An Amplisenq multigene custom panel

An Amplisenq multigene custom panel was designed to explore all exons of APC (n=16; NM_001128425.1), MLHI (n=17; NM_000249.3), MSH2 (n=16; NM_000251.2), and MSH6 (n=10; NM_000179.2) genes. The details of the target regions as produced by the AmpliSeq designer v2.2.1 are in Additional file 1: Table S1. Thirty nanograms of DNA were used for multiplex PCR amplification,followed by ligation of a specific barcode-sequence to each sample for identification. Emulsion PCR to construct the libraries of clonal sequences was performed with the Ion OneTouch OT2 System (Life Technologies). The quality of the obtained libraries was evaluated by the Agilent 2100 Bioanalyzer on-chip electrophoresis (Agilent Technologies) as previously described [16]. Sequencing of the libraries was performed on personal Genome Machine (PGM, Life Technologies) using the Ion 318 Chip Kit v2. Four samples were processed in each emulsion PCR and sequencing. Data analysis, including alignment to the hg19 human reference genome and veriant calling, was done using the Torrent Suite Software v3.6 (Life Technologies). Filtered veriants were annotated using the SnpEff softwere v3.1. Alignments were visually verified with the Integrative Genomics Viewer (IGV) v.2.2 (Broad Institute). Analysis of blind regions (where automated veriant calling is hindered by sequencing errors due to homopolymers or amplification artifacts) was executed as follows: the COSMIC data-base of SNPs and small INDELs was converted to a Hotspots file and used to guide variant calling. In this way, the variant caller is forced to analyze a given hotspot co-ordinate; if there is no mutation, the software outputs that the position is "reference"; otherwise it outputs the mutation detected. If there are problems in the sequence at that position, the software outputs a "no call" value, explaining why variant calling failed (strand bias, quality of bases,noise in the sequence, low coverage). All the positions where a clear variant/reference status could not be called were further inspected by visual verification of the alignment file to ascertain whether the "no call" tatus was due to artifacts or homopolymer misalignment.