To evaluate the specificity of thes

To evaluate the specificity of these amplifications, we used the following set of samples. (i) As
positive controls for M. tuberculosis and M. bovis, DNAs of the recent M. tuberculosis
strain H37Rv and the M. bovis strain BCG P3 were obtained from a
commercial source (Isogen, Maarsen, The Netherlands). These were used at two
different concentrations to evaluate any concentration-dependent difference in
the reaction patterns (10 and 0.1 ng/l). (ii) We analyzed two contemporary
tissue samples obtained from our autopsy files, one with (microbiologically)
confirmed tuberculosis caused by M. tuberculosis and the other with a microbiologically
proven infection by M. bovis. We had tested the spoligotyping patterns
of both samples, which clearly confirmed the infections to be M. tuberculosis and
M. bovis, respectively. From both cases, lung tissue specimens had been fixed in
formaldehyde, routinely embedded into paraffin wax, and used for DNA analysis
as described previously (2). (iii) Eight cases were tested from our ancient Egyptian
samples (see above) which had tested positive for the presence of IS6110 and
for which a spoligotyping pattern had been obtained in parallel.
We chose primer sets amplifying DNA fragments smaller than 200 bp, since
aDNA is known to be significantly degraded so that the amplification of targets
of more than 200 bp is very difficult (29).
For PCR analysis, we selected four different amplification products from the
Mbov, mtp-40, and the oxyR regions (Table 2). (i) The Mbov sequence was
chosen, since it has been published as a specific product of M. bovis (31).
Therefore, the following primers were designed: 5 GAAATTCGCCTCTGTA
GTGCCAC 3 (forward) and 5 GCTGCGTTGACTGAGAAAATGTATG 3
(reverse). The cycling parameters were 45 cycles of 94°C for 1 min and 60°C for
1 min with a final cycle of 72°C at 1 min. (ii) Two primer sets for the mtp-40 gene
were used that have previously been successfully tested on medieval bone material
(41). The mtp-40 sequence (a region including a phospholipase C gene) is
present in M. tuberculosis and thereby allows a distinction between M. tuberculosis
and most M. bovis isolates (7). The primers and reaction conditions were
essentially the same as those described by Taylor et al. (42). (iii) We designed two
new primer sets for the mtp-40 gene on the basis of published M. tuberculosisand
M. bovis-specific gene regions (7). These produce a 152-bp product, and the
primers are mtp40-3 (5 AGTCGCAAAGTTGAACGCTGAGGTC 3) (forward)
and mtp40-4 (5 GTTCCCTGCATTGTCATTTCGCC 3) (reverse). The
cycling parameters were 45 cycles of 94°C for 1 min and 62°C for 1 min with a
final cycle of 72°C at 1 min. (iv) Finally, we examined the pseudogene oxyR
(oxidative response regulator), which contains a sequence polymorphism between
M. tuberculosis and M. bovis (39). The primer sequence and the cycling
conditions were used as described in the literature (42).
Spoligotyping. Spoligotyping was used for further analysis of the samples with
a positive signal for the IS6110 region. The method was performed as described
by Kamerbeek et al. (20), except that the cycle number was increased to 45 cycles.
For this analysis, we used a commercial spoligotyping kit (Isogen, Maarsen, The
Netherlands). The extracted DNA was amplified with primers DRa and DRb,
which enable the amplification of the whole DR region, so that the spacers
between the DR targets can be evaluated. A biotin-labeled reverse primer, Dra,
was used to obtain biotin labeled PCR products after amplification. Subsequently,
the PCR products were perpendicularly hybridized to lines of immobilized
spacer oligonucleotides that represent spacers of known sequence. The
oligonucleotides were covalently linked to an activated membrane in parallel
lines. Following the hybridization, the membrane was incubated with streptavidin
peroxidase. For the detection of the hybridization signals, an enhanced chemiluminescence
(ECL) system was used (Amersham Pharmacia). In this system,
peroxidase catalyzed a reaction, resulting in the emission of light, which can be
visualized by autoradiography (Hyperfilm ECL; Amersham Pharmacia).
