2.4 Keratinocyte culture and isolat

2.4 Keratinocyte culture and isolation
Keratinocytes can either be maintained under feeder layer-dependent conditions as
essentially described by a method developed by Rheinwald and Green or under defined
conditions in serum-free, media with a low calcium concentration as proposed by Boyce and
Ham in 1983 (Rheinwald & Green, 1975, Boyce & Ham, 1983). Both methods have certain
advantages and disadvantages and the users have to decide about their culture strategy
based on the specific demands of their application.
For example, in cultures kept in conditions without feeder cells contamination with other
cells, growing rapidly under feeder-layer conditions, is suppressed; nevertheless replication
of keratinocytes is limited (Krueger et al, 1994, Rochat et al, 1994). In contrast, serumcontaining
culture medium significantly increases the amount of undesired cells (e.g.
fibroblasts and melanocytes) decreasing the amount of attaching keratinocytes at the same
time.
Other advantages of serum- and feeder-based techniques include higher resistance to
apoptosis, e.g. after adenoviral infection. It has also to be taken into concern that it is
possible to switch to serum-free culture conditions at any time point while changing from
serum-free medium to serum-based conditions is not recommended (Aasen & Belmonte,
2010). Nevertheless, cell size enlargement has been observed by several authors (Inoue et al,
2006, van Rossum et al, 2004) when serum-containing media were used in contrast to serumwww.intechopen.com
Keratinocyte Culture Techniques in Medical and Scientific Applications 251
free cultures. Lorenz et al. explain this by stating that keratinocyte stem cell characteristics
are better preserved in serum-free media (Lorenz et al, 2009). This is in accordance with the
fact that the number of clonogenic cells is increased under appropriate culture conditions.
As keratinocytes usually proliferate in low-calcium (0.15 mM CaCl2) and differentiate in
high-calcium medium (Daniels et al, 1995) it is of importance to avoid any long-term
exposure to high levels of calcium. Compared to some cell types such as fibroblasts,
keratinocytes require more care and avoiding apoptosis in low density cultures, and
differentiation and senescence when reaching confluence is difficult.
As most commercial products available for keratinocyte culture are optimized for human
cells, cultures with cells of non-human organisms are especially difficult to obtain. A
method for long-term culture of newborn C57/BL6 mouse epidermal keratinocytes by using
highly supplemented rodent fibroblast conditioned medium was described by Hager et al.
(Hager et al., 1999). Adult mouse keratinocyte subcultures were established without using
fetal bovine serum (FBS), feeder layers, fibroblast conditioned medium (FCM) or bovine
pituitary extract (Yano & Okochi, 2005). A detailed description of isolation and culture of
keratinocytes from newborn and adult mice was published by Lichti et al. (Lichti et al, 2008).
Rodent monocellular protocols are complex, time consuming and the reproducibility of the
cell isolation is difficult, but as genetically modified mice are a valuable preclinical tool for
understanding pathologies based on genetic disorders, protocols should be optimized and
refined as well. Three dimensional skin models with keratinocytes from wildtype or mutant
mice might thus profit by the recent progress in protocol modification (Lichti et al, 2008).
We established a simplified method for isolation and maintenance of proliferating human
keratinocytes as described before (Radtke et al, 2009). Following this protocol a monoculture
of human keratinocytes could be established without the necessity of co-cultures with
fibroblasts. From our experience several factors played a role in the preparation of pure,
proliferating keratinocyte cultures: 1) donor skin is best from young donors and 2) there are
different regions of the body where the probability of harvesting healthy attaching
keratinocytes is higher. We suggested that the best skin for preparation of keratinocyte
cultures should be taken from anatomical regions without previous mechanical irritation,
less cornification and regions without hair to diminish infection rates; while we did not
recommend using scar tissue or skin containing striae.
2.4.1 Methods for cell culturing of human keratinocytes
Full thickness human skin has to be cut into small pieces and incubated in a dispase II
solution overnight at 37°C. The epidermis should be removed from the dermis with fine
forceps and centrifuged at 220g for 5 minutes. The pellet should be resuspended in a 0.1%
trypsin/0.02% EDTA solution and incubated at room temperature for 15 minutes. Activity
can be stopped by trypsin inhibitor followed by centrifugation. The cells should be
resuspended in Waymouth medium and filtered through a 100 μm mesh. Dissociated cells
can be seeded on uncoated tissue culture flasks. After 48 hours, cell debris and non-adherent
cells should be removed and the culture medium changed to a serum-free keratinocyte
growth medium. The plated cells typically reach 70-80% confluence after 5-7 days.
