- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Engraftment of gene-modified umbili
Engraftment of gene-modified umbilical cord blood cells in
neonates with adenosine deaminase deficiency
Donald B. Kohn1, Kenneth I. Weinberg1, Jan A. Nolta1, Linda N. Heiss1, Carl Lenarsky1,
Gay M. Crooks1, Mary E. Hanley1, Geralyn Annett1, Judith S. Brooks1, Anthony El-
Khoureiy1, Kim Lawrence1, Susie Wells1, Robert C. Moen2, John Bastian3, Debora E.
Williams-Herman4, Melissa Elder4, Diane Wara4, Thomas Bowen5, Michael S. Hershfield6,
Craig A. Mullen7, R. Michael Blaese7, and Robertson Parkman1
1Division of Research Immunology/Bone Marrow Transplantation, Childrens Hospital, Los
Angeles, University of Southern California School of Medicine, 4650 Sunset Boulevard, Los
Angeles, California 90027, USA
2Genetic Therapy, Inc., 938 Clopper Road, Gaithersburg, Maryland 20878, USA
3Children's Hospital and Health Center, San Diego, California 92123, USA
4Department of Pediatrics, University of California at San Francisco, San Francisco, California
94143, USA
51842 Oak Bay, Victoria, BC, Canada, V8R 1C2
6Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA
7National Center for Human Genome Research, National Institutes of Health, Building 49, Room
2A03, 4900 Convent Drive, Bethesda, Maryland 20892-4430, USA
Abstract
Haematopoietic stem cells in umbilical cord blood are an attractive target for gene therapy of
inborn errors of metabolism. Three neonates with severe combined immunodeficiency were
treated by retroviral-mediated transduction of the CD34+ cells from their umbilical cord blood
with a normal human adenosine deaminase complementary DNA followed by autologous
transplantation. The continued presence and expression of the introduced gene in leukocytes from
bone marrow and peripheral blood for 18 months demonstrates that umbilical cord blood cells
may be genetically modified with retroviral vectors and engrafted in neonates for gene therapy.
Inherited deficiency of adenosine deaminase (ADA) is the cause of approximately onequarter
of the cases of severe combined immunodeficiency (SCID)1,2. Based on the
successful treatment of ADA-deficient SCID by allogeneic bone marrow transplantation and
the cloning of the normal human ADA complementary DNA, ADA-deficiency has been a
major target for gene therapy3,4. Theoretically, genetically corrected autologous Tlymphoid
precursors should have a selective survival advantage over non-corrected ADAdeficient
cells. A broad level of expression by an inserted ADA gene (from one-tenth to
above normal) should be beneficial without adverse consequences, although there is no
specific information about consequences of vast overexpression of ADA in cells of all
haematopoietic lineages. Thus, even with the currently modest capabilities to efficiently
© 1995 Nature Publishing Group
Correspondence should be addressed to D.B.K. C.A.M. present address: Department of Experimental Pediatrics, Univeristy of Texas
M.D. Anderson Cancer Center, Box 88, Room AC6.004, 1515 Holcombe Boulevard, Houston, Texas, 77030, USA.
NIH Public Access
Author Manuscript
Nat Med. Author manuscript; available in PMC 2011 January 3.
Published in final edited form as:
Nat Med. 1995 October ; 1(10): 1017–1023.
NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript
transfer genes into primary haematopoietic cells and an inability to control gene expression
in a precise manner, ADA-deficient SCID may respond to gene therapy.
The first clinical trial of gene therapy involved two young girls with ADA deficiency, using
their peripheral blood T lymphocytes as the target for ADA gene transfer5,6. Multiple
courses of leukopheresis, transduction and re-infusion of T lymphocytes led to increased
numbers of T lymphocytes and improved T-Iymphocyte function, with attainment in one of
the two patients of circulating leukocyte ADA levels equivalent to a quarter of those in
normal individuals. Despite these encouraging results with mature T lymphocytes, the
genetic correction of haematopoietic stem cells may create a more long-lasting source of
ADA-expressing T lymphocytes. Information gained from the treatment of ADA deficiency
would be applicable to the use of haematopoietic stem cells for gene therapy for other
aetiologic forms of SCID and to other genetic diseases affecting haematopoietic and
lymphoid cells.
In the spring of 1993, three women who were known to be heterozygous for ADA
deficiency were identified to be carrying ADA-deficient fetuses. After independent genetic
counseling, each family elected to carry its respective pregnancy to term. Because of the
prenatal diagnosis, the unique opportunity was afforded to attempt gene therapy for the
neonates using their umbilical cord blood as a source of haematopoietic stem cells.