Database comparison of spoligotyping results. The resulting spoligotyping
patterns were compared to an international database that contained the following:
(i) a total of 813 spoligotyping patterns reported at least twice, representative
of 11,708 clinical isolates from more than 90 countries, and (ii) 1,300 unique
spoligotyping patterns (I. Filliol et al., unpublished data).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การประเมินความจำเพาะของ amplifications เหล่านี้ เราใช้ค่าตัวอย่าง (i) เป็นบวกการควบคุมวัณโรคและ M. bovis ดีเอ็นเอของวัณโรคการล่าสายพันธุ์ H37Rv และ M. bovis สายพันธุ์ BCG P3 ได้รับจากการแหล่งพาณิชย์ (Isogen, Maarsen ประเทศเนเธอร์แลนด์) เหล่านี้ใช้เวลา 2ความเข้มข้นแตกต่างกันในการประเมินความแตกต่างขึ้นอยู่กับความเข้มข้นรูปแบบปฏิกิริยา (10 และ 0.1 ng / l) (ii) เราวิเคราะห์ร่วมสมัยที่สองตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ได้จากไฟล์ของเราชันสูตรพลิกศพ มี (ปริมาณจุลินทรีย์)วัณโรคเกิดจากวัณโรคและอื่น ๆ ที่มียืนยันเป็นปริมาณจุลินทรีย์ติดเชื้อที่พิสูจน์ โดย M. bovis เราได้ทดสอบรูปแบบ spoligotypingทั้งสองอย่าง ซึ่งการติดเชื้อวัณโรคจะได้รับการยืนยันอย่างชัดเจน และM. bovis ตามลำดับ จากทั้งสองกรณี ตัวอย่างเนื้อเยื่อปอดได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลดีไฮด์ ประจำที่ฝังตัวในพาราฟิน และใช้สำหรับการวิเคราะห์ดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2) (iii) แปดกรณีทดสอบจากอียิปต์โบราณของเราตัวอย่าง (ดูข้างต้น) ซึ่งมีทดสอบในเชิงบวกสำหรับการปรากฏตัวของ IS6110 และซึ่งรูปแบบ spoligotyping มีได้รับขนานเราเลือกสีรองพื้นชุดขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอมีขนาดเล็กกว่า 200 bp เนื่องจากแอดนาเป็นที่รู้จักกันอย่างมีนัยสำคัญลดลงดังนั้นการขยายสัญญาณของเป้าหมายมากกว่า 200 bp คือ ยากมาก (29)สำหรับการวิเคราะห์ PCR เราเลือกสี่แตกต่างขยายผลิตภัณฑ์จากการMbov, mtp-40 และภูมิภาค oxyR (ตารางที่ 2) (i แก้ไขลำดับ Mbov)เลือก เนื่องจากมีการเผยแพร่เป็นผลิตภัณฑ์เฉพาะของ M. bovis (31)ดังนั้น ออกแบบไพรเมอร์ดังต่อไปนี้: 5 GAAATTCGCCTCTGTA3 GTGCCAC (ข้างหน้า) และ 5 GCTGCGTTGACTGAGAAAATGTATG 3(ย้อนหลัง) พารามิเตอร์การขี่จักรยานได้ 45 รอบ 94 องศาเซลเซียส 1 นาที และ 60° C ใน1 นาทีกับวงจรสุดท้าย 72° c เวลา 1 นาที (ii) รองพื้นสองชุดยีน mtp-40ใช้ที่ได้ก่อนหน้านี้ถูกทดสอบแล้วในยุคกลางกระดูกวัสดุ(41) . ลำดับ mtp-40 (ภาครวมถึงยีน phospholipase C) เป็นปัจจุบันในวัณโรค และจึงช่วยให้แบ่งแยกระหว่างวัณโรคและส่วนใหญ่ M. bovis แยก (7) ไพรเมอร์และเงื่อนไขปฏิกิริยาหลักเดียวกับที่อธิบายไว้โดย Taylor et al. (42) (iii) เราออกสองรองพื้นใหม่ชุดยีน mtp-40 ตามประกาศ M. tuberculosisandM. bovis เฉพาะยีนภูมิภาค (7) ผลิตเหล่านี้ผลิตภัณฑ์ 152 bp และไพรเมอร์เป็น mtp40-3 (5 AGTCGCAAAGTTGAACGCTGAGGTC 3) (ไปข้างหน้า)mtp40-4 (5 GTTCCCTGCATTGTCATTTCGCC 3) และ (ย้อนหลัง) การพารามิเตอร์การขี่จักรยานได้ 45 รอบ 94 องศาเซลเซียส 1 นาที และ 62° C 1 