Expression of a hairpin RNA produce

Expression of a hairpin RNA produces P19 EC cell lines that stably silence GFP. (A) A cartoon of the FLIP cassette used to construct the GFP hairpin. GFP represents the first 500 coding base pairs of EGFP. Zeo, zeocin resistance gene; L, Lox; P, the cytomegalovirus promoter in the expression plasmid pcDNA3. HomologousGFPfragmentsarefirstclonedasdirectrepeatsintotheFLIPcassette.Tocreateinvertedrepeatsforhairpinproduction,thesecondrepeatisflipped by using Cre recombinase. When transcribed, the inverted repeat forms a GFP dsRNA with a hairpin loop. (B) P19 cell lines stably expressing the GFP hairpin plasmid, GFPhp.1 (clone 10) and GFPhp.2 (clone 12), along with wt P19 were transfected with 0.25  g each of GFP and RFP reporter genes. Fluorescence micrographs were taken by using filters appropriate for GFP and RFP. Magnification is 200.(C) P19 GFPhp.1 cells were transfected with pEGFP and 0, 0.5, or 1  gofDicerorfireflydsRNA.Fluorescencemicrographsweretakenat48hposttransfectionandaresuperimposedwithbrightfieldimagestorevealnon-GFP expressing cells. Magnification is 100.(D) In vitro and in vivo processing of dsRNA in P19 cells. In vitro Dicer assays were performed on S2 cells and three independentlypreparedP19extractsbyusing 32P-labeleddsRNA(30°Cfor30min).ANorthernblotofRNAextractedfromcontrolandGFPhp.1P19cellsshows the production of
22mer RNA species in hairpin-expressing cells but not in control cells. Blots were probed with a 32P-labeled ‘‘sense’’ GFP transcript

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ของกิ๊บ RNA สร้างบรรทัดเซลล์ P19 EC ที่จับปิด GFP (A การ์ตูน)ของกลักกระดาษพลิกใช้สร้างกิ๊บ GFP GFP แทนแรก 500 รหัสฐานคู่ของ EGFP Zeo ยีนต้านทาน zeocin L ล็อกซ์ P โปรโมเตอร์ cytomegalovirus ใน pcDNA3 plasmid ของนิพจน์ HomologousGFPfragmentsarefirstclonedasdirectrepeatsintotheFLIPcassette.Tocreateinvertedrepeatsforhairpinproduction,thesecondrepeatisflipped โดยใช้ Cre recombinase เมื่อทับศัพท์ ซ้ำกลับเป็น dsRNA GFP พร้อมห่วงกิ๊บ (ข) P19 เซลล์ต่าง ๆ สามารถถ่ายทอด plasmid กิ๊บ GFP, GFPhp.1 (โคลน 10) และ GFPhp.2 (โคลน 12), พร้อมกับ wt P19 ได้ transfected ราคาชิ้นละ 0.25 กรัมของยีนข่าว GFP และ RFP Micrographs สารเรืองแสงที่ถ่าย โดยใช้ฟิลเตอร์ที่เหมาะสมสำหรับ GFP RFP Magnification คือ 200 GFPhp.1 P19 (C) เซลล์มี transfected กับ pEGFP และ 0, 0.5, 1 gofDicerorfireflydsRNA.Fluorescencemicrographsweretakenat48hposttransfectionandaresuperimposedwithbrightfieldimagestorevealnon GFP แสดงเซลล์ Magnification คือ 100 (D) การประมวลผลในหลอดทดลอง และในสัตว์ทดลองของ dsRNA ในเซลล์ P19 Assays Dicer ในหลอดทดลองได้ดำเนินการในเซลล์ S2 และสาม independentlypreparedP19extractsbyusing 32P-labeleddsRNA(30°Cfor30min) ANorthernblotofRNAextractedfromcontrolandGFPhp.1P19cellsshows การผลิตพันธุ์ 22mer RNA ในกิ๊บแสดงเซลล์ แต่ ในเซลล์ที่ควบคุมไม่ จัดได้พิสูจน์กับเสียงบรรยาย GFP ป้าย 32P ''หนึ่ง ''