Extensive information has been accumulated to indicate that umbilical cord blood contains
haematopoietic stem cells; more than forty patients have had successful haematopoietic
reconstitution by the transplantation of allogeneic cord blood leukocytes following
cytoablative conditioning7,8.
Approval to perform gene transfer into the neonates’ umbilical cord blood followed by the
transplantation of the cells was obtained from the Institutional Review Boards, the
Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) of the National Institutes of Health, and the
Food and Drug Administration. The parents of each child gave informed consent for the
collection, transduction and re-infusion of the umbilical cord blood CD34+ cells. After term
delivery of each neonate, umbilical cord blood was collected and processed to isolate the
CD34+ population. The CD34+ cells were transduced with the retroviral vector LASN (ref.
9), which carried a normal human ADA cDNA, and returned to their respective donors by
intravenous infusion on their fourth day of life. Subsequently, we determined the
effectiveness of gene transduction and whether the engraftment of the umbilical cord blood
stem cells had occurred. We report here the results of the first use of umbilical cord blood
cells for clinical gene therapy.
Clinical course
At birth the prenatal diagnosis of ADA-deficiency was confirmed. Fluorescence-activated
cell sorting (FACS) analysis of umbilical cord blood samples demonstrated that the patients
had reduced numbers of T lymphocytes (1.5–2%) compared with those in normal umbilical
cord blood (56.6% ± 12.5). Their levels of serum deoxyadenosine metabolites (dAXP) were
elevated. Following the institution of enzyme replacement therapy with polyethylene glycol
(PEG) combined with ADA on days 1–4 of life (30 U kg-1 twice weekly by intramuscular
injection), there was correction of the metabolic abnormalities, with dAXP levels in
erythrocytes decreasing from 160–302 nmol ml-1 (cord blood red blood cells (RBCs)) to
neonates with adenosine deaminase deficiency
Donald B. Kohn1, Kenneth I. Weinberg1, Jan A. Nolta1, Linda N. Heiss1, Carl Lenarsky1,
Gay M. Crooks1, Mary E. Hanley1, Geralyn Annett1, Judith S. Brooks1, Anthony El-
Khoureiy1, Kim Lawrence1, Susie Wells1, Robert C. Moen2, John Bastian3, Debora E.
Williams-Herman4, Melissa Elder4, Diane Wara4, Thomas Bowen5, Michael S. Hershfield6,
Craig A. Mullen7, R. Michael Blaese7, and Robertson Parkman1
1Division of Research Immunology/Bone Marrow Transplantation, Childrens Hospital, Los
Angeles, University of Southern California School of Medicine, 4650 Sunset Boulevard, Los
Angeles, California 90027, USA
2Genetic Therapy, Inc., 938 Clopper Road, Gaithersburg, Maryland 20878, USA
3Children's Hospital and Health Center, San Diego, California 92123, USA
4Department of Pediatrics, University of California at San Francisco, San Francisco, California
94143, USA
51842 Oak Bay, Victoria, BC, Canada, V8R 1C2
6Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA
7National Center for Human Genome Research, National Institutes of Health, Building 49, Room
2A03, 4900 Convent Drive, Bethesda, Maryland 20892-4430, USA
Abstract
Haematopoietic stem cells in umbilical cord blood are an attractive target for gene therapy of
inborn errors of metabolism. Three neonates with severe combined immunodeficiency were
treated by retroviral-mediated transduction of the CD34+ cells from their umbilical cord blood
with a normal human adenosine deaminase complementary DNA followed by autologous
transplantation. The continued presence and expression of the introduced gene in leukocytes from
bone marrow and peripheral blood for 18 months demonstrates that umbilical cord blood cells
may be genetically modified with retroviral vectors and engrafted in neonates for gene therapy.
Inherited deficiency of adenosine deaminase (ADA) is the cause of approximately onequarter
of the cases of severe combined immunodeficiency (SCID)1,2. Based on the
successful treatment of ADA-deficient SCID by allogeneic bone marrow transplantation and
the cloning of the normal human ADA complementary DNA, ADA-deficiency has been a
major target for gene therapy3,4. Theoretically, genetically corrected autologous Tlymphoid
precursors should have a selective survival advantage over non-corrected ADAdeficient
cells. A broad level of expression by an inserted ADA gene (from one-tenth to
above normal) should be beneficial without adverse consequences, although there is no
specific information about consequences of vast overexpression of ADA in cells of all
haematopoietic lineages. Thus, even with the currently modest capabilities to efficiently
© 1995 Nature Publishing Group
Correspondence should be addressed to D.B.K. C.A.M. present address: Department of Experimental Pediatrics, Univeristy of Texas
M.D. Anderson Cancer Center, Box 88, Room AC6.004, 1515 Holcombe Boulevard, Houston, Texas, 77030, USA.