นาทีกับการรอบสุดท้าย 72° c เวลา 1 นาที (iv) ในที่สุด เราตรวจสอบ pseudogene oxyR(ตอบสนองออกซิเดชันเกร์), ซึ่งประกอบด้วยการลำดับความแตกต่างระหว่างวัณโรคและ M. bovis (39) ลำดับรองพื้นและการขี่จักรยานเงื่อนไขที่ใช้ในวรรณกรรม (42)Spoligotyping Spoligotyping ใช้สำหรับวิเคราะห์เพิ่มเติมตัวอย่างมีมีสัญญาณในเชิงบวกสำหรับภูมิภาค IS6110 วิธีการดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย Kamerbeek et al. (20), ยกเว้นว่าจำนวนรอบเพิ่มเป็น 45 รอบสำหรับการวิเคราะห์นี้ เราใช้ชุด spoligotyping พาณิชย์ (Isogen, Maarsen การเนเธอร์แลนด์) สกัดดีเอ็นเอถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ DRa และ DRbซึ่งเปิดใช้งานการขยายภาคทั้ง DR เพื่อให้แหวนที่ระหว่าง DR สามารถประเมินเป้าหมาย ชื่อไบโอตินกลับรองพื้น Draถูกใช้เพื่อขอรับป้ายผลิตภัณฑ์ PCR หลังจากขยายไบโอติน ต่อมาผลิตภัณฑ์ PCR ถูกอันไฮบริดบรรทัดของตรึงoligonucleotides แผ่นรองที่แหวนรู้จักลำดับการแสดง การoligonucleotides ถูกเชื่อมโยงด้วยกับเมมเบรนใช้งานควบคู่บรรทัด ต่อไปนี้การ hybridization เมมเบรนมี incubated มี streptavidinฮอส สำหรับการตรวจจับสัญญาณการ hybridization, chemiluminescence ที่เพิ่มขึ้นใช้ระบบ (ECL) (ฟาร์ Amersham) ในระบบนี้ฮอสกระบวนปฏิกิริยา ปล่อยแสง ซึ่งสามารถส่งผลให้โดย autoradiography (Hyperfilm ECL ฟาร์ Amersham)ฐานข้อมูลเปรียบเทียบผลลัพธ์ spoligotyping Spoligotyping ผลรูปแบบถูกเมื่อเทียบกับฐานข้อมูลนานาชาติที่อยู่ต่อไปนี้:(i) รวมรูปแบบ spoligotyping 813 ครั้ง รายงานตัวแทนของคลินิก 11,708 แยกจากมากกว่า 90 ประเทศ และ (ii) 1,300 ไม่ซ้ำกันรูปแบบของ spoligotyping (I. Filliol et al. ยกเลิกประกาศข้อมูล)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อประเมินความจำเพาะของเครื่องขยายเสียงเหล่านี้เราใช้ชุดต่อไปของกลุ่มตัวอย่าง (i) ในฐานะที่เป็น
ตัวควบคุมในเชิงบวกสำหรับวัณโรคและ M. bovis, ดีเอ็นเอของเชื้อวัณโรคเมื่อเร็ว ๆ นี้
สายพันธุ์ H37Rv และ M. bovis BCG ความเครียด P3 ที่ได้รับมาจาก
แหล่งที่มาในเชิงพาณิชย์ (Isogen, Maarsen, เนเธอร์แลนด์) เหล่านี้ถูกนำมาใช้ในสอง
ความเข้มข้นที่แตกต่างกันในการประเมินที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของใด ๆ ใน
รูปแบบการเกิดปฏิกิริยา (10 และ 0.1 ng /? L) (ii) เราวิเคราะห์สองร่วมสมัย
ตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ได้รับจากการชันสูตรศพไฟล์ของเราเป็นหนึ่งเดียวกับ (จุลินทรีย์)
ยืนยันวัณโรคเกิดจากเชื้อวัณโรคและอื่น ๆ ที่มีปริมาณจุลินทรีย์
ติดเชื้อพิสูจน์โดย M. bovis เราได้รับการทดสอบรูปแบบ spoligotyping
ของทั้งสองตัวอย่างที่ชัดเจนได้รับการยืนยันการติดเชื้อที่จะเป็นวัณโรคและ
เอ็ม bovis ตามลำดับ จากทั้งสองกรณีตัวอย่างเนื้อเยื่อปอดได้รับการแก้ไขใน
ฟอร์มาลดีไฮด์ฝังเข้าไปประจำขี้ผึ้งพาราฟินและใช้สำหรับการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2) (iii) แปดกรณีได้รับการทดสอบจากอียิปต์เราโบราณ
ตัวอย่าง (ดูด้านบน) ซึ่งได้ผ่านการทดสอบในเชิงบวกสำหรับการปรากฏตัวของ IS6110 และ
ที่รูปแบบ spoligotyping ได้รับในแบบคู่ขนาน.