Cells remain in a proliferative state by subculturing in serum-free medium every time before
reaching confluence. For passage keratinocytes should be washed with PBS and slightly
trypsinized with trypsin (0.05%/0.02% EDTA) at room temperature until the cells start to
retract. The trypsinization has to be stopped after 3 to 5 minutes with trypsin neutralizer.
Cells should be detached off the ground mechanically and immediately centrifuged at 220g
www.intechopen.com
252 Skin Biopsy – Perspectives
for 5 minutes. After splitting to uncoated cell culture dishes, cells usually adhere the same
day and start to divide after 24 to 48 hours. This mild procedure allows passaging vital and
proliferative cells for at least 5 passages in serum-free medium (Promocell, Heidelberg,
Germany) without the need of a fibroblast feeder layer (Radtke et al, 2009). Expansion of
plastic-adherent keratinocytes is achieved without signs of senescence and with doubling
times of 5-7 days. This protocol may facilitate the clinical application of keratinocyte based
therapies.
We cannot define the exact mechanism for attachment of keratinocytes of different species,
but this is one of the key factors in culturing keratinocytes. The attachment of human
keratinocytes in our cultures without large contamination of other cell types such as
fibroblasts or melanocytes, which have normally a greater proliferation rate and would
overgrow the culture in a couple of days, is a clear advantage of this method. The exact
mechanism of keratinocyte attachment is not known and various coating matrices (e.g.
laminin, poly-L-lysin) do not lead to significant differences. In conclusion, we were able to
establish efficient protocols for the handling of keratinocytes for experimental and clinical
purposes, including isolation, cultivation, storage and gene therapeutic manipulations
(Radtke et al, 2009).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 วัฒนธรรม Keratinocyte และแยกอย่างใดอย่างหนึ่งต้องรักษา Keratinocytes ภายใต้เงื่อนไขขึ้นอยู่กับชั้นป้อนเป็นเป็นอธิบาย โดยวิธีการพัฒนา โดย Rheinwald และสีเขียว หรือต่ำกว่ากำหนดเงื่อนไขในซีรั่มฟรี สื่อกับความเข้มข้นต่ำแคลเซียมตามที่เสนอโดยบอยซ์ และแฮมในปี 1983 (Rheinwald & กรีน 1975 บอยซ์และแฮม 1983) ทั้งสองวิธีมีบางข้อดี และข้อเสีย และผู้ใช้ต้องตัดสินใจเกี่ยวกับกลยุทธ์ของพวกเขาวัฒนธรรมตามความต้องการเฉพาะของผู้ตัวอย่าง ในวัฒนธรรมที่ยังคงอยู่ในเงื่อนไขโดยป้อนเซลล์ปนกันระงับเซลล์ การเติบโตอย่างรวดเร็วภายใต้เงื่อนไขที่ป้อนชั้น จำลองอย่างไรก็ตามkeratinocytes เป็นจำกัด (Krueger et al, 1994 โฮเต็ลโรชาท et al, 1994) ในความคมชัด serumcontainingสื่อวัฒนธรรมอย่างมีนัยสำคัญเพิ่มจำนวนของเซลล์ไม่ (เช่นfibroblasts และ melanocytes) ลดลงจำนวนแนบ keratinocytes ที่เดียวกันเวลาอื่น ๆ ข้อดีของเทคนิคใช้เซรั่ม และถาดป้อนกระดาษรวมความต้านทานสูงขึ้นไปapoptosis เช่นหลังจากการติดเชื้อ adenoviral จึงมีควรเป็นกังวลว่าสามารถสลับเงื่อนไขฟรีเซรั่มวัฒนธรรมตลอดเวลาขณะเปลี่ยนจากกลางฟรีเซรั่มเซรั่มตามเงื่อนไขไม่แนะนำ (Aasen & Belmonte2010) . อย่างไรก็ตาม ขยายขนาดของเซลล์มีการสังเกต โดยผู้เขียนหลาย (โนะอุเอะ et al2006, van Rossum et al, 2004) เมื่อใช้เซรั่มที่ประกอบด้วยสื่อตรงข้าม www.intechopen.com เซรั่มเทคนิคการแพทย์ และวิทยาศาสตร์ประยุกต์ 251 Keratinocyte วัฒนธรรมวัฒนธรรมฟรี ชายลอเรนซ์ et al. อธิบายนี้ โดยระบุว่า keratinocyte ลักษณะเซลล์ต้นกำเนิดดีกว่าจะรักษาไว้ในสื่อฟรีเซรั่ม (ชายลอเรนซ์ et al, 2009) โดยสอดคล้องกับการความจริงที่ว่า จำนวนของเซลล์ clonogenic จะเพิ่มขึ้นภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมวัฒนธรรมKeratinocytes proliferate ต่ำแคลเซียม (0.15 mM CaCl2) และมักจะแยกความแตกต่างในแคลเซียมสูงขนาดกลาง (แดเนียล et al, 1995) เป็นสำคัญเพื่อหลีกเลี่ยงการระยะยาวสัมผัสกับระดับแคลเซียมสูง เมื่อเทียบกับเซลล์บางชนิดเช่น fibroblastskeratinocytes ต้องดูแลเพิ่มมากขึ้นและหลีกเลี่ยงการ apoptosis ในวัฒนธรรมความหนาแน่นต่ำ และสร้างความแตกต่างและ senescence