NIH Public Access
Author Manuscript
Nat Med. Author manuscript; available in PMC 2011 January 3.
Published in final edited form as:
Nat Med. 1995 October ; 1(10): 1017–1023.
NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript
transfer genes into primary haematopoietic cells and an inability to control gene expression
in a precise manner, ADA-deficient SCID may respond to gene therapy.
The first clinical trial of gene therapy involved two young girls with ADA deficiency, using
their peripheral blood T lymphocytes as the target for ADA gene transfer5,6. Multiple
courses of leukopheresis, transduction and re-infusion of T lymphocytes led to increased
numbers of T lymphocytes and improved T-Iymphocyte function, with attainment in one of
the two patients of circulating leukocyte ADA levels equivalent to a quarter of those in
normal individuals. Despite these encouraging results with mature T lymphocytes, the
genetic correction of haematopoietic stem cells may create a more long-lasting source of
ADA-expressing T lymphocytes. Information gained from the treatment of ADA deficiency
would be applicable to the use of haematopoietic stem cells for gene therapy for other
aetiologic forms of SCID and to other genetic diseases affecting haematopoietic and
lymphoid cells.
In the spring of 1993, three women who were known to be heterozygous for ADA
deficiency were identified to be carrying ADA-deficient fetuses. After independent genetic
counseling, each family elected to carry its respective pregnancy to term. Because of the
prenatal diagnosis, the unique opportunity was afforded to attempt gene therapy for the
neonates using their umbilical cord blood as a source of haematopoietic stem cells.
Extensive information has been accumulated to indicate that umbilical cord blood contains
haematopoietic stem cells; more than forty patients have had successful haematopoietic
reconstitution by the transplantation of allogeneic cord blood leukocytes following
cytoablative conditioning7,8.
Approval to perform gene transfer into the neonates’ umbilical cord blood followed by the
transplantation of the cells was obtained from the Institutional Review Boards, the
Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) of the National Institutes of Health, and the
Food and Drug Administration. The parents of each child gave informed consent for the
collection, transduction and re-infusion of the umbilical cord blood CD34+ cells. After term
delivery of each neonate, umbilical cord blood was collected and processed to isolate the
CD34+ population. The CD34+ cells were transduced with the retroviral vector LASN (ref.
9), which carried a normal human ADA cDNA, and returned to their respective donors by
intravenous infusion on their fourth day of life. Subsequently, we determined the
effectiveness of gene transduction and whether the engraftment of the umbilical cord blood
stem cells had occurred. We report here the results of the first use of umbilical cord blood
cells for clinical gene therapy.
Clinical course
At birth the prenatal diagnosis of ADA-deficiency was confirmed. Fluorescence-activated
cell sorting (FACS) analysis of umbilical cord blood samples demonstrated that the patients
had reduced numbers of T lymphocytes (1.5–2%) compared with those in normal umbilical
cord blood (56.6% ± 12.5). Their levels of serum deoxyadenosine metabolites (dAXP) were
elevated. Following the institution of enzyme replacement therapy with polyethylene glycol
(PEG) combined with ADA on days 1–4 of life (30 U kg-1 twice weekly by intramuscular
injection), there was correction of the metabolic abnormalities, with dAXP levels in
erythrocytes decreasing from 160–302 nmol ml-1 (cord blood red blood cells (RBCs)) to
0/5000
Engraftment of gene-modified umbilical cord blood cells in
neonates with adenosine deaminase deficiency
Donald B. Kohn1, Kenneth I. Weinberg1, Jan A. Nolta1, Linda N. Heiss1, Carl Lenarsky1,
Gay M. Crooks1, Mary E. Hanley1, Geralyn Annett1, Judith S. Brooks1, Anthony El-
Khoureiy1, Kim Lawrence1, Susie Wells1, Robert C. Moen2, John Bastian3, Debora E.