เราเลือกชุดไพรเมอร์ขยายดีเอ็นเอชิ้นส่วนขนาดเล็กกว่า 200 bp เนื่องจาก
ADNA เป็นที่รู้จักกันที่จะเสื่อมโทรมอย่างมีนัยสำคัญเพื่อให้การขยายของเป้าหมาย
กว่า 200 bp เป็นเรื่องยากมาก (29).
สำหรับการวิเคราะห์ PCR เราเลือกสี่ผลิตภัณฑ์เครื่องขยายเสียงที่แตกต่างกันจาก
Mbov, MTP-40, และภูมิภาค oxyR (ตารางที่ 2 ) (i) ลำดับ Mbov ถูก
. ได้รับการแต่งตั้งเนื่องจากมันได้รับการตีพิมพ์เป็นสินค้าที่มีความเฉพาะเจาะจงของ M. bovis (31)
ดังนั้นไพรเมอร์ต่อไปนี้ได้รับการออกแบบ: 5? GAAATTCGCCTCTGTA
GTGCCAC 3 หรือไม่? (Forward) และ 5? GCTGCGTTGACTGAGAAAATGTATG 3
(ย้อนกลับ) พารามิเตอร์การขี่จักรยาน 45 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
1 นาทีที่มีรอบสุดท้ายของ 72 ° C ที่ 1 นาที (ii) สองชุดไพรเมอร์สำหรับ MTP-40 ยีน
ถูกนำมาใช้ที่ได้รับการทดสอบประสบความสำเร็จก่อนหน้านี้เกี่ยวกับวัสดุกระดูกในยุคกลาง
(41) MTP-40 ลำดับ (ภูมิภาครวมทั้ง phospholipase ยีน C) คือ
ในปัจจุบันวัณโรคและจึงช่วยให้ความแตกต่างระหว่างเอ็มวัณโรค
และส่วนใหญ่ M. bovis ไอโซเลท (7) ไพรเมอร์และเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาเป็น
หลักเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้โดยเทย์เลอร์, et al (42) (iii) เราได้ออกแบบสอง
ชุดไพรเมอร์ใหม่สำหรับ MTP-40 ยีนบนพื้นฐานของการตีพิมพ์เอ็ม tuberculosisand
เมตร bovis เฉพาะภูมิภาคยีน (7) เหล่านี้ผลิตสินค้า 152-BP และ
ไพรเมอร์ที่มี mtp40-3 (5? AGTCGCAAAGTTGAACGCTGAGGTC 3?) (Forward)
และ mtp40-4 (5? GTTCCCTGCATTGTCATTTCGCC 3?) (ย้อนกลับ)
พารามิเตอร์การขี่จักรยาน 45 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 62 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีกับ
รอบสุดท้ายของ 72 ° C ที่ 1 นาที (iv) สุดท้ายเราตรวจสอบ pseudogene oxyR
(oxidative การตอบสนองที่ regulator) ซึ่งมีความแตกต่างระหว่างลำดับ
เมตร วัณโรคและ M. bovis (39) ลำดับไพรเมอร์และการขี่จักรยาน
เงื่อนไขถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้ในวรรณกรรม (42).
Spoligotyping Spoligotyping ที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ต่อไปของกลุ่มตัวอย่างที่มี
สัญญาณบวกสำหรับภูมิภาค IS6110 วิธีการที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้
โดย Kamerbeek et al, (20) ยกเว้นว่าจำนวนวงจรเพิ่มขึ้นเป็น 45 รอบ.