เมื่อถึงบรรจบได้ยากสินค้าส่วนใหญ่เป็นใน keratinocyte วัฒนธรรมนี้เหมาะสำหรับบุคคลเซลล์ วัฒนธรรมกับเซลล์ของสิ่งมีชีวิตไม่ใช่มนุษย์เป็นอย่างยิ่งยากที่จะได้รับ Aวิธีการวัฒนธรรมระยะยาวของทารก C57/BL6 เมาส์ epidermal keratinocytes โดยกลางสูงเสริม rodent fibroblast ปรับอากาศถูกอธิบายโดย Hager et al(Hager et al., 1999) เมาส์ผู้ใหญ่ subcultures keratinocyte ก่อตั้งขึ้นโดยเซรั่มวัวและทารกในครรภ์ (FBS), ถาดป้อนกระดาษชั้น fibroblast ปรับอากาศปานกลาง (FCM) หรือวัวต่อมใต้สมองแยก (Yano & Okochi, 2005) คำอธิบายโดยละเอียดของแยกและวัฒนธรรมkeratinocytes from newborn and adult mice was published by Lichti et al. (Lichti et al, 2008).Rodent monocellular protocols are complex, time consuming and the reproducibility of thecell isolation is difficult, but as genetically modified mice are a valuable preclinical tool forunderstanding pathologies based on genetic disorders, protocols should be optimized andrefined as well. Three dimensional skin models with keratinocytes from wildtype or mutantmice might thus profit by the recent progress in protocol modification (Lichti et al, 2008).We established a simplified method for isolation and maintenance of proliferating humankeratinocytes as described before (Radtke et al, 2009). Following this protocol a monocultureof human keratinocytes could be established without the necessity of co-cultures withfibroblasts. From our experience several factors played a role in the preparation of pure,proliferating keratinocyte cultures: 1) donor skin is best from young donors and 2) there aredifferent regions of the body where the probability of harvesting healthy attachingkeratinocytes is higher. We suggested that the best skin for preparation of keratinocytecultures should be taken from anatomical regions without previous mechanical irritation,less cornification and regions without hair to diminish infection rates; while we did notrecommend using scar tissue or skin containing striae.2.4.1 Methods for cell culturing of human keratinocytesFull thickness human skin has to be cut into small pieces and incubated in a dispase II
solution overnight at 37°C. The epidermis should be removed from the dermis with fine
forceps and centrifuged at 220g for 5 minutes. The pellet should be resuspended in a 0.1%
trypsin/0.02% EDTA solution and incubated at room temperature for 15 minutes. Activity
can be stopped by trypsin inhibitor followed by centrifugation. The cells should be
resuspended in Waymouth medium and filtered through a 100 μm mesh. Dissociated cells
can be seeded on uncoated tissue culture flasks. After 48 hours, cell debris and non-adherent
cells should be removed and the culture medium changed to a serum-free keratinocyte
growth medium. The plated cells typically reach 70-80% confluence after 5-7 days.
Cells remain in a proliferative state by subculturing in serum-free medium every time before
reaching confluence. For passage keratinocytes should be washed with PBS and slightly
trypsinized with trypsin (0.05%/0.02% EDTA) at room temperature until the cells start to
retract. The trypsinization has to be stopped after 3 to 5 minutes with trypsin neutralizer.
Cells should be detached off the ground mechanically and immediately centrifuged at 220g
www.intechopen.com
252 Skin Biopsy – Perspectives
for 5 minutes. After splitting to uncoated cell culture dishes, cells usually adhere the same
day and start to divide after 24 to 48 hours. This mild procedure allows passaging vital and
proliferative cells for at least 5 passages in serum-free medium (Promocell, Heidelberg,
Germany) without the need of a fibroblast feeder layer (Radtke et al, 2009). Expansion of
plastic-adherent keratinocytes is achieved without signs of senescence and with doubling
times of 5-7 days. This protocol may facilitate the clinical application of keratinocyte based
therapies.
