2.1.4. Yeast identificationYeast st

2.1.4. Yeast identification
Yeast strains were identified using two different technologies.
Fourier-Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy was used to prescreen
all yeasts isolates (Wenning et al., 2002; Wenning and
Scherer, 2013). Following this, representative isolates (n ¼ 10)
that could not be identified in the FTIR database and which stemmed
from YGC agar were identified by 26S rRNA gene sequencing.
Yeast screening with FTIR was done according to Kümmerle
et al. (1998) using an IFS 28B FTIR spectrometer (Bruker Optics,
Ettlingen, Germany). Strains were grown on YGC agar (Merck,
Germany) and incubated for 24 ± 0.5 h at 27 ± 2 C (Wenning and
Scherer, 2013). This was because for FTIR Spectrometry, preincubation
at 27 C is part of the standardized protocol for generating
the yeast spectra. Thus, all the yeasts in this database were
incubated at standardized 27 C. One loop full of biomass was
suspended in 100 mL of water and 25 mL of the bacterial suspension
were placed on zinc selenide sample carrier and dried for 45 min at
42 C. The following measurement parameters were used to record
FTIR spectra: 6-cm1 resolution, 20-kHz scan speed, BlackmaneHarris
3-Term apodization, zerofilling of 4. Data processing
was performed using OPUS V. 5.5 (Bruker Optics, Germany). For
identification the second derivative was calculated, smoothed according
to Savitzky and Golay (1964) and vector normalized.
Spectra were identified by an in-house database that was originally
16
published by Kümmerle et al. (1998), but was extended to include
approx. 2400 spectra from 250 species. As some isolates were
psychrotolerant and did not grow at 27 C, a small reference
database was compiled for spectra of yeast grown at an incubation
temperature of 10 C, including the spectra from sequenced strains
isolated in the present study.
DNA extraction, amplification and sequencing: Yeast cells from
pure cultures of all unidentified isolates (see FT-IR screening) were
transferred to 1.5 mL tubes. Extraction of genomic DNA for
sequencing of 26S rRNA genes was performed using the DNeasy
Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The D1/D2 LSU
rRNA was amplified using primers NL1 and NL4 (Libkind et al.,
2003; Kurtzman and Robnett, 1998). Amplification of the D1/D2
domain was performed in a thermal cycler (C 1000, Bio-Rad,
Munich, Germany) according to the following procedure adapted
from Kurtzman and Robnett (1998): initial denaturation at 95 C for
10 min, 30 amplification cycles (92 C for 40 s, 55 C for 40 s and
72 C for 30 s) and a final extension at 72 C for 10 min.
PCR products were purified with the Qiaquick PCR Purification
Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to manufacturer's instructions,
and sequenced by the sequencing service of Eurofins
MWG (Ebersberg, Germany). Sequence comparisons were performed
using the basic local alignment search tool (BLAST) in
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) after editing and trimming
the sequences using the BioEdit sequence alignment editor, version
7.0.0. Yeast isolates were identified based on a 99e100% similarity
criterion.
2.2. Challenge tests
2.2.1. Preparation and storage of beef
Beef (eye of round) was purchased from the local slaughterhouse
in Bayreuth, Germany. Samples were obtained chilled (2 C)
and were vacuum-packed 4 days after slaughtering. To simulate a
meat surface which is similar in bacterial composition to that obtained
shortly after slaughtering, each beef sample was washed
with 70% ethanol for 5 s and flamed to reduce the microbial count
on the surface. Subsequently, the flamed surface was removed
(2e3 cm thick) and 10 to 12 slices were cut from the eye of round
samples to each form a 4e5 cm thick steak. The steaks were then
divided into 2 groups. One group of 200 ± 10 g beef (nearly
100 cm2
) was inoculated with K. psychrophila strains (see below),
while the other served as un-inoculated negative control. Inoculated
and non-inoculated beef steaks were placed into vacuum bags
(15.2  21.6 cm, 3 mil standard barrier, nylon-polyethylene vacuum
pouch; Dagema, Willich, Germany), vacuum packed (Multivac C-
100; Multivac, Wolfertschwingen, Germany) and stored at 4 C for
84 days.
2.2.2. Inoculation of vacuum-packed beef with K. psychrophila
Three K. psychrophila strains (Kabisch et al., 2013) were lyophilized
and stored in 10% milk powder at 4 C. Strains were grown
separately at 10 C for 7 days in 9 mL of LuriaeBertani broth (LBbroth;
Merck, Darmstadt, Germany). Cell suspensions of K. psychrophila
strains were harvested and diluted in physiological salt
solution (0.85% NaCl) to an inoculum level of 6 log10 cfu mL1
.
Inoculum densities were confirmed microscopically using a Thoma
cell counting chamber (Bright-Line; LO-Laboroptik, Bad Homburg,
Germany). Then, 100 cm2 of raw beef material was inoculated with
a mix of the three Kazachstania strains H 382, H 409 and
H433T ¼ DSM 26230T (Kabisch et al., 2013), to reach an inoculation
density of 2 log10 cfu per cm2 beef. Control samples were not
inoculated with K. psychrophila.
2.2.3. Sampling
For microbiological analyses, three non-inoculated and three
inoculated vacuum-packed beef samples were analyzed on days 0,
2, 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 33, 40, 47, 54, 68 and 84. Experiments were
performed in triplicate, resulting in a maximum of 9 data points.
Layers of approximately 2 mm thickness and 20 cm2
, were
aseptically removed from the exterior area of the meat, placed in a
sterile stomacher bag (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) with 20 mL
of buffered peptone water (Sifin, Berlin, Germany) and homogenized
in a stomacher (Stomacher 400, Seward, UK) for 180 s at room
temperature. Mesophilic aerobic counts, Enterobacteriaceae, and
lactic acid bacteria counts were determined as described under 2.1.