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มีแผงเอง multigene Amplisenq ถูกออกแบบมาเพื่อสำรวจ exons ทั้งหมดของเอพีซี (n = 16 NM_001128425.1), MLHI (n = 17 NM_000249.3), MSH2 (n = 16 NM_000251.2), และ MSH6 (n = 10 ยีน NM_000179.2) มีรายละเอียดของพื้นที่เป้าหมายที่ผลิต โดย v2.2.1 ออก AmpliSeq ในแฟ้มเพิ่มเติม 1: S1 ตาราง Nanograms สามสิบของดีเอ็นเอที่ใช้สำหรับขยาย PCR multiplex ตาม ด้วยไข่ของบาร์โค้ดลำดับเฉพาะแต่ละอย่างสำหรับรหัส อิมัลชัน PCR เพื่อสร้างไลบรารีของ clonal ลำดับที่ดำเนินการกับระบบ OneTouch OT2 ไอออน (ชีวิตเทคโนโลยี) คุณภาพของไลบรารีได้รับถูกประเมิน โดยการ electrophoresis ในชิป Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent เทคโนโลยี) อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [16] ทำการจัดลำดับของรีเครื่องส่วนบุคคลจีโนม (PGM เทคโนโลยีชีวิต) ใช้ v2 ชุดชิป 318 ไอออน ตัวอย่างที่ 4 ถูกประมวลผลในอิมัลชัน PCR และจัดลำดับ วิเคราะห์ข้อมูล รวมถึงการจัดกลุ่มบุคคลอ้างอิง hg19 และ veriant โทรศัพท์ ใช้เล่น Torrent ทซอ (ชีวิตเทคโนโลยี) Veriants กรองได้ใส่คำอธิบายประกอบได้ใช้ SnpEff softwere v3.1 จัดแนวเห็นได้ถูกตรวจสอบกับ v.2.2 แบบบูรณาการ Genomics Viewer (IGV) (กว้าง สถาบัน) การวิเคราะห์พื้นที่ตาบอด (ที่โทรศัพท์อัตโนมัติ veriant เป็นผู้ที่ขัดขวาง โดยลำดับข้อผิดพลาดเนื่องจากสิ่งประดิษฐ์ homopolymers หรือขยาย) มีดำเนินการดังนี้: จักรวาลฐานข้อมูล SNPs และ INDELs เล็กถูกแปลงไปยังแฟ้มฮอตสปอ และใช้คู่มือโทรศัพท์ตัวแปร ด้วยวิธีนี้ เรียกตัวแปรถูกบังคับเพื่อวิเคราะห์การกำหนดจุดประสาน ถ้าไม่มีการกลายพันธุ์ ซอฟต์แวร์แสดงผลว่าตำแหน่ง "อ้างอิง" มิฉะนั้น มันแสดงผลการกลายพันธุ์ที่พบ ถ้ามีปัญหาในลำดับ ซอฟต์แวร์แสดงผลค่า "ไม่เรียก" อธิบายทำไมแปรโทรศัพท์ล้มเหลว (ความโน้มเอียงของสแตรนด์ คุณภาพของฐาน เสียงในลำดับ ความครอบคลุมต่ำสุด) ตำแหน่งงานทั้งหมดที่สถานะตัวแปร/การอ้างอิงที่ชัดเจนอาจไม่สามารถเรียกได้ตรวจสอบเพิ่มเติม โดยการตรวจสอบแฟ้มตำแหน่งเพื่อตรวจว่า tatus "ไม่เรียก" เกิดสิ่งประดิษฐ์หรือนาน ๆ homopolymer ภาพ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Amplisenq multigene แผงที่กำหนดเองได้รับการออกแบบเพื่อสำรวจ exons ของ APC ทั้งหมด (n = 16; NM_001128425.1) MLHI (n = 17; NM_000249.3) MSH2 (n = 16; NM_000251.2) และ MSH6 (n = 10; NM_000179.2) ยีน รายละเอียดของการภูมิภาคเป้าหมายเป็นที่ผลิตโดยนักออกแบบ AmpliSeq v2.2.1 ที่อยู่ในแฟ้มเพิ่มเติม 1: S1 ตาราง สามสิบนาโนดีเอ็นเอถูกนำมาใช้ในการขยาย PCR multiplex ตามด้วย ligation ลำดับบาร์โค้ดเฉพาะตัวอย่างสำหรับประชาชนในแต่ละ อิมัลชั่ PCR ในการสร้างห้องสมุดของลำดับ clonal ได้ดำเนินการกับระบบไอออน OneTouch OT2 (เทคโนโลยีชีวิต) คุณภาพของห้องสมุดที่ได้รับที่ได้รับการประเมินโดย Agilent 2100 Bioanalyzer electrophoresis บนชิป (Agilent Technologies) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [16] ลำดับของห้องสมุดได้ดำเนินการเกี่ยวกับเครื่องจีโนมส่วนบุคคล (PGM ชีวิตเทคโนโลยี) โดยใช้ไอออน 318 ชิปชุด v2 สี่ตัวอย่างที่ถูกประมวลผลในแต่ละ PCR อิมัลชันและลำดับ การวิเคราะห์ข้อมูลรวมทั้งการจัดตำแหน่งกับจีโนมมนุษย์อ้างอิง hg19 และโทร veriant ถูกทำได้โดยใช้ชุดซอฟต์แวร์ Torrent v3.6 (เทคโนโลยีชีวิต) veriants กรองถูกข้อเขียนใช้ SnpEff Softwere v3.1 การจัดแนวการตรวจสอบความถูกสายตาเชิงบูรณาการกับฟังก์ชั่นแสดง (IGV) v.2.2 (กว้างสถาบัน) การวิเคราะห์ภูมิภาคตาบอด (ที่โทร veriant อัตโนมัติขัดขวางโดยข้อผิดพลาดลำดับเนื่องจากการโฮโมหรือสิ่งประดิษฐ์ขยาย) กำลังดำเนินการดังนี้ COSMIC ข้อมูลฐานของ SNPs และ INDELs ขนาดเล็กถูกดัดแปลงเป็นไฟล์ฮอตสปอตและใช้เพื่อเป็นแนวทางในการเรียกที่แตกต่างกัน ด้วยวิธีนี้โทรตัวแปรที่ถูกบังคับให้ต้องวิเคราะห์ฮอตสปอตได้รับการประสานงาน; ถ้ามีการกลายพันธุ์ไม่มีผลซอฟต์แวร์ที่ตำแหน่งคือ "อ้างอิง"; มิฉะนั้นผลการกลายพันธุ์ที่ตรวจพบ หากมีปัญหาในลำดับที่ตำแหน่งที่มีซอฟแวร์จะแสดง "ไม่เรียกว่า" ค่าอธิบายว่าทำไมโทรตัวแปรที่ล้มเหลว (อคติสาระที่มีคุณภาพของฐานเสียงในลำดับความคุ้มครองต่ำ) ทุกตำแหน่งที่แตกต่างที่ชัดเจน / สถานะการอ้างอิงไม่สามารถเรียกว่าได้รับการตรวจสอบต่อไปโดยการตรวจสอบภาพของไฟล์การจัดตำแหน่งเพื่อยืนยันว่า "ไม่เรียกว่า" tatus เป็นเพราะสิ่งประดิษฐ์หรือแนว homopolymer

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ amplisenq multigene แผงเองถูกออกแบบมาเพื่อสำรวจทั้งหมดที่มีของ APC ( n = 16 ; nm_001128425.1 ) mlhi ( n = 17 ; nm_000249.3 ) msh2 ( n = 16 ; nm_000251.2 ) และ msh6 ( n = 10 ; nm_000179.2 ) ยีน รายละเอียดของเป้าหมายในภูมิภาคเป็นที่ผลิตโดย ampliseq ออกแบบ v2.2.1 อยู่ในแฟ้มเพิ่มเติม 1 : ตาราง S1 . 30 นาโนกรัมของดีเอ็นเอถูกใช้เพื่อขยาย multiplex PCR ,ตามด้วย Ligation ของลำดับบาร์โค้ดเฉพาะแต่ละตัวอย่างสําหรับประชาชน โดยวิธี PCR เพื่อสร้างห้องสมุดของรูปแบบลำดับแสดงกับไอออนวันทัช ot2 ระบบเทคโนโลยีกับชีวิต ) คุณภาพของที่ได้ห้องสมุดที่ประเมินโดย Agilent 2100 bioanalyzer บน electrophoresis ( ด้านเทคโนโลยี ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 16 ]ลำดับของห้องสมุดคือใช้เครื่องจีโนมส่วนบุคคล ( เทคโนโลยีชีวิต PGM ) โดยใช้ไอออน 318 ชิปชุด V2 . สี่คนถูกประมวลผลในแต่ละชนิดและเทคนิคของ การวิเคราะห์ข้อมูลรวมทั้งสอดคล้องกับ hg19 มนุษย์อ้างอิงจีโนมและ veriant โทรโดยใช้ชุดซอฟต์แวร์ torrent v3.6 ( เทคโนโลยีกับชีวิต )กรอง veriants ได้แสดงความพร้อมใช้ snpeff v3.1 . การได้มองเห็นความถูกต้องกับผู้ชมในแบบบูรณาการ ( igv ) v.2.2 ( สถาบันกว้าง ) การวิเคราะห์พื้นที่บอด ( ที่เรียกจะถูกขัดขวางโดยอัตโนมัติ veriant ลำดับข้อผิดพลาดเนื่องจากโฮโมพอลิเมอร์หรือขยายวัตถุ ) ดำเนินการดังนี้ในจักรวาลของฐานข้อมูล snps indels ขนาดเล็กและถูกแปลงเป็นไฟล์จุดและใช้นำทางโดยเรียก ในวิธีนี้ โทรตัวแปรคือบังคับให้วิเคราะห์ให้ฮอตสปอตประสานงาน ถ้าไม่มีการกลายพันธุ์ ซอฟต์แวร์ส่งออกที่ตำแหน่งเป็น " อ้างอิง " ; มิฉะนั้นผลการกลายพันธุ์ที่ตรวจพบ หากมีปัญหาในลำดับที่ตำแหน่งนั้นซอฟต์แวร์ผล " ไม่เรียก " ค่า อธิบายถึงตัวแปรเรียกล้มเหลว ( สาระคติ คุณภาพของฐานเสียงในลำดับ ความคุ้มครองต่ำ ) ทุกตำแหน่งที่สถานะตัวแปรอ้างอิงที่ชัดเจนไม่สามารถเรียกถูกตรวจสอบต่อไปโดยการตรวจสอบภาพจากไฟล์แนววินิจฉัยว่า " ไม่เรียก " ตาตัส เนื่องจาก สิ่งประดิษฐ์ หรือโฮโมพอลิเมอร์
การบิด