We cannot define the exact mechanism for attachment of keratinocytes of different species,
but this is one of the key factors in culturing keratinocytes. The attachment of human
keratinocytes in our cultures without large contamination of other cell types such as
fibroblasts or melanocytes, which have normally a greater proliferation rate and would
overgrow the culture in a couple of days, is a clear advantage of this method. The exact
mechanism of keratinocyte attachment is not known and various coating matrices (e.g.
laminin, poly-L-lysin) do not lead to significant differences. In conclusion, we were able to
establish efficient protocols for the handling of keratinocytes for experimental and clinical
purposes, including isolation, cultivation, storage and gene therapeutic manipulations
(Radtke et al, 2009).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 keratinocyte วัฒนธรรมและการแยก
Keratinocytes สามารถได้รับการรักษาภายใต้เงื่อนไขที่ชั้นขึ้นอยู่กับการป้อนเป็น
หลักโดยอธิบายวิธีการพัฒนาโดย Rheinwald และสีเขียวหรือภายใต้การกำหนด
เงื่อนไขในซีรั่มฟรีสื่อที่มีความเข้มข้นแคลเซียมต่ำที่เสนอโดยบอยซ์และ
สต์แฮมในปี 1983 (Rheinwald และสีเขียวปี 1975 บอยซ์และแฮม, 1983) ทั้งสองวิธีมีบาง
ข้อดีและข้อเสียและผู้ใช้ต้องตัดสินใจเกี่ยวกับกลยุทธ์วัฒนธรรมของพวกเขา
ขึ้นอยู่กับความต้องการที่เฉพาะเจาะจงของแอพลิเคชันของพวกเขา.
ยกตัวอย่างเช่นในวัฒนธรรมที่เก็บไว้ในเงื่อนไขโดยไม่ต้องป้อนการปนเปื้อนอื่น ๆ เซลล์ที่มี
เซลล์ที่เติบโตอย่างรวดเร็วภายใต้เงื่อนไขที่ป้อนชั้น คือเก็บกด; แต่การทำแบบจำลอง
ของ keratinocytes ถูก จำกัด (ครูเกอร์, et al, 1994 Rochat, et al, 1994) ในทางตรงกันข้าม serumcontaining
กลางวัฒนธรรมอย่างมีนัยสำคัญเพิ่มจำนวนของเซลล์ที่ไม่พึงประสงค์ (เช่น
เซลล์และ melanocytes) การลดจำนวนการติด keratinocytes ที่เดียวกัน
เวลา.
ข้อดีอื่น ๆ ของ serum- และเทคนิคการป้อนตามรวมถึงความต้านทานที่สูงขึ้นเพื่อ
การตายของเซลล์เช่นหลังจากการติดเชื้อ adenoviral . มันยังจะต้องนำมากังวลว่ามันเป็น
ไปได้ที่จะเปลี่ยนไปใช้เงื่อนไขวัฒนธรรมเซรั่มฟรีที่จุดเวลาใด ๆ ในขณะเปลี่ยนจาก
กลางซีรั่มฟรีกับเงื่อนไขในซีรั่มที่ใช้ไม่แนะนำ (Aasen และเบลมอนต์
2010) อย่างไรก็ตามการขยายขนาดของเซลล์ได้รับการปฏิบัติโดยผู้เขียนหลายคน (อิโนอุเอะ, et al,
2006, ซัมรถตู้, et al, 2004) เมื่อสื่อในซีรั่มที่มีส่วนผสมของถูกนำมาใช้ในทางตรงกันข้ามกับ serumwww.intechopen.com
keratinocyte เทคนิควัฒนธรรมในทางการแพทย์และการประยุกต์ใช้วิทยาศาสตร์ 251
ฟรี วัฒนธรรม และอัลลอเรน อธิบายเรื่องนี้โดยระบุว่าลักษณะเซลล์ต้นกำเนิด keratinocyte
จะถูกเก็บไว้ที่ดีขึ้นในสื่อฟรีเซรั่ม (อเรนซ์ et al, 2009) นี้เป็นไปตาม
ความจริงที่ว่าจำนวนของเซลล์ clonogenic จะเพิ่มขึ้นภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมวัฒนธรรม.
ในฐานะที่เป็น keratinocytes มักจะแพร่หลายในแคลเซียมต่ำ (0.15 มิลลิ CaCl2) และความแตกต่างใน
ขนาดกลางสูงแคลเซียม (แดเนียลส์, et al, 1995) มันเป็นของ เพื่อหลีกเลี่ยงความสำคัญใด ๆ ในระยะยาว
การสัมผัสกับระดับสูงของแคลเซียม เมื่อเทียบกับบางเซลล์ชนิดเช่นเซลล์,
keratinocytes ต้องการการดูแลมากขึ้นและหลีกเลี่ยงการตายของเซลล์ในวัฒนธรรมที่มีความหนาแน่นต่ำและ
ความแตกต่างและการเสื่อมสภาพเมื่อถึงจุดบรรจบเป็นเรื่องยาก.