K. psychrophila counts were determined on malt extract agar
(Merck, Darmstadt, Germany), supplemented with 125 mgL1
novobiocin (Merck, Darmstadt, Germany) to inhibit bacterial
growth. Enumeration of the yeast count was done as described
below.
The yeast K. psychrophila was confirmed on day 0, 5, 16, 23, 47
and 84 by sequencing (see 2.1). In case of a positive yeast result in
the control, all isolates were sequenced.
2.2.4. Physico-chemical analyses of vacuum packed beef
For each experiment, three controls and three inoculated beefs
were analyzed in duplicate at each sampling time (day 0, 2, 5, 9, 12,
16, 19, 23, 26, 33, 40, 47, 54, 68 and 84). Water activity and pHmeasurements
were carried out as described above (2.1).
2.2.5. Sensory analysis
Product quality was assessed by three untrained panelists. Each
panelist described in his/her own words the off-odor, off-flavor and
discoloration of beef slices directly after opening the package. A
scale with three categories was used to classify the products. Class 1
corresponded to high-quality product without any off-odor or off-
flavor or discoloration, class 2 corresponded to products that had
slight off-odor or off-flavor or discoloration, and class 3 corresponded
to products that had unacceptable off-odor or off-flavor or
discoloration.
3. Results
3.1. Survey of vacuum-packed beef
Between 2010 and 2012, beef-products (eye of round) of retail
stores and local butcheries in Bavaria, Germany were sampled and
examined.
pH-value: The pH-values of vacuum-packed beef samples
ranged from 5.38 to 6.65, with a mean value of 5.65.
water activity: The measured water activity varied between
0.9781 and 0.9925. The mean value of the samples was 0.9872.
The microbial counts which were detected in vacuum-packed
beef obtained from 15 different producers are summarized in Fig. 1.
Aerobic, mesophilic bacteria: The total bacterial counts varied
from 3 to 8.4 log cfu per cm2
, with a median total count of
5.79 cfu cm2 (see Fig. 1).
Lactic acid bacterial count: counts of lactic acid bacteria (LAB)
were also determined in the vacuum-packed beef samples, and
varied from 2.5 to 8.28 log cfu per cm2 (see Fig. 1). The median lactic
acid bacteria count was 5.82 cfu per cm2
.
Enterobacteriaceae: About 56% (n ¼ 28) of all beef samples
contained Enterobacteriaceae. The cell counts ranged from 2 to 7.38
log cfu cm2
, with a median of 3.8 cfu per cm2
.
Psychrophilic yeasts counts: Psychrophilic yeasts were detected
in 30% (n ¼ 15) of all vacuum-packed beef samples. The counts
varied from 1.0 to 6.65 cfu per cm2
, with a median value of
3.76 cfu cm2 for the positive samples (see Fig. 1).
J. Kabisch
3.2. Diversity of psychrophilic yeasts
A total of 256 isolates stemming from 15 vacuum-packed beef
samples were selected from plates and identified by FTIRspectroscopy
and DNA sequencing. The results of the identification
are given in Table 1.
C. zeylanoides, K. psychrophila and C. sake were most frequently
found in the samples. About 80% of the 30 vacuum-packed beef
samples contained C. zeylanoides, 76.7% K. psychrophila and 70%
contained C. sake. Furthermore, these three yeasts were isolated
from many of the beef samples stemming from the 15 different
producers (see Table 1). C. zeylanoides was detected in samples
from 11 producers, K. psychrophila in samples from 10 of the producers
and C. sake in 21 samples from 8 different producers (see
Table 1). D. hansenii was detected at a lower incidence. This yeast
was found in 14 (46.7%) samples from 10 different producers. In
comparison to that, the yeasts Candida alimentaria, Candida
