Protein crystallization has already

Protein crystallization has already been investigated in prior studies because it
purifies specific proteins from otherwise impure mixtures. In order to achieve a high
pure protein as an active enzyme [1, 2] big and perfect crystals need to be obtained. For
this purpose, based on the works of Wagner et al. [3], McPherson [4] and Ho et al. [5], a
new developed method to purify the protein by a simple precipitation step followed by a
crystallization step is demonstrated. Here a case study of L-Asparaginase II from a
recombinant E.coli is presented which is not up to date purified by such a new
technology. An improved technology to recover the protein from feeding material is
used and prism-shape crystalline L-Asparaginase II with a length of more than 200 μm
is obtained. Compared with former methods, this new purification process is much
easier (fewer steps), faster (in hours not in days), environmentally friendly (lower
amounts of salts and solvents). Such a process should lead to mass crystallization for
industrial purposes.
The new method was started by extracting the fresh L-Asparaginase II from E.coli
cell which was modified by using an extra plasmid pET11a-ansB. 40 g frozen cell cakes
of E.coli were suspended in 200 mL distilled water and then 800 mL acetone was added.
After centrifugation, the precipitate was collected and resuspended in the distilled water
again. The suspension was adjusted to pH 7.5-7.8 with NaOH. A precipitate was formed
and was centrifuged away. Again 800 mL acetone was added to the remaining
supernatant to form a precipitate which was centrifuged again. The resulting precipitate
was suspended in 3 M urea solution and finally a suspension of high viscosity was
obtained. Before the crystallization step such a suspension of L-Asparaginase II must be
purified again to remove solid particles. Here, a high speed centrifugation and a vacuum
filtration were chosen, respectively, in order to compare their purification capacities.
Then the activity value and the concentration of L-Asparaginase II in
supernatant/filtrate were determined by a Nesslerization and a BCA test [6, 7]. Then the
specific activity of 15.5 U/mg of the clarified L-Asparaginase II solution was obtained.
After that, 5% ethanol and 1% magnesium salts (0.1 M) were added to the purified
protein solution. All crystallization steps were set up in 96-well microplate. After
standing at 1 o
C in refrigerator for 1-3 hours, small size of crystals can be observed