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แสดงออกของ RNA กิ๊บผลิต P19 EC เซลล์ที่เสถียรเงียบ GFP (ก) การ์ตูนของเทป FLIP ที่ใช้ในการสร้างกลไกและกิ๊บ GFP หมายถึงแรก 500 เข้ารหัสฐานคู่ของ EGFP เซโอ, zeocin ยีนต้านทาน; L, Lox; P, โปรโมเตอร์ cytomegalovirus ใน pcDNA3 แสดงออกพลาสมิด โดยใช้ Cre recombinase เมื่อคัดลอกทำซ้ำคว่ำรูปแบบ GFP dsRNA พร้อมห่วงกิ๊บ (B) P19 เซลล์เสถียรแสดงความกิ๊บพลาสมิด GFP, GFPhp.1 (โคลนที่ 10) และ GFPhp.2 (โคลน 12) พร้อมกับน้ำหนัก P19 ถูก transfected กับ 0.25? G แต่ละ GFP และยีนนักข่าว RFP ไมโครเรืองแสงถูกถ่ายโดยใช้ lters Fi ที่เหมาะสมสำหรับ GFP และ RFP Magni Fi ไอออนบวกคือ 200?. (C) เซลล์ P19 GFPhp.1 ถูก transfected กับ pEGFP และ 0, 0.5, หรือ 1? แสดงเซลล์ Magni Fi ไอออนบวก 100?. (D) ในหลอดทดลองและในการประมวลผลของร่างกาย dsRNA ในเซลล์ P19 ในการตรวจ Dicer หลอดทดลองได้ดำเนินการต่อเซลล์ S2 และสาม independentlypreparedP19extractsbyusing 32P-labeleddsRNA (30 ° Cfor30min) .ANorthernblotofRNAextractedfromcontrolandGFPhp.1P19cellsshows การผลิต? ชนิด 22mer RNA ในเซลล์กิ๊บ-แสดง แต่ไม่ได้อยู่ในการควบคุมเซลล์ บลถูกตรวจสอบด้วย 32P ป้​​าย '' ความรู้สึก '' GFP หลักฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแสดงออกของยีนผลิตกิ๊บ p19 EC เซลล์ที่เสถียรเงียบ GFP . ( ) เป็นการ์ตูนของพลิกเทปใช้ในการสร้าง GFP กิ๊บติดผม GFP แสดงจึงตัดสินใจเดินทาง 500 นะครับ ฐานคู่ egfp . ซีโอ zeocin , ต้านทานยีน ; L , ปลาแซลมอนรมควัน ; p , โปรโมเตอร์ใหม่ในการแสดงออก ใน pcdna3 . homologousgfpfragmentsare จึง rstclonedasdirectrepeatsintotheflipcassette . tocreateinvertedrepeatsforhairpinproduction thesecondrepeatis fl , ipped โดยใช้ครีม recombinase . เมื่อคัดลอก กลับทำซ้ำรูปแบบ GFP dsRNA มีกิ๊บ ลูป ( ข ) p19 เซลล์เสถียรแสดง GFP กิ๊บพลาสมิด gfphp , 1 ( ที่ 10 ) และ gfphp 2 ( โคลน 12 ) พร้อมกับมีน้ำหนัก p19 transfected 0.25 กรัมแต่ละและนักข่าว GFP RFP ยีน การ micrographs ถ่ายโดยใช้จึงเหมาะสมและ lters GFP RFP . มกนีจึงบวก 200 . ( C ) p19 gfphp 1 เซลล์มี transfected กับ pegfp และ 0 , 0.5 , 1 gofdiceror จึงเป็นfl ydsrna . fluorescencemicrographsweretakenat48hposttransfectionandaresuperimposedwithbright จึง eldimagestorevealnon GFP แสดงเซลล์ มกนีจึงการเป็น 100 ( D ) ในหลอดทดลองและในสัตว์ทดลองแปรรูป dsRNA ใน p19 เซลล์ ในการพบพระจริยวัตรจำนวน S2 เซลล์และสาม independentlypreparedp19extractsbyusing 32p labeleddsrna ( 30 องศา cfor30min ) anorthernblotofrnaextractedfromcontrolandgfphp.1p19cellsshows การผลิตชนิด RNA ในเซลล์ แต่ไม่ 22mer กิ๊บการแสดงออกในเซลล์คุม ไม้ถูกตรวจสอบด้วย 32p ข้อความ " " " "sense GFP .