argentea, Cryptococcus carnescens, Cryptococcus curvatus, Cystofilobasidium
macerans, Filobasidium uniguttulatum, Mrakia frigida,
Mrakia robertii, Pichia fermentans and R. mucilaginosa were only
rarely detected in this study (3.3%e20%).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1.4. รหัสยีสต์ยีสต์ที่ระบุโดยใช้เทคโนโลยีที่แตกต่างกันสองกการแปลงฟูรีเยช่วงอินฟราเรด (FTIR) ใช้ prescreenyeasts ทุกแยก (Wenning et al., 2002 Wenning และScherer, 2013) ดังกล่าว ตัวแทนแยก (n ¼ 10)ที่ไม่สามารถระบุในฐานข้อมูลของ FTIR และที่ดังจาก YGC agar ได้ระบุ โดย 26S rRNA ยีนลำดับคัดกรองยีสต์ ด้วย FTIR ทำตาม Kümmerleal. ร้อยเอ็ด (1998) โดยใช้การ IFS 28B FTIR สเปกโตรมิเตอร์ (เลนส์ BrukerEttlingen เยอรมนี) สายพันธุ์ที่ปลูกใน YGC agar (เมอร์คประเทศเยอรมนี) และ incubated สำหรับ 24 ± 0.5 h ที่ 27 ± 2 C (Wenning และScherer, 2013) นี้เป็นเพราะการ FTIR Spectrometry, preincubationที่ 27 C เป็นส่วนหนึ่งของโพรโทคอลที่เป็นมาตรฐานสำหรับการสร้างแรมสเป็คตรายีสต์ ดังนั้น yeasts ทั้งหมดในฐานข้อมูลนี้ได้incubated ที่ c. 27 มาตรฐาน วนหนึ่งของชีวมวลได้หยุดชั่วคราวใน 100 mL ของน้ำ และ 25 mL การระงับเชื้อแบคทีเรียวางบนสังกะสี selenide อย่างผู้ขนส่ง และแห้งสำหรับ 45 นาทีที่ค. 42 พารามิเตอร์วัดต่อไปนี้ถูกใช้ในการบันทึกFTIR แรมสเป็คตรา: 6 cm1 ความละเอียด ความเร็วในการสแกน 20 kHz, BlackmaneHarrisApodization ระยะ 3, zerofilling 4 ประมวลผลข้อมูลที่ดำเนินการโดยใช้ OPUS V. 5.5 (เลนส์ Bruker เยอรมนี) สำหรับรหัสอนุพันธ์อันดับสองคำนวณ โค้งตามSavitzky Golay (1964) และเวกเตอร์ตามปกติแรมสเป็คตราได้ระบุฐานข้อมูลภายในเดิม16 เผยแพร่โดย Kümmerle et al. (1998), แต่ขยายรวมประมาณ 2400 แรมสเป็คตราจาก 250 ชนิด บางแยกได้psychrotolerant และไม่เจริญเติบโตที่ 27 C การอ้างอิงขนาดเล็กฐานข้อมูลคอมไพล์สำหรับแรมสเป็คตราของยีสต์เติบโตในการบ่มอุณหภูมิ 10 C รวมแรมสเป็คตราจากสายพันธุ์ตามลำดับแยกต่างหากในการศึกษาปัจจุบันสกัดดีเอ็นเอ ขยาย และจัดลำดับ: ยีสต์เซลล์จากวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของทั้งหมดไม่แยก (ดูคัดกรอง IR ฟุต) ได้โอนย้ายไปหลอด 1.5 มิลลิลิตร สกัดดีเอ็นเอ genomic สำหรับลำดับของยีน 26S rRNA ทำใช้ DNeasyเลือดและเนื้อเยื่อชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี) ชุดปั๊มหมึกง 1/D2rRNA ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ NL1 และ NL4 (Libkind et al.,2003 Kurtzman และ Robnett, 1998) ขยายของง 1/D2โดเมนถูกดำเนินการใน cycler ความร้อน (C 1000 ไบโอ-Radมิวนิค เยอรมัน) ตามขั้นตอนต่อไปนี้ดัดแปลงจาก Kurtzman และ Robnett (1998): denaturation เริ่มต้นที่ 95 C สำหรับ10 นาที วงจรขยาย 30 (C 92 สำหรับ 40 s, C 55 สำหรับ 40 s และซี 72 สำหรับ 30 s) และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 C สำหรับ 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR ที่บริสุทธิ์ที่ มีฟอก PCR Qiaquickชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตและตามลำดับ โดยจัดลำดับบริการ EurofinsMWG (Ebersberg เยอรมนี) ดำเนินการเปรียบเทียบลำดับใช้ตำแหน่งพื้นฐานท้องถิ่นค้นหาเครื่องมือ (ระเบิด) ในGenBank (ส่วน www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) หลังจากแก้ไข และตัดแต่งลำดับที่ใช้ BioEdit ลำดับตำแหน่งแก้ไข รุ่น7.0.0 แยกยีสต์ระบุตามคล้ายคลึงกับ 99e100%เกณฑ์การ2.2 การท้าทายทดสอบ2.2.1 การเตรียมและการเก็บรักษาเนื้อเนื้อ (ตากลม) ถูกซื้อจากบิดาในท้องถิ่นBayreuth เยอรมนี ตัวอย่างได้รับเย็น (C 2)และมี vacuum-packed 4 วันหลังจาก slaughtering การจำลองแบบผิวเนื้อซึ่งเป็นเหมือนองค์ประกอบเชื้อแบคทีเรียที่ได้รับหลังจาก slaughtering ตัวอย่างเนื้อละล้างมีเอทานอล 70% สำหรับ 5 s และทอดราดเพื่อลดจำนวนจุลินทรีย์บนพื้นผิว ในเวลาต่อมา ผิว flamed ถูกเอาออก(2e3 ซม.หนา) และ 10-12 ชิ้นถูกตัดจากตากลมตัวอย่างแต่ละรูปแบบสเต็กหนาซม. 