Materials and methodsPlasmid constr

Materials and methods
Plasmid construction
The sequences of two FYVE domains from the mouse
Hrs protein were connected with the linker sequence
QGQGS and fused to the N-terminus of enhanced green
fluorescent protein (plasmid pEGFP-C3 from Clontech)
as described before (Gillooly et al., 2000). This gene
construct was cloned into the binary vector pBLTI221,
thereby putting its expression under the control of the
CaMV 35S promotor. For DsRedT4 (Bevis and Glick,
2002) tagging the tandem FYVE domain was PCRamplified and cloned in frame with DsRedT4 within the
vector pRTL2 under the control of the CaMV 35S
promotor. The coding sequence for ARA6-GFP under
control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter
and nopaline synthase terminator (Ueda et al., 2001)
was excised with HindIII and EcoRI and was
inserted into the corresponding sites of pBI121
(Clontech). The resulting vector was introduced into
Agrobacterium tumefaciensstrain C58C1. AtRabF2a
cDNAwas amplified using the primers RabF2a
forward (5
0
-CGGGATCCATGGCTACGTCTGGAAACAAGA-30
) and RabF2a reverse (5
0
-GCTCTAGACTAAGCACAACACGATGAACTC-3
0
), and inserted
into a modified pCAMBIA expression vector with
eYFP at the N-terminus under the control of the 35S
CaMV promoter.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
ก่อสร้างพลาสมิด
ลำดับของสองโดเมน FYVE จากเมาส์
โปรตีนชั่วโมงถูกเชื่อมต่อกับลำดับลิงเกอร์
QGQGS และหลอมรวมกับ N-ปลายทางของการปรับปรุงสีเขียว
เรืองโปรตีน (พลาสมิด pEGFP-C3 จาก Clontech)
ตามที่อธิบายไว้ก่อน (Gillooly และคณะ ., 2000) ยีนนี้
สร้างเป็นโคลนเป็น pBLTI221 เวกเตอร์ไบนารี
จึงวางแสดงออกภายใต้การควบคุมของ
CaMV 35S โปรโมเตอร์ สำหรับ DsRedT4 (Bevis และกลิก,
2002) การติดแท็กโดเมน FYVE ตีคู่เป็น PCRamplified และโคลนในกรอบที่มี DsRedT4 ภายใน
pRTL2 เวกเตอร์ภายใต้การควบคุมของ CaMV 35S
โปรโมเตอร์ ลำดับการเข้ารหัสสำหรับ ARA6-GFP ภายใต้
การควบคุมของไวรัสกะหล่ำก่อการ 35S
และเทอร์มิเทส nopaline (อุเอดะ et al., 2001)
ได้รับการตัดกับ HindIII และ EcoRI และถูก
ใส่เข้าไปในเว็บไซต์ที่สอดคล้องกันของ pBI121
(Clontech) เวกเตอร์ที่เกิดขึ้นถูกนำเข้าสู่
Agrobacterium tumefaciensstrain C58C1 AtRabF2a
cDNAwas ขยายโดยใช้ไพรเมอร์ RabF2a
ไปข้างหน้า (5
0
-CGGGATCCATGGCTACGTCTGGAAACAAGA-30
) และ RabF2a ย้อนกลับ (5
0
-GCTCTAGACTAAGCACAACACGATGAACTC-3
0
) และแทรก
เข้าไปในการแก้ไขเวกเตอร์แสดงออก pCAMBIA กับ
eYFP ที่ N-ปลายทางภายใต้การควบคุมของ 35S
โปรโมเตอร์ CaMV

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการก่อสร้าง

ทำพลาสมิดคิวลำดับสองโดเมน fyve จากเมาส์
น. โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโปรแกรมเชื่อมโยงลำดับ
qgqgs และผสมกับยีนของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ( ปรับปรุงสายพันธุ์ pegfp-c3 จาก clontech )

ตามที่อธิบายไว้ก่อน ( gillooly et al . , 2000 ) นี้ถูกโคลนยีน
สร้างใน pblti221
เวกเตอร์ไบนารีจึงทำให้การแสดงออกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์
35S CaMV . สำหรับ dsredt4 ( เบวิส และ Glick
2002 ) ที่ติดแท็กกันไป fyve โดเมนคือ pcramplified และโคลนในกรอบกับ dsredt4 ภายใน
เวกเตอร์ prtl2 ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ 35S CaMV
. รหัสลำดับสำหรับ ara6-gfp ภายใต้
การควบคุมของกะหล่ำดอกฝังไวรัส 35s promoter และ Terminator ( อุเอดะ
โนปาลีนเทส et al . ,2544 ) และถูกตัดด้วย
-
EcoRI และถูกแทรกลงในเว็บไซต์ที่ pbi121
( clontech ) ผลเวกเตอร์ที่ใช้เป็น tumefaciensstrain
Agrobacterium c58c1 . atrabf2a
cdnawas ขยายโดยใช้ไพรเมอร์ rabf2a ไปข้างหน้า (
5
0
-
cgggatccatggctacgtctggaaacaaga-30 ) และ rabf2a ย้อนกลับ ( gctctagactaagcacaacacgatgaactc-3 5
0
-
0

) และแทรกในการแก้ไข pcambia นิพจน์เวกเตอร์ด้วย
eyfp ที่ยีนอยู่ภายใต้การควบคุมของ 35s
CAMV โปรโมเตอร์