under the digital microscope and such small crystals will grow continuously up to about
200 μm in a prism-shape for overnight (a growth rate of 0.3×10-8 m/s). Figures 1 and 2
summarize the results of microbatch experiments examining the growth rates of crystals at varying levels of supersaturation (diluted 1-2 times).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตกผลึกโปรตีนมีแล้วถูกตรวจสอบในการศึกษาก่อนเพราะมัน purifies โปรตีนเฉพาะจากส่วนผสมอื่น impure เพื่อให้บรรลุสูง โปรตีนบริสุทธิ์เป็นการใช้เอนไซม์ [1, 2] ผลึกขนาดใหญ่ และสมบูรณ์แบบต้องได้รับ สำหรับ วัตถุประสงค์นี้ ตามงานของวากเนอร์ et al. [3], [4] แมคเฟอร์สัน และ al. et โฮจิมินห์ [5], การ วิธีการพัฒนาใหม่ให้บริสุทธิ์โปรตีน โดยขั้นตอนง่าย ๆ ฝนตามแบบ คือแสดงขั้นตอนการตกผลึก นี่เป็นกรณีศึกษาของ L-Asparaginase II จากการ นำเสนอระบบ recombinant ซึ่งไม่เสมอบริสุทธิ์ โดยดังกล่าวใหม่ เทคโนโลยี เทคโนโลยีการปรับปรุงการกู้คืนโปรตีนจากอาหารวัสดุเป็น ใช้ และปริซึมรูปผลึก L Asparaginase II มีความยาวมากกว่า 200 μm ได้รับการ กระบวนการฟอกใหม่นี้เปรียบเทียบกับวิธีการเดิม ถูกมาก ง่ายขึ้น (ลดขั้นตอน), เร็ว (ในเวลาเป็นวันไม่), สิ่งแวดล้อมเป็นมิตร (ต่ำกว่า ยอดของเกลือหรือสารทำละลาย) กระบวนการดังกล่าวควรนำไปสู่การตกผลึกโดยรวมสำหรับ อุตสาหกรรม เริ่มต้น โดยแยก II L-Asparaginase สดจากระบบวิธีการใหม่ เซลล์ที่ถูกปรับเปลี่ยนโดยมี plasmid พิเศษ pET11a-ansB 40 g แช่เค้กเซลล์ ของระบบถูกหยุดชั่วคราวใน 200 มลกลั่นน้ำ และถูกเพิ่ม 800 mL อะซิโตน หลังจาก centrifugation, precipitate ถูกรวบรวม และ resuspended ในน้ำกลั่น อีกครั้ง การระงับได้ปรับค่า pH 7.5-7.8 ด้วย NaOH Precipitate การก่อ และ centrifuged เก็บ อีก 800 mL อะซีโตนถูกเพิ่มเข้าไปเหลือ supernatant ไป precipitate ซึ่ง centrifuged อีก Precipitate เกิด ถูกระงับในโซลูชันยูเรีย 3 M และสุดท้าย ก็ระงับความหนืดสูง ได้รับการ ก่อนขั้นตอนการตกผลึกดังกล่าวระงับ L Asparaginase II ต้อง บริสุทธิ์อีกครั้งเพื่อเอาอนุภาคของแข็ง ที่นี่ centrifugation ความเร็วสูง และสุญญากาศ เครื่องกรองที่ถูกเลือก ตามลำดับ เพื่อเปรียบเทียบกำลังการฟอก แล้วค่ากิจกรรมและความเข้มข้นของ L-Asparaginase II ใน / สารกรอง supernatant ถูกกำหนด โดยการ Nesslerization และการทดสอบ BCA [6, 7] นั้น กิจกรรมของ U 15.5 มิลลิกรัมของโซลูชัน II L-Asparaginase ใสได้รับ ถูกเพิ่ม 5% เอทานอลและ 1% แมกนีเซียมเกลือ (0.1 M) หลังจากนั้น การที่บริสุทธิ์ โปรตีนการแก้ปัญหา ขั้นตอนการตกผลึกทั้งหมดถูกตั้งค่าใน microplate 96-ดี หลังจาก ยืนที่ 1 oC ในตู้เย็น 1-3 ชั่วโมง สามารถสังเกตผลึกมีขนาดเล็ก ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ดิจิตอลและผลึกขนาดเล็กดังกล่าวจะเติบโตอย่างต่อเนื่องถึงเกี่ยวกับ Μm 200 รูปทรงปริซึมพรรณไม้หลากหลายชนิด (อัตราการเติบโตของ 0.3 × 10-8 m/s) ตัวเลข 1 และ 2 สรุปผลการตรวจสอบอัตราการขยายตัวของผลึกในระดับที่แตกต่างกันของ supersaturation ทดลอง microbatch (แตกออก 1 - 2 ครั้ง)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โปรตีนตกผลึกได้รับการตรวจสอบแล้วในการศึกษาก่อนเพราะมัน