ในฐานะที่เป็นผลิตภัณฑ์ในเชิงพาณิชย์มากที่สุดสำหรับวัฒนธรรม keratinocyte จะเหมาะสำหรับมนุษย์
เซลล์วัฒนธรรมกับเซลล์ที่ไม่ใช่ ชีวิต -human โดยเฉพาะอย่างยิ่งยากที่จะได้รับ
วิธีการเพาะเลี้ยงในระยะยาวของทารกแรกเกิด C57 / BL6 เมาส์ keratinocytes ผิวหนังโดยใช้
เสริมสูง fibroblast หนูกลางปรับอากาศถูกอธิบายโดย Hager et al.
(Hager et al., 1999) เมาส์ผู้ใหญ่วัฒนธรรม keratinocyte ถูกจัดตั้งขึ้นโดยไม่ต้องใช้
ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) ชั้นป้อน fibroblast กลางปรับอากาศ (FCM) หรือวัว
สารสกัดจากต่อมใต้สมอง (Yano และ Okochi 2005) คำอธิบายรายละเอียดของการแยกและวัฒนธรรมของ
keratinocytes จากหนูแรกเกิดและผู้ใหญ่ที่ได้รับการตีพิมพ์โดย Lichti et al, (Lichti et al, 2008).
หนูโปรโตคอล monocellular จะซับซ้อนใช้เวลานานและการทำสำเนาของ
การแยกเซลล์เป็นเรื่องยาก แต่เป็นหนูดัดแปลงพันธุกรรมเป็นเครื่องมือที่พรีคลินิกที่มีคุณค่าสำหรับ
การทำความเข้าใจโรคขึ้นอยู่กับความผิดปกติทางพันธุกรรมโปรโตคอลควรจะเพิ่มประสิทธิภาพและ
การกลั่น ได้เป็นอย่างดี ทั้งสามรุ่นผิวมิติที่มี keratinocytes จาก wildtype หรือกลายพันธุ์
หนูอาจจะทำให้ผลกำไรโดยความคืบหน้าล่าสุดในการปรับเปลี่ยนโปรโตคอล (Lichti et al, 2008).
เราสร้างวิธีการที่เรียบง่ายสำหรับการแยกและการบำรุงรักษา proliferating มนุษย์
keratinocytes ตามที่อธิบายไว้ก่อน (Radtke, et al, 2009) ต่อไปนี้โปรโตคอลนี้เชิงเดี่ยว
ของ keratinocytes มนุษย์จะได้รับการจัดตั้งขึ้นโดยไม่จำเป็นของวัฒนธรรมร่วมกับ
เซลล์ จากประสบการณ์ของเราหลายปัจจัยที่มีบทบาทในการจัดทำบริสุทธิ์
proliferating วัฒนธรรม keratinocyte 1) ผิวที่ดีที่สุดคือผู้บริจาคจากผู้บริจาคหนุ่มสาวและ 2) มี
ภูมิภาคต่าง ๆ ของร่างกายที่น่าจะเป็นของการเก็บเกี่ยวที่ดีต่อสุขภาพแนบ
keratinocytes สูง เราชี้ให้เห็นว่าผิวที่ดีที่สุดในการจัดทำ keratinocyte
วัฒนธรรมที่ควรจะได้รับจากภูมิภาคกายวิภาคปราศจากการระคายเคืองกลก่อนหน้า
cornification น้อยและภูมิภาคโดยไม่ต้องผมที่จะลดอัตราการติดเชื้อ; ในขณะที่เราไม่ได้
แนะนำให้ใช้เนื้อเยื่อแผลเป็นหรือผิวที่มี striae.
2.4.1 วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์ของมนุษย์ keratinocytes
ความหนาเต็มผิวหนังของมนุษย์จะต้องมีการตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และบ่มใน dispase ครั้งที่สอง
การแก้ปัญหาค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หนังกำพร้าจะถูกลบออกจากหนังแท้ปรับ
คีมและหมุนเหวี่ยงที่ 220 กรัมเป็นเวลา 5 นาที เม็ดควรจะ resuspended ใน 0.1%
trypsin / 0.02% วิธีการแก้ปัญหา EDTA และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที กิจกรรม
สามารถหยุดโดยการยับยั้ง trypsin ตามด้วยการหมุนเหวี่ยง เซลล์ควรจะ
resuspended ในสื่อ Waymouth และกรองผ่าน 100 ไมโครเมตรตาข่าย พ้นจากเซลล์
สามารถเมล็ดในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเคลือบผิว หลังจาก 48 ชั่วโมงเศษเซลล์และไม่ใช่สาวก
เซลล์ควรจะออกกลางและวัฒนธรรมเปลี่ยนไปเป็นเซรั่ม keratinocyte ฟรี
สื่อการเจริญเติบโต เซลล์ชุบมักจะไหลมารวมกันถึง 70-80% หลังจาก 5-7 วัน.