Williams-Herman4, Melissa Elder4, Diane Wara4, Thomas Bowen5, Michael S. Hershfield6,
Craig A. Mullen7, R. Michael Blaese7, and Robertson Parkman1
1Division of Research Immunology/Bone Marrow Transplantation, Childrens Hospital, Los
Angeles, University of Southern California School of Medicine, 4650 Sunset Boulevard, Los
Angeles, California 90027, USA
2Genetic Therapy, Inc., 938 Clopper Road, Gaithersburg, Maryland 20878, USA
3Children's Hospital and Health Center, San Diego, California 92123, USA
4Department of Pediatrics, University of California at San Francisco, San Francisco, California
94143, USA
51842 Oak Bay, Victoria, BC, Canada, V8R 1C2
6Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA
7National Center for Human Genome Research, National Institutes of Health, Building 49, Room
2A03, 4900 Convent Drive, Bethesda, Maryland 20892-4430, USA
Abstract
Haematopoietic stem cells in umbilical cord blood are an attractive target for gene therapy of
inborn errors of metabolism. Three neonates with severe combined immunodeficiency were
treated by retroviral-mediated transduction of the CD34+ cells from their umbilical cord blood
with a normal human adenosine deaminase complementary DNA followed by autologous
transplantation. The continued presence and expression of the introduced gene in leukocytes from
bone marrow and peripheral blood for 18 months demonstrates that umbilical cord blood cells
may be genetically modified with retroviral vectors and engrafted in neonates for gene therapy.
Inherited deficiency of adenosine deaminase (ADA) is the cause of approximately onequarter
of the cases of severe combined immunodeficiency (SCID)1,2. Based on the
successful treatment of ADA-deficient SCID by allogeneic bone marrow transplantation and
the cloning of the normal human ADA complementary DNA, ADA-deficiency has been a
major target for gene therapy3,4. Theoretically, genetically corrected autologous Tlymphoid
precursors should have a selective survival advantage over non-corrected ADAdeficient
cells. A broad level of expression by an inserted ADA gene (from one-tenth to
above normal) should be beneficial without adverse consequences, although there is no
specific information about consequences of vast overexpression of ADA in cells of all
haematopoietic lineages. Thus, even with the currently modest capabilities to efficiently
© 1995 Nature Publishing Group
Correspondence should be addressed to D.B.K. C.A.M. present address: Department of Experimental Pediatrics, Univeristy of Texas
M.D. Anderson Cancer Center, Box 88, Room AC6.004, 1515 Holcombe Boulevard, Houston, Texas, 77030, USA.
NIH Public Access
Author Manuscript
Nat Med. Author manuscript; available in PMC 2011 January 3.
Published in final edited form as:
Nat Med. 1995 October ; 1(10): 1017–1023.
NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript
transfer genes into primary haematopoietic cells and an inability to control gene expression
in a precise manner, ADA-deficient SCID may respond to gene therapy.
The first clinical trial of gene therapy involved two young girls with ADA deficiency, using
their peripheral blood T lymphocytes as the target for ADA gene transfer5,6. Multiple
courses of leukopheresis, transduction and re-infusion of T lymphocytes led to increased
numbers of T lymphocytes and improved T-Iymphocyte function, with attainment in one of
the two patients of circulating leukocyte ADA levels equivalent to a quarter of those in
normal individuals. Despite these encouraging results with mature T lymphocytes, the
genetic correction of haematopoietic stem cells may create a more long-lasting source of
ADA-expressing T lymphocytes. Information gained from the treatment of ADA deficiency
would be applicable to the use of haematopoietic stem cells for gene therapy for other
aetiologic forms of SCID and to other genetic diseases affecting haematopoietic and
lymphoid cells.
In the spring of 1993, three women who were known to be heterozygous for ADA
deficiency were identified to be carrying ADA-deficient fetuses. After independent genetic
counseling, each family elected to carry its respective pregnancy to term. Because of the
prenatal diagnosis, the unique opportunity was afforded to attempt gene therapy for the
neonates using their umbilical cord blood as a source of haematopoietic stem cells.
Extensive information has been accumulated to indicate that umbilical cord blood contains
haematopoietic stem cells; more than forty patients have had successful haematopoietic
reconstitution by the transplantation of allogeneic cord blood leukocytes following
cytoablative conditioning7,8.
Approval to perform gene transfer into the neonates’ umbilical cord blood followed by the
transplantation of the cells was obtained from the Institutional Review Boards, the
Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) of the National Institutes of Health, and the
Food and Drug Administration. The parents of each child gave informed consent for the
collection, transduction and re-infusion of the umbilical cord blood CD34+ cells. After term
delivery of each neonate, umbilical cord blood was collected and processed to isolate the
CD34+ population. The CD34+ cells were transduced with the retroviral vector LASN (ref.
9), which carried a normal human ADA cDNA, and returned to their respective donors by
intravenous infusion on their fourth day of life. Subsequently, we determined the
effectiveness of gene transduction and whether the engraftment of the umbilical cord blood
stem cells had occurred. We report here the results of the first use of umbilical cord blood
cells for clinical gene therapy.