4e5 สเต็กได้แล้วแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มหนึ่งของ 200 ± 10 กรัมเนื้อ (เกือบ100 cm2) เป็น inoculated กับคุณ psychrophila สายพันธุ์ (ดูด้านล่าง),ในขณะที่อีกผู้ทรงควบคุม inoculated ยังไม่ได้ลบ Inoculatedและสเต็กเนื้อ inoculated ไม่ได้อยู่ในถุงสูญญากาศ(15.2 21.6 cm, 3 ล้านอุปสรรคมาตรฐาน ไนล่อนพลาสติกสุญญากาศกระเป๋า Dagema, Willich เยอรมัน), สุญญากาศบรรจุ (Multivac C -100 Multivac, Wolfertschwingen เยอรมนี) และจัดเก็บที่ C 4 สำหรับวันที่ 842.2.2. inoculation เนื้อ vacuum-packed กับคุณ psychrophilaมี lyophilized สามเค psychrophila สายพันธุ์ (Kabisch et al., 2013)และเก็บไว้ใน 10% นมผงที่ 4 C. สายพันธุ์ที่ปลูกต่างหากที่ C 10 วัน 7 ใน 9 mL ของซุป LuriaeBertani (LBbrothเมอร์ค ดาร์มส เยอรมนี) บริการเซลล์ของคุณ psychrophilaสายพันธุ์เก็บเกี่ยวผลผลิต และผสมเกลือสรีรวิทยาโซลูชั่น (0.85% NaCl) ที่ระดับ inoculum ของ 6 log10 cfu mL1.ความหนาแน่นของ inoculum ได้ยืนยัน microscopically ใช้ Thoma เป็นเซลล์นับหอ (สดใสสาย หล่อ-Laboroptik, Bad Homburgเยอรมนี) แล้ว 100 cm2 วัสดุเนื้อดิบได้ inoculated ด้วยผสมสาม Kazachstania สายพันธุ์ H 382, H 409 และH433T ¼ DSM 26230T (Kabisch et al., 2013), ถึง inoculation การความหนาแน่น 2 log10 cfu ต่อเนื้อ cm2 ตัวอย่างควบคุมไม่ได้inoculated กับคุณ psychrophila2.2.3 การสุ่มตัวอย่างการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยา 3 inoculated ไม่ใช่สามมีวิเคราะห์ตัวอย่างเนื้อ inoculated vacuum-packed ในวันที่ 02, 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 33, 40, 47, 54, 68 และ 84 การทดลองได้ดำเนินการใน triplicate ในจำนวนจุดข้อมูล 9ชั้นประมาณความหนา 2 มม.และ 20 cm2ถูกaseptically ออกจากพื้นที่ภายนอกของเนื้อ วางไว้ในถุงใส่แผงประดับหน้าอก (Carl รอด คาร์ลส์รูเออ เยอรมนี) กับปริมาณ 20 mLpeptone ถูกบัฟเฟอร์ของน้ำ (Sifin เบอร์ลิน เยอรมนี) และ homogenized เป็นกลุ่มในมีแผงประดับหน้าอก (400 แผงประดับหน้าอก เวิร์ด สหราชอาณาจักร) สำหรับ 180 s ห้องอุณหภูมิ Mesophilic แอโรบิกนับ Enterobacteriaceae และการตรวจนับแบคทีเรียกรดแลกติกได้กำหนดดังที่ต่ำกว่า 2.1คุณ psychrophila จำนวนถูกกำหนดบน agar มอลต์สกัดเสริม ด้วย 125 mgL1 (เมอร์ค ดาร์มส เยอรมนี),novobiocin (บริษัทเมอร์ค ดาร์มส เยอรมนี) ยับยั้งแบคทีเรียเจริญเติบโต การแจงนับจำนวนยีสต์สำเร็จดังที่ด้านล่างนี้Psychrophila ยีสต์คุณได้รับการยืนยันในวันที่ 0, 5, 16, 23, 47และ 84 ตามลำดับ (ดู 2.1) ในกรณีของยีสต์บวกผลลัพธ์ในควบคุม แยกทั้งหมดถูกเรียงลำดับ2.2.4. ดิออร์วิเคราะห์เนื้อบรรจุสูญญากาศสำหรับแต่ละการทดลอง การควบคุมสาม และสาม inoculated beefsวิเคราะห์ในซ้ำในแต่ละครั้งสุ่มตัวอย่าง (วันที่ 0, 2, 5, 9, 1216, 19, 23, 26, 33, 40, 47, 54, 68 และ 84) กิจกรรมน้ำและ pHmeasurementsได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (2.1)2.2.5 รับความรู้สึกวิเคราะห์คุณภาพของผลิตภัณฑ์ถูกประเมิน โดย panelists สามฝึกฝน แต่ละpanelist อธิบายคำเขา/เธอเองที่ปิดกลิ่น ออกรส และกระชิ้นเนื้อโดยตรงหลังจากการเปิดบรรจุภัณฑ์ Aใช้กับสามประเภทเพื่อจัดประเภทผลิตภัณฑ์ คลาส 1corresponded กับผลิตภัณฑ์คุณภาพสูงโดยไม่มีการปิดกลิ่น หรือปิด-รสหรือกระ คลาส 2 corresponded กับผลิตภัณฑ์ที่มีcorresponded เล็กน้อยปิดกลิ่น หรือรส ชาติออก หรือกระ และชั้น 3ผลิตภัณฑ์ที่ไม่สามารถยอมรับปิดกลิ่นหรือรสชาติออก หรือเปลี่ยนสี3. ผลลัพธ์3.1 การสำรวจเนื้อ vacuum-packedระหว่างปี 2553 และ 2012 เนื้อผลิตภัณฑ์ (ตากลม) ขายปลีกร้านค้าและ butcheries ภายในบาวาเรีย เยอรมนีได้ตัวอย่าง และตรวจสอบค่า pH: ค่า pH อย่างเนื้อ vacuum-packedอยู่ในช่วงจาก 5.38 จะ 6.65 กับค่าเฉลี่ย 5.65น้ำกิจกรรม: กิจกรรมวัดน้ำแตกต่างกันระหว่าง0.9781 และ 0.9925 ค่าเฉลี่ยของตัวอย่าง 0.9872นับจำนวนจุลินทรีย์ที่พบใน vacuum-packedเนื้อที่ได้รับจากผู้ผลิตอื่น 15 จะถูกสรุปใน Fig. 1แอโรบิก mesophilic แบคทีเรีย: แบคทีเรียรวมนับแตกต่างกัน3 การล็อก 8.4 cfu ต่อ cm2มีมัธยฐานรวมจำนวน5.79 cfu cm2 (ดู Fig. 1)แบคทีเรียกรดแลกติก: นับจำนวนของแบคทีเรียกรดแลกติก (LAB)ได้มีกำหนดในตัวอย่างเนื้อ vacuum-packed และแตกต่างจาก 2.5 การล็อก 8.28 cfu ต่อ cm2 (ดู Fig. 