เซลล์ยังคงอยู่ในสถานะที่เจริญโดยการถ่ายเชื้อเซรั่มในสื่อฟรีทุกครั้งก่อนที่จะ
ถึงจุดบรรจบ สำหรับ keratinocytes ทางควรล้างด้วยพีบีเอสและเล็กน้อย
trypsinized กับ trypsin (0.05% / 0.02% EDTA) ที่อุณหภูมิห้องจนเซลล์เริ่มต้นที่จะ
ดึง trypsinization จะต้องมีการหยุดหลังจาก 3-5 นาทีกับ neutralizer trypsin.
เซลล์ควรจะแยกออกจากพื้นดินและกลไกหมุนเหวี่ยงได้ทันทีที่ 220 กรัม
www.intechopen.com
ผิว Biopsy 252 - มุมมอง
เป็นเวลา 5 นาที หลังจากที่แยกอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์เคลือบผิวเซลล์มักจะยึดมั่นเดียวกัน
วันและเริ่มที่จะแบ่งหลังจากที่ 24 ถึง 48 ชั่วโมง ขั้นตอนนี้จะช่วยให้อ่อน passaging สำคัญและ
เซลล์เจริญอย่างน้อย 5 ทางเดินกลางในซีรั่มฟรี (Promocell ไฮเดลเบิร์ก,
เยอรมนี) โดยไม่จำเป็นต้องป้อนชั้นลาสท์ (Radtke et al, 2009) การขยายตัวของ
keratinocytes พลาสติกสาวกจะประสบความสำเร็จโดยไม่ต้องสัญญาณของการเสื่อมสภาพและมีความเป็นสองเท่า
ของเวลา 5-7 วัน โปรโตคอลนี้อาจอำนวยความสะดวกในการประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ keratinocyte ตาม
การรักษา.
เราไม่สามารถกำหนดกลไกที่แน่นอนสำหรับสิ่งที่แนบของ keratinocytes ของสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน
แต่นี้เป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญในการเพาะเลี้ยง keratinocytes สิ่งที่แนบมาของมนุษย์
keratinocytes ในวัฒนธรรมของเราโดยไม่มีการปนเปื้อนที่มีขนาดใหญ่ของเซลล์ชนิดอื่น ๆ เช่น
เซลล์หรือ melanocytes ซึ่งปกติมีอัตราการแพร่กระจายมากขึ้นและจะ
มากเกินไปวัฒนธรรมในสองสามวันเป็นข้อได้เปรียบที่ชัดเจนของวิธีการนี้ แน่นอน
กลไกของสิ่งที่แนบ keratinocyte ไม่เป็นที่รู้จักและเมทริกซ์เคลือบต่างๆ (เช่น
laminin โพลี-L-lysin) ไม่ได้นำไปสู่ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ สรุปได้ว่าเราสามารถที่จะ
สร้างโปรโตคอลที่มีประสิทธิภาพสำหรับการจัดการของ keratinocytes สำหรับการทดลองทางคลินิกและ
วัตถุประสงค์รวมทั้งการแยกการเพาะปลูกการเก็บรักษาและการบำบัดรักษาโรคที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมผสม
(Radtke et al, 2009)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัฒนธรรมและ 2.4 คีราติโนไซต์คีราติโนไซต์แยก
สามารถรักษาภายใต้เงื่อนไข เช่น ป้อนชั้นขึ้นอยู่กับ
หลักอธิบายโดยวิธีที่พัฒนาขึ้น โดย rheinwald และสีเขียวหรือภายใต้เงื่อนไขที่กำหนด
serum-free สื่อที่มีความเข้มข้นต่ำ แคลเซียมตามที่เสนอโดยบอยซ์และ
แฮมในปี 1983 ( rheinwald &สีเขียว , 1975 , บอยซ์&แฮม , 1983 ) . ทั้งสองวิธีมีแน่นอน
ข้อดี และข้อเสีย และผู้ใช้ต้องตัดสินใจเกี่ยวกับกลยุทธ์ของพวกเขาวัฒนธรรม
ขึ้นอยู่กับความต้องการเฉพาะของโปรแกรมของพวกเขา .