Clinical course
At birth the prenatal diagnosis of ADA-deficiency was confirmed. Fluorescence-activated
cell sorting (FACS) analysis of umbilical cord blood samples demonstrated that the patients
had reduced numbers of T lymphocytes (1.5–2%) compared with those in normal umbilical
cord blood (56.6% ± 12.5). Their levels of serum deoxyadenosine metabolites (dAXP) were
elevated. Following the institution of enzyme replacement therapy with polyethylene glycol
(PEG) combined with ADA on days 1–4 of life (30 U kg-1 twice weekly by intramuscular
injection), there was correction of the metabolic abnormalities, with dAXP levels in
erythrocytes decreasing from 160–302 nmol ml-1 (cord blood red blood cells (RBCs)) to <10
nmol ml-1 within 7–10 weeks. All three patients have remained in good health while
receiving PEG–ADA. Growth and development have been normal with no infectious
complications except for routine upper respiratory tract infections. Prophylaxis with oral
trimethoprim/sulphamethoxazole (TMP/SMX) and intravenous gamma globulin was given
Kohn et al. Page 2
Nat Med. Author manuscript; available in PMC 2011 January 3.
NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript
for the first six months to patient 1, patient 2 remains on TMP/SMX, and patient 3 continues
to receive both intravenous gamma globulin and TMP/SMX.
Gene transduction of umbilical cord blood CD34+ cells
Between 60 and 200 ml of umbilical cord blood was obtained from the three infants. FACS
analysis of the umbilical cord leukocytes demonstrated that between 0.7% and 0.9% of the
cells were positive for the stem cell/progenitor antigen, CD34. The cord blood samples were
mixed with biotinylated monoclonal antibody to CD34 and processed through an avidin
immunoaffinlty column. The resulting cell populations were between 32% and 62% CD34
positive, with yields between 24% and 89%.
The enriched CD34+ cells were transduced with three rounds of LASN retroviral vectorcontaining
supernatant in the presence of recombinant haematopoietic growth factors
(interleukin-3 (IL-3), IL-6 and stem cell factor) to enhance gene transfer. After three days of
culture, the total numbers of leukocytes increased by 1.3- to 2.4-fold. The LASN-transduced
umbilical cord blood cells were then infused intravenously into each patient on his fourth
day of life. No toxicities were noted during or after the infusions.
To assess the efficiency of retroviral-mediated transduction of clonogenic myeloid
progenitors contained within the cord blood cells before transplantation, samples were
plated in a colony-forming unit granulocyte-macrophage (CFU-GM) assay, with and without
the selective neomycin analogue, G418. The expression of the neo gene contained in the
LASN vector permits colonies derived from transduced progenitors to survive in G418.
From the three patients, 21.5%, 12.5% and 19.4% of the clonogenic progenitors were G418-
resistant.
Peripheral blood leukocytes
To determine whether the transduced CD34+ cells had engrafted and whether they
contributed to circulating leukocyte populations, we obtained serial peripheral blood
samples at monthly intervals after transplantation. The frequency of peripheral blood
mononuclear cells and granulocytes that contained vector DNA sequences was determined
by semiquantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis. PCR primers were designed
to specifically amplify only vector-derived sequences; one primer was complementary to
sequences of the Moloney murine leukaemia virus backbone of the vector and one was
complementary to the human ADA cDNA (Fig. 1a). The intensities of the signals from
leukocyte samples were compared with those of a standard curve to allow an estimation of
the frequency of circulating leukocytes containing the integrated LASN provirus sequ
neonates with adenosine deaminase deficiency
Donald B. Kohn1, Kenneth I. Weinberg1, Jan A. Nolta1, Linda N. Heiss1, Carl Lenarsky1,
Gay M. Crooks1, Mary E. Hanley1, Geralyn Annett1, Judith S. Brooks1, Anthony El-
Khoureiy1, Kim Lawrence1, Susie Wells1, Robert C. Moen2, John Bastian3, Debora E.
Williams-Herman4, Melissa Elder4, Diane Wara4, Thomas Bowen5, Michael S. Hershfield6,
Craig A. Mullen7, R. Michael Blaese7, and Robertson Parkman1
1Division of Research Immunology/Bone Marrow Transplantation, Childrens Hospital, Los
Angeles, University of Southern California School of Medicine, 4650 Sunset Boulevard, Los
Angeles, California 90027, USA
2Genetic Therapy, Inc., 938 Clopper Road, Gaithersburg, Maryland 20878, USA
3Children's Hospital and Health Center, San Diego, California 92123, USA
4Department of Pediatrics, University of California at San Francisco, San Francisco, California
94143, USA
51842 Oak Bay, Victoria, BC, Canada, V8R 1C2
6Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA
7National Center for Human Genome Research, National Institutes of Health, Building 49, Room
2A03, 4900 Convent Drive, Bethesda, Maryland 20892-4430, USA
Abstract
Haematopoietic stem cells in umbilical cord blood are an attractive target for gene therapy of
inborn errors of metabolism. Three neonates with severe combined immunodeficiency were
treated by retroviral-mediated transduction of the CD34+ cells from their umbilical cord blood
with a normal human adenosine deaminase complementary DNA followed by autologous
transplantation. The continued presence and expression of the introduced gene in leukocytes from
bone marrow and peripheral blood for 18 months demonstrates that umbilical cord blood cells
may be genetically modified with retroviral vectors and engrafted in neonates for gene therapy.
