2.6 Nucleotide sequencingMaterial t

2.6 Nucleotide sequencing

Material to be sequenced from KT gradient fractions was treated with 50,000 gel units of micrococcal nuclease (New England BioLabs) for 2 h at 37 °C to digest non-particle associated nucleic acids. Total RNA and DNA was then extracted using QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) and DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) respectively, according to the manufacturer’s protocols. 0.5 ug of total RNA or DNA was fragmented by focused-ultrasonicator (Covaris) to generate fragments of approximately 250–300 bases. To prepare the RNA and DNA libraries from the fragments, the NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina (New England BioLabs) was used according to the manufacturer's protocol, resulting in the fragments being ligated to Illumina paired end (PE) adaptors. These were then amplified using 12 cycles of PCR with multiplex indexed primers and purified by magnetic beads (Agencourt AMPure PCR purification system, BeckmanCoulter). After analyzing the libraries for size and quality (BioAnalyzer, Agilent Technologies, Inc.), deep sequencing was performed using MiSeq (Illumina) producing 250 nucleotide paired-end reads. The raw sequencing reads were analyzed by the CensuScope algorithm (Shamsaddini et al., 2014) using custom software (https://hive.biochemistry.gwu.edu/dna.cgi?cmd=main). Briefly, to check the viral composition of the sample, 1000–10000 sequencing reads were aligned against the viral genome references composed from all viral genomes present in NCBI GenBank.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 ลำดับนิวคลีโอไทด์วัสดุจะเรียงลำดับจาก KT ส่วนไล่ระดับได้รับ 50,000 เจหน่วย micrococcal nuclease (อังกฤษใหม่ BioLabs) สำหรับ 2h ที่อุณหภูมิ 37 ° C ย่อยไม่ใช่อนุภาคกรดนิวคลีอิกที่เกี่ยวข้องออก RNA และ DNA ทั้งหมดที่แล้วถูกสกัดโดยใช้ ชุดมินิ RNA ไวรัส QIAamp (Qiagen) และ DNeasy เลือด และเนื้อเยื่อ Kit (Qiagen) ตามลำดับ ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ยูจี 0.5 ของ RNA หรือ DNA ทั้งหมดถูกมาก โดยมุ่งเน้นการ ultrasonicator (Covaris) เพื่อสร้างชิ้นส่วนประมาณ 250-300 สาขา การเตรียมห้องสมุด RNA และ DNA จากเศษ NEBNext mRNA ไลบรารีเตรียมหลักการผสมตั้งสำหรับ Illumina (อังกฤษใหม่ BioLabs) ใช้ตามโพรโทคอลของผู้ผลิต ในบางส่วนของการควบการ Illumina จับคู่อะแดปเตอร์ปลาย (PE) เหล่านี้ได้ แล้วขยาย 12 รอบของ PCR ด้วยไพรเมอร์ทำมัลติเพล็กซ์ และบริสุทธิ์ โดยลูกปัดแม่เหล็ก (PCR ซี Agencourt ฟอก BeckmanCoulter) หลังจากวิเคราะห์ไลบรารีสำหรับขนาดและคุณภาพ (BioAnalyzer, Agilent Technologies, Inc.), ลำดับลึกถูกดำเนินการโดยใช้ MiSeq (Illumina) ผลิตอ่านจบคู่นิวคลีโอไทด์ 250 อ่านดิบลำดับถูกวิเคราะห์ โดยอัลกอริทึม CensuScope (Shamsaddini et al. 2014) โดยใช้ซอฟต์แวร์แบบกำหนดเอง (https://hive.biochemistry.gwu.edu/dna.cgi?cmd=main) สั้น ๆ การตรวจสอบองค์ประกอบของตัวอย่างไวรัส 1000-10000 