ตัวอย่างเช่น วัฒนธรรมในเก็บไว้ในเงื่อนไขโดยไม่ต้องป้อนเซลล์กับเซลล์อื่น ๆปนเปื้อน
เติบโตอย่างรวดเร็วภายใต้เงื่อนไข ชั้นป้อนจะถูกระงับ แต่ซ้ำ
ของคีราติโนไซต์จำกัด ( ครูเกอร์ et al , 1994 โรชาท , et al , 1994 )ในทางตรงกันข้าม serumcontaining
อาหารเลี้ยงเชื้ออย่างมีนัยสำคัญเพิ่มปริมาณเซลล์ที่ไม่ต้องการ ( เช่น
fibroblasts และ melanocytes ) ลดจํานวนติดคีราติโนไซต์ในเวลาเดียวกัน
.
ข้อดีอื่น ๆของ เซรั่ม - และอาหารพื้นฐานเทคนิครวมถึงความต้านทานสูงกว่า

( เช่น หลังจากการติดเชื้อ adenoviral . มันยังต้องไปกังวลว่ามัน
เป็นไปได้ที่จะเปลี่ยนไป serum-free สภาพวัฒนธรรม ณ เวลาใดเวลาหนึ่งในขณะที่การเปลี่ยนแปลงจาก
serum-free ) เซรั่มตามเงื่อนไขไม่แนะนำ ( aasen &เบลมอนเต
, 2010 ) อย่างไรก็ตาม การขยายขนาดของเซลล์ได้รับการตรวจสอบโดยผู้เขียนหลาย ( อิโนะอุเอะ et al ,
2006 Van Rossum et al , 2004 ) เมื่อ เซรั่มที่มีการใช้สื่อผสมในทางตรงกันข้ามกับ serumwww . intechopen
. comคีราติโนไซต์เทคนิคการเพาะในทางการแพทย์และทางวิทยาศาสตร์ 251
วัฒนธรรมฟรีโปรแกรม ลอเรนซ์ et al . อธิบายเรื่องนี้ โดยระบุว่าลักษณะเซลล์คีราติโนไซต์ต้น
ดีกว่าเก็บไว้ใน serum-free สื่อ ( ลอเรนซ์ et al , 2009 ) นี้เป็นไปตาม
ที่ว่าจํานวนเซลล์เพิ่มขึ้น ภายใต้เงื่อนไข clonogenic
วัฒนธรรมที่เหมาะสมคีราติโนไซต์มักจะเป็น proliferate ในแคลเซียมต่ำ ( 0.15 มม. ผลิต ) และแยกใน
) แคลเซียมสูง ( แดเนียล et al , 1995 ) มันเป็นสิ่งสำคัญเพื่อหลีกเลี่ยงการใด ๆในระยะยาว
สัมผัสกับระดับสูงของแคลเซียม เมื่อเทียบกับเซลล์ไฟโบรบลาสต์บางชนิดเช่น
คีราติโนไซต์ต้องการการดูแลมากขึ้น , และหลีกเลี่ยงการเกิด apoptosis ในวัฒนธรรมที่ความหนาแน่นต่ำและ
การหาอนุพันธ์และการชราภาพเมื่อถึงจุดบรรจบยาก .
เป็นผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์มากที่สุดของวัฒนธรรม คีราติโนไซต์ที่ดีที่สุดสำหรับเซลล์ของมนุษย์
, วัฒนธรรมกับเซลล์ของมนุษย์สิ่งมีชีวิตโดยเฉพาะอย่างยิ่งยากที่จะได้รับ เป็นวิธีสำหรับวัฒนธรรมระยะยาวของทารกแรกเกิด
c57 / bl6 เมาส์โดยใช้
epidermal คีราติโนไซต์หนูขอเสริมส่วนปรับอากาศขนาดกลางได้อธิบายโดยแฮกเกอร์ et al .
( แฮกเกอร์ et al . , 1999 ) ผู้ใหญ่เมาส์คีราติโนไซต์ subcultures ก่อตั้งขึ้นโดยไม่ต้องใช้เซรั่ม ( FBS )
ครรภ์วัว ชั้นป้อน ส่วนเว็บไซด์ขนาดกลาง ( FCM ) หรือสารสกัดจากต่อมใต้สมอง )
( ยาโนะ&โอโค จิ , 2005 ) รายละเอียดของการแยกและการเพาะเลี้ยงของ
คีราติโนไซต์ จากแรกเกิด และผู้ใหญ่ หนูถูกตีพิมพ์โดย lichti et al . ( lichti et al , 2551 ) .
โปรโตคอล monocellular หนูซับซ้อน ใช้เวลานาน และกระชับ
เซลล์แยกยาก แต่เป็นหนูดัดแปลงพันธุกรรมเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าสำหรับเรา
พยาธิวิทยาพื้นฐานความเข้าใจเกี่ยวกับความผิดปกติทางพันธุกรรม คือ ควรเพิ่มประสิทธิภาพและ
บริสุทธิ์เช่นกันผิวแบบสามมิติกับคีราติโนไซต์จาก wildtype หรือหนูกลายพันธุ์
อาจดังนั้นกำไรจากความก้าวหน้าล่าสุดในการเปลี่ยนแปลงโปรโตคอล ( lichti et al , 2551 ) .