1) ค่ามัธยฐานแล็กติกจำนวนแบคทีเรียกรดถูก 5.82 cfu ต่อ cm2.Enterobacteriaceae: ประมาณ 56% (n ¼ 28) ตัวอย่างของเนื้อทั้งหมดประกอบด้วย Enterobacteriaceae นับจำนวนเซลล์ที่อยู่ในช่วงจาก 2 ไป 7.38ล็อก cfu cm2มีมัธยฐานของ 3.8 cfu ต่อ cm2.Psychrophilic yeasts นับ: พบ Psychrophilic yeasts30% (n ¼ 15) อย่าง vacuum-packed เนื้อทั้งหมด การตรวจนับแตกต่างกันจาก 1.0 6.65 cfu ต่อ cm2มีค่ามัธยฐานของcm2 3.76 cfu สำหรับตัวอย่างบวก (ดู Fig. 1)เจ Kabisch 3.2. ความหลากหลายของ psychrophilic yeastsจำนวน 256 แยกอันเนื่องมาจากเนื้อ vacuum-packed 15ตัวอย่างที่เลือกจากแผ่น และระบุ FTIRspectroscopyและจัดลำดับของดีเอ็นเอ ผลลัพธ์ของรหัสได้ในตารางที่ 1คุณ psychrophila, C. zeylanoides และ C. สาเกได้บ่อยพบในตัวอย่าง ประมาณ 80% ของเนื้อ vacuum-packed 30ประกอบด้วยค. zeylanoides, psychrophila คุณ 76.7% และ 70%ประกอบด้วยค.สาเก นอกจากนี้ yeasts สามเหล่านี้ถูกแยกจากตัวอย่างเนื้ออันเนื่องมาจาก 15 แตกต่างกันมากมายผู้ผลิต (ดูตารางที่ 1) C. zeylanoides พบในตัวอย่างจากผู้ผลิต 11, psychrophila คุณในตัวอย่างจาก 10 ของผู้ผลิตและสาเก C. ใน 21 ตัวอย่างจากผู้ผลิตต่าง ๆ 8 (ดูตาราง 1) D. hansenii พบที่อุบัติการณ์ต่ำกว่า ยีสต์นี้พบใน (46.7%) ตัวอย่างที่ 14 จากผู้ผลิตต่าง ๆ 10 ในเปรียบเทียบกับที่ alimentaria แคน yeasts แคนargentea, Cryptococcus carnescens, Cryptococcus curvatus, Cystofilobasidiummacerans, Filobasidium uniguttulatum, Mrakia frigidaMrakia robertii, Pichia fermentans และ R. mucilaginosa ได้เท่านั้นไม่ค่อยพบในการศึกษานี้ (3.3%e20%)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1.4
บัตรประจำตัวยีสต์สายพันธุ์ยีสต์ที่ถูกระบุโดยใช้สองเทคโนโลยีที่แตกต่างกัน.
ฟูริเยร์-Transform อินฟราเรด (FTIR) สเปกถูกใช้ในการ prescreen
สายพันธุ์ยีสต์ทั้งหมด (Wenning, et al., 2002; Wenning
และเชียเรอร์2013) ต่อไปนี้เป็นตัวแทนไอโซเลท (n ¼ 10)
ที่ไม่สามารถระบุในฐานข้อมูล FTIR
และที่เกิดจากอาหารเลี้ยงเชื้อYGC ถูกระบุ 26S rRNA ลำดับยีน.
คัดกรองยีสต์ที่มี FTIR ได้ทำตามKümmerle
et al, (1998) โดยใช้ไอเอฟเอสเปกโตรมิเตอร์ 28B FTIR (Bruker Optics,
Ettlingen, เยอรมนี) สายพันธุ์ที่ได้รับการปลูกใน YGC วุ้น (เมอร์ค,
เยอรมนี) และบ่มเป็นเวลา 24 ± 0.5 ชั่วโมงที่ 27 ± 2 C (Wenning
และเชียเรอร์2013) นี่เป็นเพราะ FTIR Spectrometry, preincubation
ที่ 27 C
เป็นส่วนหนึ่งของโปรโตคอลมาตรฐานสำหรับการสร้างสเปกตรัมยีสต์ ดังนั้นยีสต์ทั้งหมดที่อยู่ในฐานข้อมูลนี้ได้รับการบ่มที่ 27 องศาเซลเซียสเป็นมาตรฐานหนึ่งวงเต็มรูปแบบของชีวมวลที่ถูกระงับใน100 มิลลิลิตรของน้ำและ 25 มลระงับเชื้อแบคทีเรียอยู่กับผู้ให้บริการตัวอย่างสังกะสีselenide และแห้งเป็นเวลา 45 นาทีที่42 องศาเซลเซียส พารามิเตอร์ที่วัดต่อไปนี้ถูกใช้ในการบันทึกFTIR สเปกตรัม: ความละเอียด 6 CM1 20 เฮิร์ทซ์ความเร็วในการสแกน, BlackmaneHarris apodization 3 ระยะ, zerofilling ของ 4. การประมวลผลข้อมูลที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้OPUS 5.5 โวลต์ (Bruker Optics, เยอรมนี) สำหรับการระบุอนุพันธ์อันดับสองได้รับการคำนวณเรียบตามไปSavitzky และ Golay (1964) และเวกเตอร์ปกติ. Spectra ถูกระบุฐานข้อมูลในบ้านที่เดิม16 เผยแพร่โดยKümmerle et al, (1998) แต่ถูกขยายเพื่อรวมประมาณ 2400 สเปกตรัมจาก 250 สายพันธุ์ ในฐานะที่เป็นสายพันธุ์บางคนที่ทนความเย็นและไม่ได้เติบโตที่ 27 C อ้างอิงขนาดเล็กฐานข้อมูลที่รวบรวมสำหรับสเปกตรัมของยีสต์เติบโตที่บ่มที่อุณหภูมิ10 องศาเซลเซียสรวมทั้งสเปกตรัมจากสายพันธุ์ติดใจแยกได้ในการศึกษาปัจจุบัน. สกัดดีเอ็นเอขยายและลำดับ เซลล์ยีสต์จากวัฒนธรรมของเชื้อบริสุทธิ์ที่ไม่ปรากฏชื่อ(ดูการตรวจคัดกรอง FT-IR) ได้รับการถ่ายโอนไปยังหลอด1.5 ml การสกัดดีเอ็นเอสำหรับการเรียงลำดับของยีน 26S rRNA ได้รับการดำเนินการโดยใช้ DNeasy เลือดและเนื้อเยื่อ Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) D1 / D2 LSU rRNA ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์และ NL1 NL4 (Libkind, et al. 2003; เคิร์ทซ์และ Robnett, 1998) การขยายของ D1 / D2 โดเมนที่ได้ดำเนินการใน Cycler ความร้อน (C 1000 Bio-Rad, มิวนิค, เยอรมนี) ตามขั้นตอนต่อไปนี้ดัดแปลงมาจากเคิร์ทซ์และRobnett (1998): denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา10 นาที, 30 ขยาย รอบ (92 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 วินาที, 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 และ72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที) และขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที. ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์กับ Qiaquick PCR บริสุทธิ์Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิตและจัดลำดับการเรียงลำดับโดยบริการของEurofins MWG (Ebersberg, เยอรมนี) การเปรียบเทียบลำดับได้ดำเนินการโดยใช้การจัดตำแหน่งในท้องถิ่นพื้นฐานเครื่องมือในการค้นหา (ระเบิด) ใน GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) หลังจากการแก้ไขและการตัดแต่งลำดับโดยใช้โปรแกรมแก้ไขลำดับการจัดเรียงBioEdit รุ่น7.0.0 ยีสต์สายพันธุ์ที่ถูกระบุอยู่บนพื้นฐานของความคล้ายคลึงกัน% 99e100 เกณฑ์. 2.2 ท้าทายทดสอบ2.2.1 การเตรียมและการเก็บรักษาเนื้อวัวเนื้อ (ตารอบ) ซื้อมาจากโรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่นในไบรอยท์เยอรมนี ตัวอย่างที่ได้รับแช่เย็น (2 C) และได้รับการบรรจุสูญญากาศ 4 วันหลังจากการฆ่า เพื่อจำลองพื้นผิวเนื้อซึ่งเป็นที่คล้ายกันในองค์ประกอบของเชื้อแบคทีเรียที่ได้รับไม่นานหลังจากที่การฆ่าแต่ละตัวอย่างเนื้อถูกล้างด้วยเอทานอล70% เป็นเวลา 5 วินาทีและ flamed เพื่อลดจำนวนจุลินทรีย์บนพื้นผิว ต่อจากนั้นพื้นผิว flamed ถูกลบออก(2e3 ซม. หนา) และ 10 ถึง 12 ชิ้นถูกตัดออกจากตาของรอบตัวอย่างแต่ละรูปแบบ4e5 ซมสเต็กหนา สเต็กจากนั้นก็แบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม หนึ่งในกลุ่มของ 200 ± 10 กรัมเนื้อ (เกือบ100 cm2) ได้รับเชื้อด้วยเค psychrophila สายพันธุ์ (ดูด้านล่าง) ในขณะที่คนอื่น ๆ ทำหน้าที่เป็นปฏิปักษ์ต่อเชื้อควบคุมเชิงลบ เชื้อและไม่ใช่เชื้อสเต็กเนื้อถูกวางลงในถุงสูญญากาศ(15.2 21.6 ซม. 3 ล้านบาทอุปสรรคมาตรฐานสูญญากาศไนลอนเอทิลิน? กระเป๋า; Dagema, วิลลิค, เยอรมนี) บรรจุสูญญากาศ (Multivac C- 100; Multivac, Wolfertschwingen, เยอรมนี) และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา84 วัน. 2.2.2 การฉีดวัคซีนของเนื้อสูญญากาศเต็มไปด้วยเค psychrophila สามสายพันธุ์เค psychrophila (Kabisch et al., 2013) ได้รับการแห้งและเก็บไว้ใน10% นมผงที่ 4 ซีสายพันธุ์ปลูกแยกกันอยู่ที่10 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน 9 มิลลิลิตร น้ำซุป LuriaeBertani (LBbroth; เมอร์ค, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) เซลล์แขวนลอยเค psychrophila สายพันธุ์ที่ได้รับการเก็บเกี่ยวและเกลือเจือจางในทางสรีรวิทยาการแก้ปัญหา (0.85% NaCl) ให้อยู่ในระดับหัวเชื้อ 6 log10 cfu ML1. ความหนาแน่นของเชื้อได้รับการยืนยันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Thoma เซลล์นับห้อง (Bright-Line; LO-Laboroptik, ฮอม Bad, เยอรมนี) จากนั้น 100 cm2 ของวัสดุเนื้อดิบได้รับเชื้อด้วยส่วนผสมของทั้งสามสายพันธุ์Kazachstania H 382, 409 และ H H433T ¼ DSM 26230T (Kabisch et al., 2013) ในการเข้าถึงการฉีดวัคซีนความหนาแน่นของ2 log10 cfu ต่อ cm2 เนื้อ ตัวอย่างควบคุมไม่ได้รับเชื้อด้วยเค psychrophila. 2.2.3 การเก็บตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาสามที่ไม่ใช่เชื้อและสามเชื้อสูญญากาศบรรจุตัวอย่างเนื้อวิเคราะห์ในวันที่0, 2, 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 33, 40, 47, 54, 68 และ 84 . การทดลองดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าส่งผลให้ได้สูงสุด9 จุดข้อมูล. ชั้นประมาณ 2 ความหนามิลลิเมตรและ 20 cm2 ถูกลบออกปลอดเชื้อจากพื้นที่ด้านนอกของเนื้อสัตว์ที่วางไว้ในถุงStomacher หมัน (คาร์ลโรทรีฟฟ์เยอรมนี ) 20 มิลลิลิตรน้ำเปปโตนบัฟเฟอร์(Sifin, เบอร์ลิน, เยอรมนี) และปั่นในStomacher (ที่ Stomacher 400, เอิร์ดสหราชอาณาจักร) 180 s ณ ห้องอุณหภูมิ นับ mesophilic แอโรบิก, Enterobacteriaceae และนับแบคทีเรียกรดแลคติกได้รับการพิจารณาตามที่อธิบายไว้ภายใต้2.1. เค