บริสุทธิ์โปรตีนจากสารบริสุทธิ์เป็นอย่างอื่น เพื่อให้บรรลุสูง
โปรตีนบริสุทธิ์เป็นเอนไซม์ที่ใช้งาน [1, 2] ผลึกขนาดใหญ่และสมบูรณ์แบบจะต้องได้รับ สำหรับ
จุดประสงค์นี้ขึ้นอยู่กับผลงานของวากเนอร์และคณะ [3], แมคเฟอร์สัน [4] และโฮและคณะ [5]
วิธีการพัฒนาใหม่ในการชำระล้างโปรตีนโดยขั้นตอนการตกตะกอนง่ายๆตาม
ขั้นตอนที่เป็นรูปธรรมคือการแสดง นี่คือกรณีศึกษาของ L-asparaginase II จาก
recombinant E.coli จะถูกนำเสนอที่ไม่ได้ถึงวันที่บริสุทธิ์ด้วยเช่นใหม่
เทคโนโลยี ปรับปรุงเทคโนโลยีการกู้คืนโปรตีนจากอาหารวัสดุ
ที่ใช้และผลึกปริซึมรูป L-asparaginase ครั้งที่สองที่มีความยาวกว่า 200 ไมโครเมตร
จะได้รับ เมื่อเทียบกับวิธีการเดิมกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ใหม่นี้มาก
ขึ้น (ขั้นตอนน้อยลง) เร็วขึ้น (เป็นชั่วโมงไม่ได้อยู่ในวัน) เป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อม (ลด
ปริมาณของเกลือและตัวทำละลาย) กระบวนการดังกล่าวจะนำไปสู่การตกผลึกมวลสำหรับ
การอุตสาหกรรม
วิธีการใหม่ที่เริ่มจากการสกัดสด L-asparaginase II จาก E.coli
เซลล์ซึ่งได้รับการแก้ไขโดยการใช้พลาสมิดพิเศษ pET11a-ansB 40 กรัมแช่แข็งเค้กเซลล์
ของ E.coli ถูกระงับใน 200 มลน้ำกลั่นแล้ว 800 อะซีโตนมลถูกเพิ่มเข้ามา
หลังจากการหมุนเหวี่ยงตะกอนที่ถูกเก็บรวบรวมและ resuspended ในน้ำกลั่น
อีกครั้ง ระงับการปรับค่าพีเอช 7.5-7.8 ด้วย NaOH ตะกอนที่ถูกสร้างขึ้น
และได้รับการหมุนเหวี่ยงออกไป อีกครั้ง 800 อะซีโตนมลถูกบันทึกอยู่ในส่วนที่เหลืออีก
ใสในรูปแบบตะกอนซึ่งได้รับการหมุนเหวี่ยงอีกครั้ง ตะกอนที่เกิดขึ้น
ได้รับการระงับใน 3 M สารละลายยูเรียและในที่สุดการระงับการมีความหนืดสูงได้
ที่ได้รับ ก่อนที่จะขั้นตอนที่เป็นรูปธรรมเช่นการระงับการ L-asparaginase ครั้งที่สองจะต้อง
บริสุทธิ์อีกครั้งเพื่อเอาอนุภาคที่เป็นของแข็ง นี่คือการหมุนเหวี่ยงความเร็วสูงและสูญญากาศ
การกรองได้รับการแต่งตั้งตามลำดับเพื่อเปรียบเทียบความสามารถในการทำให้บริสุทธิ์ของพวกเขา
แล้วค่ากิจกรรมและความเข้มข้นของ L-asparaginase ที่สองใน
ใส / กรองถูกกำหนดโดย nesslerization และการทดสอบเก็บกวาด [6 , 7] แล้ว
กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงของ 15.5 U / มิลลิกรัมของโซลูชั่น L-asparaginase II ชี้แจงที่ได้รับ
หลังจากนั้นเอทานอล 5% และ 1% เกลือแมกนีเซียม (0.1 M) ถูกเพิ่มเข้าไปบริสุทธิ์
สารละลายโปรตีน ขั้นตอนการตกผลึกทั้งหมดถูกตั้งขึ้นในปี 96 ดี microplate หลังจากที่
ยืนอยู่ที่ 1 o
C ในตู้เย็น 1-3 ชั่วโมงขนาดที่เล็กของผลึกสามารถสังเกต
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ดิจิตอลและผลึกขนาดเล็กดังกล่าวจะเติบโตอย่างต่อเนื่องถึงประมาณ
200 ไมโครเมตรปริซึมรูปร่างสำหรับในชั่วข้ามคืน (อัตราการเติบโต 0.3 × 10-8 เมตร / วินาที) รูปที่ 1 และ 2