ลำดับอ่านที่ชิดกับอ้างอิงไวรัสพันธุที่ประกอบจาก genomes ไวรัสทั้งหมดใน NCBI GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 เบสลำดับวัสดุจะได้รับการจัดลำดับจาก KT เศษส่วนการไล่ระดับสีได้รับการรักษาที่มี 50,000 หน่วยเจล Nuclease micrococcal (นิวอิงแลนด์ BioLabs) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสจะแยกแยะไม่ใช่อนุภาคกรดนิวคลิอิกเกี่ยวข้อง RNA และ DNA รวมแล้วถูกสกัดโดยใช้ QIAamp ไวรัส RNA Mini Kit (Qiagen) และ DNeasy เลือดและเนื้อเยื่อ Kit (Qiagen) ตามลำดับตามโปรโตคอลของผู้ผลิต 0.5 ไมโครกรัมของ RNA รวมหรือ DNA ถูกแยกส่วนโดยมุ่งเน้น ultrasonicator (Covaris) เพื่อสร้างชิ้นส่วนของฐานประมาณ 250-300 เพื่อเตรียมความพร้อม RNA และ DNA จากห้องสมุดชิ้นส่วนที่ NEBNext mRNA ห้องสมุดเตรียมปริญญาโทผสมชุดสำหรับ Illumina (นิวอิงแลนด์ BioLabs) ถูกนำมาใช้ตามโพรโทคอของผู้ผลิตที่มีผลในชิ้นส่วนที่ถูกผูก Illumina การจับคู่จบ (PE) อะแดปเตอร์ เหล่านี้ถูกขยายแล้วใช้ 12 รอบของ PCR ที่มีการจัดทำดัชนี multiplex ไพรเมอร์และบริสุทธิ์โดยลูกปัดแม่เหล็ก (ระบบฟอก Agencourt AMPure PCR, BeckmanCoulter) หลังจากการวิเคราะห์ห้องสมุดสำหรับขนาดและคุณภาพ (BioAnalyzer, Agilent Technologies, Inc) ลำดับลึกได้ดำเนินการโดยใช้ MiSeq (Illumina) การผลิต 250 เบื่อหน่ายจับคู่สิ้นอ่าน ลำดับดิบอ่านการวิเคราะห์ขั้นตอนวิธีการ CensuScope นี้ (Shamsaddini et al., 2014) โดยใช้ซอฟต์แวร์ที่กำหนดเอง (https://hive.biochemistry.gwu.edu/dna.cgi?cmd=main) ในเวลาสั้น ๆ เพื่อตรวจสอบองค์ประกอบของไวรัสตัวอย่าง 1,000-10,000 ลำดับอ่านถูกจัดชิดกับการอ้างอิงจีโนมของไวรัสประกอบด้วยจากจีโนมของไวรัสทั้งหมดอยู่ใน NCBI GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์วัสดุเป็นลำดับจาก KT ลาดเศษส่วนได้รับการ 50 , 000 หน่วยของเจล micrococcal นิวเคลียส ( อังกฤษ biolabs ) 2 ไหม H ที่ 37  ° C ไม่มีอนุภาคย่อยกรดนิวคลีอิกที่เกี่ยวข้อง อาร์เอ็นเอทั้งหมดและดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้ qiaamp ไวรัส RNA ขนาดเล็กชุด ( เพิ่ม ) และเลือดและเนื้อเยื่อ dneasy ชุด ( เพิ่ม ) ตามลำดับ จากผู้ผลิตของโปรโตคอล 0.5 ไมโครกรัมของดีเอ็นเออาร์เอ็นเอทั้งหมดหรือแยกส่วน โดยเน้น ultrasonicator ( covaris ) เพื่อสร้างชิ้นส่วนประมาณ 250 – 300 ฐาน เตรียม RNA และห้องสมุดดีเอ็นเอจากชิ้นส่วน , nebnext mRNA ห้องสมุดต้นแบบผสมเตรียมชุดสำหรับ Illumina ( อังกฤษ biolabs ) ถูกใช้ตามขั้นตอนของผู้ผลิต ส่งผลให้เศษถูกผูกเพื่อ Illumina คู่สุดท้าย ( PE ) อะแดปเตอร์ . เหล่านี้แล้วขยายใช้ 12 รอบของ PCR PCR ไพรเมอร์กับดัชนีบริสุทธิ์โดยลูกปัดแม่เหล็ก ( ระบบบำบัดน้ำเสีย ) , agencourt เขตอำเภอเมือง beckmancoulter ) หลังจากวิเคราะห์ห้องสมุดขนาดและคุณภาพ ( bioanalyzer Agilent Technologies , Inc , ) เป็นลำดับลึกโดยใช้ miseq ( Illumina ) การผลิต 250 เบสคู่สุดท้ายคนอ่าน การจัดลำดับดิบอ่านวิเคราะห์ข้อมูลโดย censuscope ขั้นตอนวิธี ( shamsaddini et al . , 2010 ) การใช้ซอฟต์แวร์ที่กำหนดเอง ( https://hive.biochemistry.gwu.edu/dna.cgi ? cmd = หลัก ) สั้น ๆ , ตรวจสอบส่วนประกอบของไวรัสของตัวอย่าง 1 , 000 – 10 , 000 ลำดับอ่านชิดกับไวรัสจีโนมอ้างอิงประกอบจากทั้งหมดที่มีอยู่ใน ncbi ไวรัสจีโนมขนาด .