นับ psychrophila ได้รับการพิจารณาในมอลต์สกัดจากวุ้น(เมอร์ค, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) เสริมด้วย 125 mgL1 Novobiocin (เมอร์ค, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) ในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียเจริญเติบโต การแจงนับนับยีสต์ได้ทำตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง. ยีสต์เค psychrophila ได้รับการยืนยันในวันที่ 0, 5, 16, 23, 47 และ 84 โดยลำดับ (ดู 2.1) ในกรณีที่มีผลในเชิงบวกในยีสต์ควบคุมทุกสายพันธุ์มีลำดับขั้นตอน. 2.2.4 ทางกายภาพและทางเคมีวิเคราะห์สูญญากาศบรรจุเนื้อสำหรับการทดสอบแต่ละสามการควบคุมและสาม beefs เชื้อวิเคราะห์ในที่ซ้ำกันในแต่ละช่วงเวลาการสุ่มตัวอย่าง(วันที่ 0, 2, 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 33, 40, 47, 54, 68 และ 84) กิจกรรม pHmeasurements น้ำและได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น(2.1). 2.2.5 การวิเคราะห์ทางประสาทสัมผัสที่มีคุณภาพสินค้าได้รับการประเมินโดยสามผู้ร่วมอภิปรายได้รับการฝึกฝน แต่ละpanelist อธิบายไว้ในคำพูดของเขา / เธอเองออกกลิ่นปิดรสชาติและการเปลี่ยนสีของชิ้นเนื้อโดยตรงหลังจากเปิดแพคเกจ ขนาดมีสามประเภทถูกใช้ในการจำแนกผลิตภัณฑ์ ชั้น 1 ตรงกับผลิตภัณฑ์ที่มีคุณภาพสูงโดยไม่ต้องมีการปิดหรือนอกกลิ่นรสหรือเปลี่ยนสีชั้น 2 ตรงกับผลิตภัณฑ์ที่มีเล็กน้อยปิดหรือปิดกลิ่นรสหรือการเปลี่ยนสีและชั้น3 ตรงกับผลิตภัณฑ์ที่มีออกที่ยอมรับไม่ได้กลิ่นหรือปิดรสชาติหรือเปลี่ยนสี. 3 ผล3.1 การสำรวจของเนื้อสูญญากาศบรรจุระหว่างปี 2010 และปี 2012 เนื้อผลิตภัณฑ์ (ตารอบ) ของการค้าปลีกร้านค้าและbutcheries ท้องถิ่นในบาวาเรียเยอรมนีเก็บตัวอย่างและการตรวจสอบ. ค่า pH: ค่า pH ค่าของตัวอย่างเนื้อสูญญากาศบรรจุตั้งแต่5.38-6.65 มีค่าเฉลี่ย 5.65 ได้. กิจกรรมน้ำกิจกรรมทางน้ำที่วัดได้แตกต่างกันระหว่าง0.9781 และ 0.9925 ค่าเฉลี่ยของกลุ่มตัวอย่างมี 0.9872. นับจุลินทรีย์ที่ถูกตรวจพบในสูญญากาศบรรจุเนื้อวัวที่ได้รับจากผู้ผลิตที่แตกต่างกัน 15 ได้สรุปไว้ในรูป 1. แอโรบิคแบคทีเรีย mesophilic: นับรวมแบคทีเรียที่แตกต่างกัน3-8.4 log CFU ต่อ cm2 มีการนับรวมเฉลี่ย5.79 cfu cm2 (ดูรูปที่ 1).. แลคติกกรดแบคทีเรียนับ: นับจากแบคทีเรียกรดแลคติก (LAB) ได้รับการพิจารณาในสูญญากาศบรรจุตัวอย่างเนื้อและแตกต่างกัน 2.5-8.28 cfu ล็อกต่อ cm2 (ดูรูปที่ 1). เฉลี่ยแลคติกแบคทีเรียกรดนับเป็น 5.82 cfu ต่อ cm2. Enterobacteriaceae: เกี่ยวกับ 56% (n ¼ 28) ของกลุ่มตัวอย่างเนื้อทั้งหมดที่มีอยู่Enterobacteriaceae เซลล์นับตั้งแต่ 2-7.38 ล็อก cfu cm2 มีค่ามัธยฐานของ 3.8 cfu ต่อ cm2. ยีสต์ Psychrophilic นับ: ยีสต์ Psychrophilic ถูกตรวจพบใน30% (n ¼ 15) ของทุกตัวอย่างเนื้อบรรจุสูญญากาศ นับที่แตกต่างกัน 1.0-6.65 cfu ต่อ cm2 มีมูลค่าเฉลี่ย3.76 cfu cm2 สำหรับกลุ่มตัวอย่างที่เป็นบวก (ดูรูปที่ 1).. เจ Kabisch 3.2 ความหลากหลายของยีสต์ psychrophilic ทั้งหมด 256 สายพันธุ์ที่เกิดจาก 15 สูญญากาศบรรจุเนื้อตัวอย่างได้รับการคัดเลือกจากจานและระบุFTIRspectroscopy และลำดับดีเอ็นเอ ผลของประชาชนที่จะได้รับในตารางที่ 1 ซี zeylanoides พ psychrophila และ C ประโยชน์ที่ได้รับบ่อยที่สุดที่พบในตัวอย่าง ประมาณ 80% ของ 30 สูญญากาศบรรจุเนื้อตัวอย่างมีzeylanoides ซี 76.7% เค psychrophila 70% และมีประโยชน์ในซี นอกจากนี้ทั้งสามยีสต์ที่แยกได้จากหลายตัวอย่างเนื้ออันเนื่องมาจาก 15 ที่แตกต่างกันผู้ผลิต(ดูตารางที่ 1) ซี zeylanoides ถูกตรวจพบในตัวอย่างจาก11 ผู้ผลิตเค psychrophila ในตัวอย่างจาก 10 ของผู้ผลิตและสาเกซีใน21 ตัวอย่างจากผู้ผลิตที่แตกต่างกัน 8 (ดูตารางที่1) D. hansenii ถูกตรวจพบที่อัตราการเกิดที่ลดลง ยีสต์นี้พบว่าในวันที่ 14 (46.7%) 10 ตัวอย่างจากผู้ผลิตที่แตกต่างกัน ในการเปรียบเทียบกับนั้นยีสต์ Candida Alimentaria, Candida argentea, Cryptococcus carnescens, Cryptococcus curvatus, Cystofilobasidium macerans, Filobasidium uniguttulatum, Mrakia frigida, Mrakia robertii, fermentans Pichia และอาร์ mucilaginosa เป็นเพียงการตรวจพบน้อยมากในการศึกษาครั้งนี้(3.3% e20%) .