สำหรับการวิเคราะห์นี้เราใช้ชุด spoligotyping พาณิชย์ (Isogen, Maarsen ที่
เนเธอร์แลนด์) ที่สกัดดีเอ็นเอถูกขยายด้วยไพรเมอร์และ DRA DRB,
ซึ่งจะช่วยให้การขยายของภูมิภาค DR ทั้งเพื่อให้แท่น
ระหว่างเป้าหมายดรสามารถประเมินได้ ไบโอตินไพรเมอร์ที่มีข้อความกลับ Dra,
ถูกนำมาใช้เพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่มีป้ายกำกับไบโอติน PCR หลังจากขยาย ต่อจากนั้น
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์มีไฮบริดตั้งฉากกับเส้นของการตรึง
oligonucleotides spacer ที่เป็นตัวแทนของ spacers ลำดับที่รู้จักกัน
oligonucleotides มีการเชื่อมโยงไปยังโควาเลนต์เมมเบรนที่เปิดใช้งานในแบบคู่ขนาน
เส้น ต่อไปนี้การผสมพันธุ์ที่เมมเบรนที่ถูกบ่มกับ streptavidin
peroxidase สำหรับการตรวจจับสัญญาณการผสมพันธุ์ที่ที่เพิ่มขึ้น chemiluminescence
(ECL) ถูกใช้ในระบบ (Amersham Pharmacia) ในระบบนี้
peroxidase เร่งปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นส่งผลให้การปล่อยก๊าซเรือนกระจกของแสงซึ่งสามารถ
มองเห็นโดย autoradiography (ECL Hyperfilm; Amersham Pharmacia).
การเปรียบเทียบฐานข้อมูลของผล spoligotyping ส่งผลให้ spoligotyping
รูปแบบถูกนำมาเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลระหว่างประเทศที่มีอยู่ต่อไปนี้:
(i) รวมทั้งสิ้น 813 รูปแบบ spoligotyping รายงานอย่างน้อยสองครั้งตัวแทน
ของ 11,708 สายพันธุ์ทางคลินิกจากกว่า 90 ประเทศและ (ii) 1,300 ไม่ซ้ำ
รูปแบบ spoligotyping (ฉัน . Filliol et al., ข้อมูลที่ไม่ถูกเผยแพร่)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อศึกษาความจำเพาะของ amplifications เหล่านี้เราใช้ชุดต่อไปของตัวอย่าง ( ฉัน ) เป็นการควบคุมเป็นวัณโรคและ bovis จำเพาะของวัณโรค , ล่าสุดh37rv ความเครียดและม. bovis สายพันธุ์ BCC P3 ที่ได้รับจากแหล่งการค้า ( isogen maarsen , เนเธอร์แลนด์ , ) เหล่านี้ถูกใช้ในทั้งสองที่ความเข้มข้นต่างๆเพื่อประเมินความเข้มข้นขึ้นอยู่กับความแตกต่างปฏิกิริยารูปแบบ ( 10 และ 0.1 กรัม / ลิตร ) ( 2 ) เราวิเคราะห์สองร่วมสมัยตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ได้จากไฟล์ชันสูตรของเราด้วย ( จุลชีววิทยา )ยืนยันว่า วัณโรคเกิดจากวัณโรคกับจุลชีววิทยาและอื่น ๆพิสูจน์เชื้อ โดยม. bovis . เราได้ทดสอบ spoligotyping รูปแบบทั้งสองตัวอย่างที่ชัดเจนว่า เชื้อวัณโรค และเป็นเมตร bovis ตามลำดับ จากทั้งสองกรณี ตัวอย่างเนื้อเยื่อปอดได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลดีไฮด์ ตรวจที่ฝังอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟิน และใช้ในการวิเคราะห์ดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 2 ) ( 3 ) แปดกรณีทดสอบจากอียิปต์โบราณของเราตัวอย่าง ( ดูข้างต้น ) ซึ่งได้ทดสอบบวกสำหรับการปรากฏตัวของสายพันธุ์ปักกิ่ง และซึ่ง spoligotyping รูปแบบได้ในแบบคู่ขนานเราเลือกใช้ชุดขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดเล็กกว่า 200 คู่เบส ตั้งแต่แอดนา เป็นที่รู้จักกันเป็นอย่างต่ำเพื่อให้เพิ่มจำนวนของเป้าหมายมากกว่า 200 BP ยากมาก ( 29 )การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ เราเลือกสี่ผลิตภัณฑ์ขยายที่แตกต่างกันจากmbov