2.4. Quantitative real-time PCR Tot

2.4. Quantitative real-time PCR
Total RNA was first isolated from sheep liver using Trizol Reagent (Invitrogen, USA). qRT-PCR was then performed using the LightCycler® 480 (Roche, Switzerland) with FastSYBR Mixture (CWBIO, China) to amplify a fragment of the sheep α-TTP gene; as a control the β-actin gene was utilized. The following oligonucleotide primers were used: forward, 5′-GGGCTATGTCGGTGTCCTG-3′; reverse, 5′-CTTGATTCCATTCCGCTGT-3′ and β-actin gene: forward, 5′-TGCGGCATTCACGAAACTAC-3′; reverse, 5′-AGGGCAGTGATCTCTTTCTG-3′. Product specificity was evaluated by melting curves and expression in sheep liver was normalized using the β-actin gene. The PCR conditions for all genes were: an initial denaturation at 95 °C for 20 s, followed by 40 cycles of 5 s of denaturation at 95 °C and annealing/extension at 60 °C for 30 s, and a final melting curve program (95 °C for 15 s and 60 °C for 15 s). Each total RNA sample was amplified in triplicates and the mean values were used for further analysis using the Efficiency-Corrected Method (Pfaffl, 2001).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การเชิงปริมาณแบบ real-time PCR
อาร์เอ็นเอทั้งหมดเป็นครั้งแรกแยกจากตับแกะใช้ Trizol รีเอเจนต์ (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) แล้วทำ qRT PCR 480 ® LightCycler (Roche สวิตเซอร์แลนด์) ด้วยส่วนผสม FastSYBR (CWBIO จีน) ขยายชิ้นส่วนของยีนα TTP แกะ เป็นตัวควบคุม มีใช้ยีนβ-แอกติน ใช้ไพรเมอร์ oligonucleotide ดังต่อไปนี้: ไปข้างหน้า 5′-GGGCTATGTCGGTGTCCTG-3′ ยีนกลับ 5′-CTTGATTCCATTCCGCTGT-3′ และβ-แอกติน: ไปข้างหน้า 5′-TGCGGCATTCACGAAACTAC-3′ ย้อนหลัง 5′-AGGGCAGTGATCTCTTTCTG-3′ ผลิตภัณฑ์ specificity ถูกประเมิน โดยละลายเส้นโค้ง และนิพจน์ในตับแกะได้ตามปกติโดยใช้ยีนβ-แอกติน PCR เงื่อนไขสำหรับยีนทั้งหมดถูก: denaturation เป็นเริ่มต้นที่ 95 ° C สำหรับ 20 s ตามรอบ 40 5 s denaturation ที่ 95 ° C และการอบเหนียว/ขยายที่ 60 ° C สำหรับ 30 s และโปรแกรมสุดท้ายละลายเส้นโค้ง (95 ° C 15 s และ 60 ° C 15 s) แต่ละตัวอย่างอาร์เอ็นเอรวมได้ขยายใน triplicates และใช้ค่าเฉลี่ยสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมโดยใช้วิธี Efficiency-Corrected (Pfaffl, 2001) .

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 เชิงปริมาณแบบ real-time PCR
รวมอาร์เอ็นเอที่แยกได้ครั้งแรกจากตับแกะใช้ Trizol Reagent (Invitrogen, USA) qRT-PCR ที่ได้ดำเนินการแล้วใช้LightCycler® 480 (โรชวิตเซอร์แลนด์) กับ FastSYBR ผสม (CWBIO, จีน) ในการขยายส่วนของยีนแกะα-TTP; เป็นตัวควบคุมยีนβ-โปรตีนถูกนำมาใช้ ไพรเมอร์ oligonucleotide ต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: ไปข้างหน้า 5'-GGGCTATGTCGGTGTCCTG-3 '; ย้อนกลับ 5'-CTTGATTCCATTCCGCTGT-3 และβ-โปรตีนยีน: ไปข้างหน้า 5'-TGCGGCATTCACGAAACTAC-3 '; ย้อนกลับ 5'-AGGGCAGTGATCTCTTTCTG-3 ' ความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ได้รับการประเมินโดยการละลายเส้นโค้งและการแสดงออกในตับแกะเป็นปกติโดยใช้ยีนβ-โปรตีน เงื่อนไข PCR สำหรับยีนทุกคน: denaturation เริ่มต้นที่ 95 ° C เป็นเวลา 20 วินาทีตามด้วย 40 รอบที่ 5 ของการสูญเสียสภาพธรรมชาติอยู่ที่ 95 องศาเซลเซียสและการหลอม / ขยายที่ 60 ° C นาน 30 วินาที, และโปรแกรมการละลายโค้งสุดท้าย (95 ° C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C เป็นเวลา 15 วินาที) แต่ละตัวอย่างอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกขยายใน triplicates และค่าเฉลี่ยถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมได้โดยใช้ประสิทธิภาพ-แก้ไขวิธี (Pfaffl, 2001)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . ปริมาณ RNA PCR แบบเรียลไทม์
รวมแยกได้ครั้งแรกจากตับแกะใช้ trizol Reagent ( Invitrogen , USA ) ข้าพเจ้าซึ่งก็เคยใช้ lightcycler ® 480 ( โรช , สวิตเซอร์แลนด์ ) ที่มีส่วนผสมของ fastsybr ( cwbio , จีน ) เพื่อขยายส่วนของแกะแอลฟายีน TTP เช่นการควบคุมยีนบีตา - actin จังหวัดศรีสะเกษ ต่อไปนี้ ซึ่งไพรเมอร์ที่ใช้ : ไปข้างหน้า5 ’ - ’ gggctatgtcggtgtcctg-3 ; ย้อนกลับ 5 ’ - ’และยีนบีตา - cttgattccattccgctgt-3 actin : ไปข้างหน้า , 5 ’ - ’ tgcggcattcacgaaactac-3 ; ย้อนกลับ 5 ’ - ’ agggcagtgatctctttctg-3 . ผลิตภัณฑ์ที่ประเมินโดยวิธีละลายเส้นโค้งและการแสดงออกในตับแกะเป็นรูปการใช้ยีนบีตา - actin . การตรวจเงื่อนไขทั้งหมด ( ยีน : เริ่มต้นที่ 95 องศา C เป็นเวลา 20 วินาทีตามด้วย 40 รอบ 5 s ( 95 องศา C และการอบอ่อนที่ 60 ° C / นามสกุล 30 , และสุดท้ายละลายโค้งโปรแกรม ( 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C เป็นเวลา 15 วินาที ) แต่ละตัวอย่างของ RNA ทั้งหมด 3 ซ้ำ และหมายความว่า ค่าวิเคราะห์ประสิทธิภาพการแก้ไขเพิ่มเติม โดยใช้วิธี pfaffl
, 2001 )