Inherited deficiency of adenosine deaminase (ADA) is the cause of approximately onequarter
of the cases of severe combined immunodeficiency (SCID)1,2. Based on the
successful treatment of ADA-deficient SCID by allogeneic bone marrow transplantation and
the cloning of the normal human ADA complementary DNA, ADA-deficiency has been a
major target for gene therapy3,4. Theoretically, genetically corrected autologous Tlymphoid
precursors should have a selective survival advantage over non-corrected ADAdeficient
cells. A broad level of expression by an inserted ADA gene (from one-tenth to
above normal) should be beneficial without adverse consequences, although there is no
specific information about consequences of vast overexpression of ADA in cells of all
haematopoietic lineages. Thus, even with the currently modest capabilities to efficiently
© 1995 Nature Publishing Group
Correspondence should be addressed to D.B.K. C.A.M. present address: Department of Experimental Pediatrics, Univeristy of Texas
M.D. Anderson Cancer Center, Box 88, Room AC6.004, 1515 Holcombe Boulevard, Houston, Texas, 77030, USA.
NIH Public Access
Author Manuscript
Nat Med. Author manuscript; available in PMC 2011 January 3.
Published in final edited form as:
Nat Med. 1995 October ; 1(10): 1017–1023.
NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript
transfer genes into primary haematopoietic cells and an inability to control gene expression
in a precise manner, ADA-deficient SCID may respond to gene therapy.
The first clinical trial of gene therapy involved two young girls with ADA deficiency, using
their peripheral blood T lymphocytes as the target for ADA gene transfer5,6. Multiple
courses of leukopheresis, transduction and re-infusion of T lymphocytes led to increased
numbers of T lymphocytes and improved T-Iymphocyte function, with attainment in one of
the two patients of circulating leukocyte ADA levels equivalent to a quarter of those in
normal individuals. Despite these encouraging results with mature T lymphocytes, the
genetic correction of haematopoietic stem cells may create a more long-lasting source of
ADA-expressing T lymphocytes. Information gained from the treatment of ADA deficiency
would be applicable to the use of haematopoietic stem cells for gene therapy for other
aetiologic forms of SCID and to other genetic diseases affecting haematopoietic and
lymphoid cells.
In the spring of 1993, three women who were known to be heterozygous for ADA
deficiency were identified to be carrying ADA-deficient fetuses. After independent genetic
counseling, each family elected to carry its respective pregnancy to term. Because of the
prenatal diagnosis, the unique opportunity was afforded to attempt gene therapy for the
neonates using their umbilical cord blood as a source of haematopoietic stem cells.
Extensive information has been accumulated to indicate that umbilical cord blood contains
haematopoietic stem cells; more than forty patients have had successful haematopoietic
reconstitution by the transplantation of allogeneic cord blood leukocytes following
cytoablative conditioning7,8.
Approval to perform gene transfer into the neonates’ umbilical cord blood followed by the
transplantation of the cells was obtained from the Institutional Review Boards, the
Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) of the National Institutes of Health, and the
Food and Drug Administration. The parents of each child gave informed consent for the
collection, transduction and re-infusion of the umbilical cord blood CD34+ cells. After term
delivery of each neonate, umbilical cord blood was collected and processed to isolate the
CD34+ population. The CD34+ cells were transduced with the retroviral vector LASN (ref.
9), which carried a normal human ADA cDNA, and returned to their respective donors by
intravenous infusion on their fourth day of life. Subsequently, we determined the
effectiveness of gene transduction and whether the engraftment of the umbilical cord blood
stem cells had occurred. We report here the results of the first use of umbilical cord blood
cells for clinical gene therapy.