เราสร้างง่ายวิธีการสำหรับการแยกและการรักษา proliferating มนุษย์
คีราติโนไซต์ตามที่อธิบายไว้ก่อน ( radtke et al , 2009 ) ต่อไปนี้เป็นเชิงเดี่ยว
โปรโตคอลของมนุษย์ที่สามารถจะจัดตั้งขึ้นโดยคีราติโนไซต์ความจำเป็นของ Co วัฒนธรรม
จาก . จากประสบการณ์ของเราหลายปัจจัยที่มีบทบาทในการเตรียมการของเพียว
proliferating คีราติโนไซต์วัฒนธรรม : 1 ) ผิวผู้บริจาคที่ดีที่สุดคือจากผู้บริจาคหนุ่มและ 2 ) มี
ภูมิภาคต่าง ๆของร่างกายที่น่าเก็บเกี่ยวสุขภาพแนบ
คีราติโนไซต์จะสูงกว่าเราแนะนำว่าผิวที่ดีที่สุดสำหรับการเตรียมการของเคราติโนไซต์
วัฒนธรรมที่ควรจะได้รับจากภูมิภาคกายวิภาคเชิงกล โดยก่อนหน้านี้เกิดการระคายเคืองน้อยกว่าและไม่มีขน
พลอยหุงภูมิภาคเพื่อลดอัตราการติดเชื้อ ในขณะที่เราไม่ได้
แนะนำโดยใช้เนื้อเยื่อแผลเป็นหรือผิวที่มีรอยตัด .

เซลล์เครื่องมือกำจัดเพื่อย้ายวิธีการเลี้ยงคีราติโนไซต์มนุษย์ความหนาของผิวมนุษย์เต็มรูปแบบ ต้องหั่นเป็นชิ้นเล็ก ๆและ บ่มใน dispase II
โซลูชั่นค้างคืนที่ 37 องศา ผิวหนังชั้นนอกควรจะลบออกจากหนังแท้ปรับไฟฟ้า
คีมที่ . 5 นาที เม็ดควร resuspended ใน 0.1 %
/ ซิน 0.02% ตามลำดับสารละลายและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที กิจกรรม
สามารถหยุดได้โดยเอนไซม์และตามด้วยการปั่นเหวี่ยง เซลล์ควรจะ
resuspended ใน waymouth ขนาดกลาง และกรองผ่าน 100 μเมตรตาข่าย ทางใจเซลล์
สามารถเมล็ดในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเคลือบ . หลังจาก 48 ชั่วโมง เศษเซลล์และไม่ติด
เซลล์ควรเอาออกและสื่อวัฒนธรรมเปลี่ยนไป serum-free คีราติโนไซต์
การเจริญเติบโตปานกลางชุบเซลล์ปกติถึง 70-80% บรรจบหลังจาก 5-7 วัน
เซลล์ยังคงอยู่ในสถานะ proliferative โดยเลี้ยงในอาหาร serum-free ทุกครั้งก่อน
ถึงบรรจบกัน สำหรับเส้นทางคีราติโนไซต์ควรล้างด้วย pbs และเล็กน้อย
trypsinized ด้วยเอนไซม์ ( 0.05 % / 0.02 % ตามลำดับ ) ที่อุณหภูมิห้องจนกว่าเซลล์เริ่ม
ถอนคำพูดการ trypsinization ต้องหยุดหลังจากที่ 3 ถึง 5 นาทีด้วยเอนไซม์นิวทราไลเซอร์ .
เซลล์ควรจะแยกออกจากพื้นกลไกและทันทีระดับที่ .

www.intechopen . com แล้วผิวเนื้อมุมมอง )
5 นาที หลังจากแยกกับจานเพาะเลี้ยงเซลล์เคลือบผิว เซลล์มักจะยึดติดวันเดียวกัน
และเริ่มที่จะแบ่งหลังจากที่ 24 ถึง 48 ชั่วโมงอ่อนนี้จะช่วยให้ขั้นตอนที่สำคัญและ passaging
เซลล์ proliferative อย่างน้อย 5 หัวข้อใน serum-free ขนาดกลาง ( promocell Heidelberg
, เยอรมนี ) โดยไม่จำเป็นต้องของไฟโบรบลาสต์ป้อนชั้น ( radtke et al , 2009 ) การขยายตัวของ
คีราติโนไซต์ติดพลาสติกสําเร็จ โดยไม่มีสัญญาณของการเสื่อมสภาพและเสแสร้ง
ครั้ง 5-7 วัน