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1.4 . ยีสต์สายพันธุ์ยีสต์ที่ถูกระบุว่าใช้ตัว

สองเทคโนโลยีที่แตกต่างกัน ฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี ( FTIR ) ใช้ prescreen
ทั้งหมดยีสต์สายพันธุ์ ( เวนนิ่ง et al . , 2002 ; เวนนิ่งและ
เชอร์เรอร์ , 2013 ) ต่อไปนี้ เป็นตัวแทนจาก ( N ¼ 10 )
ที่ไม่สามารถระบุในฐานข้อมูลซึ่งเกิด
( และจาก ygc วุ้นถูกระบุโดย 26 rRNA ยีน ลำดับ .
ยีสต์คัดกรองกับ FTIR ทำได้ตาม K ü mmerle
et al . ( 1998 ) ใช้ IFS 28A FTIR Spectrometer ( BRUKER เครื่องแก้ไขภาพกล้อง
Ettlingen เยอรมนี ) สายพันธุ์ที่ปลูกใน ygc agar ( Merck
, เยอรมนี ) และบ่มเป็นเวลา 24 ± 0.5 H ที่ 27 ± 2 C ( เวนนิ่งและ
เชอร์เรอร์ , 2013 ) นี้เป็นเพราะสำหรับ FTIR สเปคตรัมพบ
,ที่ 27 C เป็นส่วนหนึ่งของโปรโตคอลที่เป็นมาตรฐานสำหรับการสร้าง
ยีสต์ Spectra . ดังนั้น ยีสต์ ทั้งหมดในฐานข้อมูลนี้
อุณหภูมิมาตรฐาน 27 C หนึ่งรอบเต็มรูปแบบของชีวมวลคือ
แขวนลอยใน 100 มิลลิลิตรของน้ำและ 25 มิลลิลิตร
bacterial suspension ถูกวางไว้บนซิงค์ซีลีไนด์ตัวอย่างผู้ให้บริการและแห้งสำหรับ 45 นาทีที่ 42 C
ต่อไปนี้การวัดพารามิเตอร์ที่ใช้บันทึก
FTIR spectra :6-cm1 ความละเอียด 20 kHz สแกนความเร็ว , blackmaneharris
3-term อะโพไดเซชัน zerofilling , 4 . การประมวลผลข้อมูล
ได้ดําเนินการโดยใช้ Opus โวลต์ 5.5 ( BRUKER ทัศนศาสตร์ , เยอรมัน ) อนุพันธ์ที่สองสำหรับ
การคํานวณและการ savitzky เรียบตาม
golay ( 1964 ) และเวกเตอร์ปกติ .
spectra ถูกระบุโดยภายในฐานข้อมูลที่ถูก

ที่ 16 K ü mmerle et al .( 1998 ) แต่ถูกขยายเพื่อรวม
ประมาณ 2400 spectra จาก 250 ชนิด ขณะที่บางสายพันธุ์เป็น
psychrotolerant และไม่ได้เติบโตที่ 27 C , ฐานข้อมูลอ้างอิง
ขนาดเล็กถูกคอมไพล์มาสำหรับสเปกตรัมของยีสต์เติบโตที่บ่ม
อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส รวมถึงแสงจากสายพันธุ์ที่แยกได้ในการศึกษานี้

( ปัจจุบัน การสกัดดีเอ็นเอและลำดับการผลิต , ยีสต์เซลล์จาก
:เชื้อบริสุทธิ์ของทุกสายพันธุ์ ( เห็นได้คัดกรอง FT-IR )
โอน 1.5 ml หลอด การสกัดดีเอ็นเอสำหรับการลำดับยีนของแบคทีเรีย
26 การใช้เลือดและเนื้อเยื่อ dneasy
ชุด ( เพิ่มฮิลเดน , เยอรมนี ) D1 / D2 LSU
rRNA เป็นขยายและใช้ไพรเมอร์ nl1 nl4 (
libkind et al . , 2003 ; เคิร์ทแมน และ robnett , 1998 ) แบบ D1 / D2
โดเมนแสดงในรอบความร้อน ( C 1000 ไบแรด
, มิวนิค , เยอรมนี ) ตามขั้นตอนต่อไปนี้ดัดแปลงจาก เคิร์ทแมน และ robnett
( 1998 ) : เริ่มต้นที่ 95 ( C
10 นาที , 30 ( รอบ ( 92 C 40 S 55 C 40 s
72 C สำหรับ 30 วินาที ) และขยายสุดท้ายที่ 72 C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ที่ได้ทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR

qiaquick PCR Kit ( QIAGEN Hilden , บำบัดน้ำเสีย ,