Clinical course
At birth the prenatal diagnosis of ADA-deficiency was confirmed. Fluorescence-activated
cell sorting (FACS) analysis of umbilical cord blood samples demonstrated that the patients
had reduced numbers of T lymphocytes (1.5–2%) compared with those in normal umbilical
cord blood (56.6% ± 12.5). Their levels of serum deoxyadenosine metabolites (dAXP) were
elevated. Following the institution of enzyme replacement therapy with polyethylene glycol
(PEG) combined with ADA on days 1–4 of life (30 U kg-1 twice weekly by intramuscular
injection), there was correction of the metabolic abnormalities, with dAXP levels in
erythrocytes decreasing from 160–302 nmol ml-1 (cord blood red blood cells (RBCs)) to <10
nmol ml-1 within 7–10 weeks. All three patients have remained in good health while
receiving PEG–ADA. Growth and development have been normal with no infectious
complications except for routine upper respiratory tract infections. Prophylaxis with oral
trimethoprim/sulphamethoxazole (TMP/SMX) and intravenous gamma globulin was given
Kohn et al. Page 2
Nat Med. Author manuscript; available in PMC 2011 January 3.
NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript NIH-PA Author Manuscript
for the first six months to patient 1, patient 2 remains on TMP/SMX, and patient 3 continues
to receive both intravenous gamma globulin and TMP/SMX.
Gene transduction of umbilical cord blood CD34+ cells
Between 60 and 200 ml of umbilical cord blood was obtained from the three infants. FACS
analysis of the umbilical cord leukocytes demonstrated that between 0.7% and 0.9% of the
cells were positive for the stem cell/progenitor antigen, CD34. The cord blood samples were
mixed with biotinylated monoclonal antibody to CD34 and processed through an avidin
immunoaffinlty column. The resulting cell populations were between 32% and 62% CD34
positive, with yields between 24% and 89%.
The enriched CD34+ cells were transduced with three rounds of LASN retroviral vectorcontaining
supernatant in the presence of recombinant haematopoietic growth factors
(interleukin-3 (IL-3), IL-6 and stem cell factor) to enhance gene transfer. After three days of
culture, the total numbers of leukocytes increased by 1.3- to 2.4-fold. The LASN-transduced
umbilical cord blood cells were then infused intravenously into each patient on his fourth
day of life. No toxicities were noted during or after the infusions.
To assess the efficiency of retroviral-mediated transduction of clonogenic myeloid
progenitors contained within the cord blood cells before transplantation, samples were
plated in a colony-forming unit granulocyte-macrophage (CFU-GM) assay, with and without
the selective neomycin analogue, G418. The expression of the neo gene contained in the
LASN vector permits colonies derived from transduced progenitors to survive in G418.
From the three patients, 21.5%, 12.5% and 19.4% of the clonogenic progenitors were G418-
resistant.
Peripheral blood leukocytes
To determine whether the transduced CD34+ cells had engrafted and whether they
contributed to circulating leukocyte populations, we obtained serial peripheral blood
samples at monthly intervals after transplantation. The frequency of peripheral blood
mononuclear cells and granulocytes that contained vector DNA sequences was determined
by semiquantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis. PCR primers were designed
to specifically amplify only vector-derived sequences; one primer was complementary to
sequences of the Moloney murine leukaemia virus backbone of the vector and one was
complementary to the human ADA cDNA (Fig. 1a). The intensities of the signals from
leukocyte samples were compared with those of a standard curve to allow an estimation of