สรุปผลการทดลอง microbatch การตรวจสอบอัตราการเติบโตของผลึกในระดับที่แตกต่างกันของ supersaturation (ปรับลด 1-2 ครั้ง)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลึกโปรตีนได้ถูกใช้ในการศึกษาก่อน เพราะโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงจากอย่างอื่น
บริสุทธิ์เจือผสม เพื่อให้บรรลุสูง
โปรตีนบริสุทธิ์เป็นทีฟเอนไซม์ [ 1 , 2 ] ใหญ่และสมบูรณ์แบบคริสตัลต้องได้รับ สำหรับ
วัตถุประสงค์นี้ บนพื้นฐานการทำงานของวากเนอร์ et al . [ 3 ] McPherson [ 4 ] และโฮ et al . [ 5 ] ,
วิธีที่พัฒนาขึ้นใหม่ให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนโปรตีนง่ายขั้นตอนตามขั้นตอน
ผลึกจะแสดงให้เห็นถึง นี่เป็นกรณีศึกษา l-asparaginase II จาก
E.coli แนนท์นำเสนอที่ไม่ถูกต้องและทำให้บริสุทธิ์ โดยเทคโนโลยีดังกล่าวใหม่

การปรับปรุงเทคโนโลยีการกู้คืนวัสดุที่เป็นโปรตีนจากนม
และใช้ปริซึมรูปทรงผลึก l-asparaginase II ที่มีความยาวกว่า 200 μ M
จะได้รับ เมื่อเทียบกับวิธีเดิม กระบวนการผลิตใหม่นี้มาก
ง่ายขึ้น ( ขั้นตอนน้อยกว่า ) ได้เร็วขึ้น ( ในชั่วโมงในวัน ) เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อม ( จํานวนลดลง
ของเกลือและสารละลาย ) กระบวนการดังกล่าวจะนำไปสู่การตกผลึกเพื่อมวล
การอุตสาหกรรม .
วิธีใหม่ คือ เริ่มจากการสกัด 2 l-asparaginase สดจากเซลล์ E.coli
ซึ่งถูกแก้ไขโดยการใช้ ansb pet11a สายพันธุ์พิเศษ 40 กรัมแช่แข็งเค้กเซลล์
ของ E.coli หยุดชั่วคราวใน 200 มล. น้ำกลั่นแล้ว 800 ml ) ถูกเพิ่มเข้ามา
หลังการปั่นเหวี่ยง , การรวบรวมและ resuspended ในน้ำกลั่น
อีกครั้ง ถูกระงับการปรับ pH 7.5-7 .8 ด้วย NaOH มีการก่อตั้งขึ้น
และไฟฟ้าออกไป อีก 800 มล. ) เพิ่มเพื่อนำที่เหลือ
ฟอร์มอยู่ที่ระดับอีกครั้ง ผลที่ถูกระงับในสารละลายยูเรีย
3 M และในที่สุดก็ระงับความหนืดสูง
) ก่อนตกผลึกขั้นตอนดังกล่าวระงับ l-asparaginase II ต้อง
บริสุทธิ์อีกครั้งเพื่อเอาอนุภาคที่เป็นของแข็ง นี่ ปั่นความเร็วสูงและเครื่องดูดฝุ่น
การกรองได้รับเลือกตามลำดับ เพื่อเปรียบเทียบความบริสุทธิ์ของตน
แล้วกิจกรรมค่า และความเข้มข้นของ l-asparaginase 2
น่าน / กรองถูกกำหนดด้วยวิธีเนสเลอไรเซชันและ BCA ทดสอบ [ 6 , 7 ] จากนั้น
กิจกรรมจำเพาะของ 155 U / mg ของการชี้แจง l-asparaginase II ในสารละลายได้
หลังจากนั้นเอทานอล 5% และ 10% เกลือแมกนีเซียม ( 0.1 M ) เป็นโปรตีนบริสุทธิ์
โซลูชั่น ทุกขั้นตอนการตั้ง 96 ดีในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย . หลังจาก
o
ยืนอยู่ที่ 1 C ในตู้เย็นเป็นเวลา 1-3 ชั่วโมง ขนาดของผลึกสามารถสังเกต
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ดิจิตอลและผลึกขนาดเล็กดังกล่าวจะขยายตัวขึ้นประมาณ 200 μ
M ในปริซึมรูปทรงสำหรับค้างคืน ( อัตราการเติบโตเพิ่มขึ้น 0.3 × 10-8 m / s ) ตัวเลข 1 และ 2
สรุปผล microbatch การทดลองการตรวจสอบอัตราการเติบโตของผลึกที่แตกต่างกันระดับต่ำ ( เจือจาง 1-2 ครั้ง )