mtp-40 , และ oxyr ภูมิภาค ( ตารางที่ 2 ) ( 1 ) ลําดับที่ mbov คือเลือกเพราะมันได้รับการตีพิมพ์เป็นผลิตภัณฑ์เฉพาะของ ม. bovis ( 31 )ดังนั้น ต่อไปนี้เป็น 5 gaaattcgcctctgta ออกแบบไพรเมอร์gtgccac 3 ( ไปข้างหน้า ) และ 5 gctgcgttgactgagaaaatgtatg 3( ย้อนกลับ ) จักรยานค่า 45 รอบ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาทีและ 60 ° C สำหรับ1 นาทีกับรอบสุดท้ายของ 72 ° C ที่ 1 นาที ( 2 ) รองพื้นสำหรับ mtp-40 ยีนสองชุดใช้ที่ได้รับก่อนหน้านี้สามารถนำวัสดุกระดูกในยุคกลาง( 41 ) การ mtp-40 ลำดับ ( ภูมิภาครวมทั้ง phospholipase C ยีน ) คือปัจจุบันในวัณโรคและจึงช่วยให้ความแตกต่างระหว่าง วัณโรคและส่วนใหญ่ ม. bovis ไอโซเลท ( 7 ) ไพรเมอร์และสภาวะปฏิกิริยาคือหลักเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้โดย Taylor et al . ( 42 ) ( 3 ) ที่เราออกแบบมา สองรองพื้นใหม่ชุดสำหรับ mtp-40 ยีนบนพื้นฐานของหัวข้อ tuberculosisand Mเมตร bovis เฉพาะยีนภูมิภาค ( 7 ) เหล่านี้ผลิตผลิตภัณฑ์ 152 BP , และไพรเมอร์มี mtp40-3 ( 5 agtcgcaaagttgaacgctgaggtc 3 ) ( ต่อ )และ mtp40-4 ( 5 gttccctgcattgtcatttcgcc 3 ) ( ย้อนกลับ ) ที่พารามิเตอร์จักรยานเป็น 45 รอบ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 62 ° C เป็นเวลา 1 นาทีด้วยรอบสุดท้ายของ 72 ° C ที่ 1 นาที ( IV ) สุดท้ายเราตรวจสอบ pseudogene oxyr( ควบคุมการตอบสนองออกซิเดชัน ) ซึ่งมีลำดับเบส ระหว่างวัณโรคและ bovis ( 39 ) ไพรเมอร์ลำดับและจักรยานเงื่อนไขที่ใช้อธิบายในวรรณคดี ( 42 )spoligotyping . spoligotyping ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ต่อไปของตัวอย่างด้วยเป็นสัญญาณบวกสำหรับสายพันธุ์ปักกิ่ง ) วิธีดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย kamerbeek et al . ( 20 ) , ยกเว้นว่าวงจรจำนวนเพิ่มขึ้นเป็น 45 รอบสำหรับการวิเคราะห์นี้เราใช้ spoligotyping พาณิชย์ ( isogen maarsen , ชุด ,เนเธอร์แลนด์ ) สกัดดีเอ็นเอด้วยไพรเมอร์ของ DRA แบคและ ,ซึ่งช่วยเพิ่มปริมาณทั้ง ดร ภูมิภาค , เพื่อให้ spacersระหว่าง ดร เป้าหมายที่สามารถประเมิน เป็นไบโอตินป้ายรองพื้นนๆกลับ , ,เคยได้รับไบโอตินติดป้ายผลิตภัณฑ์ PCR หลังจากขยาย . ต่อมาที่เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเส้นดิ่งให้ตรึงสเปเซอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่เป็นตัวแทนของ spacers รู้จักลำดับ ที่โอลิโกนิวคลีโอไทด์เป็น covalently เชื่อมโยงกับถ่านเยื่อในขนานเส้น ต่อไปนี้ probes , เมมเบรนแยก streptavidinในประเทศไทย การตรวจหาชนิดของสัญญาณ ปรับปรุงนโยบายแรงงาน( ECL ) ระบบที่ใช้ ( ที่มุ่งมั่น ) ในระบบนี้เอนไซม์เร่งปฏิกิริยาที่เกิดในมลพิษของแสง ซึ่งสามารถภาพจากเก้าอี้รับแขก ( hyperfilm ECL ; ที่มุ่งมั่น )การเปรียบเทียบฐานข้อมูลของ spoligotyping ผลลัพธ์ ผล spoligotypingรูปแบบการเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลระหว่างประเทศที่มีดังต่อไปนี้ :( ผม ) ทั้งหมด 813 spoligotyping รูปแบบรายงานอย่างน้อยสองครั้ง ผู้แทนของ 11708 คลินิกที่แยกได้จากกว่า 90 ประเทศ และ ( 2 ) 1300 เฉพาะspoligotyping รูปแบบ ( ผม filliol et al . , พิมพ์ข้อมูล