc ) คือ
เพิ่มเป็นมาตรฐานภายในเพื่อ gc-ms-sim
ปริมาณ . หลังจาก 60 H คงสั่นที่ 4 c
ในความมืดสารสกัดเมทานอลเป็นกรอง
ผ่าน 0.45 และเซลลูโลสอะซิเตท 0.22 มม. +
( millipores ) และจากนั้นผ่านก.ย. -
- ( ปาก waterss ) ตลับหมึก หลังจากการกรอง
eluates ถูกลดความแห้งกร้านในความเร็ว ( ความเร็ว VAC , สูญญากาศ
หัว hetos , CT ) และ
กาก redissolved 100 มิลลิลิตรกรดน้ำบริสุทธิ์มาก
น้ำ 0.2 % กรด pH 3.0 ) ฮอร์โมน