the frequency of circulating leukocytes containing the integrated LASN provirus sequ
การแปล กรุณารอสักครู่..
engraftment ยีนปรับปรุงสายสะดือเซลล์เลือดใน
ทารกแรกเกิดด้วย deaminase adenosine ขาด
โดนัลด์บี Kohn1 เคนเน ธ I. Weinberg1 แจ A. Nolta1 ลินดาเอ็น Heiss1 คาร์ล Lenarsky1,
เกย์ M. Crooks1, แมรี่อี Hanley1, Geralyn Annett1 จูดิ ธ เอ Brooks1, แอนโธนี El-
Khoureiy1 คิม Lawrence1 ซูซี่ Wells1, โรเบิร์ตซี Moen2 จอห์น Bastian3, Debora อี
วิลเลียมส์ Herman4 เมลิสสา Elder4 ไดแอน Wara4 โทมัส Bowen5, ไมเคิลเอ Hershfield6,
เครกเอ Mullen7 , อาร์ไมเคิล Blaese7 และโรเบิร์ต Parkman1
1Division วิจัยภูมิคุ้มกัน / ปลูกถ่ายไขกระดูก, โรงพยาบาลเด็ก, Los
Angeles, University of Southern California โรงเรียนแพทย์ 4650 Sunset Boulevard, Los
Angeles, California 90027, USA
2Genetic บำบัด, Inc, 938 Clopper ถนน Gaithersburg, แมรี่แลนด์ 20878, USA
โรงพยาบาล 3Children และศูนย์สุขภาพ, San Diego, California 92123, USA
4Department กุมารเวชศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนียที่ซานฟรานซิส, San Francisco, California
94143, USA
51842 Oak Bay, Victoria, BC, แคนาดา, V8R 1C2
6Department แพทยศาสตร์ดยุคศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยเดอร์แฮม, อร์ทแคโรไลนา 27710, USA
ศูนย์ 7National สำหรับจีโนมมนุษย์วิจัยสถาบันสุขภาพแห่งชาติอาคาร 49 ห้อง
2A03, 4900 คอนแวนต์ Drive, Bethesda, Maryland 20892-4430, USA
บทคัดย่อ
haematopoietic เซลล์ต้นกำเนิดในเลือดสายสะดือเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจสำหรับการรักษาด้วยยีนของ
ข้อผิดพลาดมา แต่กำเนิดของการเผาผลาญ สามทารกแรกเกิดด้วยโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องรวมอย่างรุนแรงได้รับ
การรักษาโดย transduction ไวรัสพึ่งของ CD34 + เซลล์จากเลือดจากสายสะดือของพวกเขา
ที่มี deaminase adenosine มนุษย์ปกติ DNA ประกอบตามด้วย autologous
ปลูก การแสดงตนอย่างต่อเนื่องและการแสดงออกของยีนที่นำมาใช้ในเม็ดเลือดขาวจาก
ไขกระดูกและเลือด 18 เดือนแสดงให้เห็นว่าเซลล์เลือดจากสายสะดือ
อาจถูกดัดแปลงพันธุกรรมที่มีพาหะไวรัสและทรงปลูกฝังในทารกแรกเกิดสำหรับการรักษาด้วยยีน.
สืบทอดขาด deaminase อะดีโนซีน (ADA) เป็น สาเหตุของการประมาณ onequarter
ของกรณีของโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องอย่างรุนแรงรวม (SCID) 1,2 บนพื้นฐานของ
การรักษาที่ประสบความสำเร็จของวทคร ADA ขาดโดยการปลูกถ่ายไขกระดูก allogeneic และ
โคลนปกติมนุษย์ ADA DNA ประกอบ, ADA ขาดได้รับ
เป้าหมายสำคัญสำหรับยีน therapy3,4 ในทางทฤษฎีการแก้ไขพันธุกรรม Tlymphoid autologous
สารตั้งต้นควรจะมีความได้เปรียบในการอยู่รอดที่เลือกข้างที่ไม่ได้รับการแก้ไข ADAdeficient
เซลล์ ระดับวงกว้างของการแสดงออกโดยการใส่ยีน ADA (จากหนึ่งในสิบที่จะ
สูงกว่าปกติ) ควรจะเป็นประโยชน์โดยไม่มีผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์แม้จะไม่มี
ข้อมูลที่เฉพาะเจาะจงเกี่ยวกับผลกระทบของการแสดงออกใหญ่ของ ADA ในเซลล์ของทุก
lineages haematopoietic ดังนั้นแม้จะมีความสามารถในการเจียมเนื้อเจียมตัวในขณะนี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
© 1995 ธรรมชาติของกลุ่มสำนักพิมพ์
จดหมายควรจะจ่าหน้าถึง DBKCAM อยู่ปัจจุบันกรมทดลองกุมารเวชศาสตร์มหาวิทยาลัยเท็กซัส
MD Anderson Cancer Center, กล่อง 88 ห้อง AC6.004, 1515 Holcombe Boulevard, ฮูสตัน, เท็กซัส, 77030, USA.
NIH สาธารณะเข้าถึง
ผู้เขียนต้นฉบับ
แน็ Med ที่เขียนด้วยลายมือผู้เขียน; ที่มีอยู่ใน PMC 3 มกราคม 2011.
ตีพิมพ์ในรูปแบบแก้ไขสุดท้ายเป็น:
ชัยนาท Med 1995 ตุลาคม 1 (10):. 1017-1023
NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ
ยีนโอนเข้าสู่เซลล์เม็ดเลือดหลักและไม่สามารถที่จะควบคุมการแสดงออกของยีน
ในลักษณะที่แม่นยำ SCID ADA ขาดอาจตอบสนองต่อยีน การรักษาด้วย.
ทดลองทางคลินิกครั้งแรกของการรักษาด้วยยีนที่เกี่ยวข้องกับเด็กสาวสองคนที่มีการขาด ADA ใช้
lymphocytes T เลือดของพวกเขาเป็นเป้าหมายของ ADA ยีน transfer5,6 หลาย
หลักสูตรของ leukopheresis, พลังงานและอีกครั้งแช่ของเซลล์เม็ดเลือดขาว T นำไปสู่การเพิ่ม
จำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาว T และปรับปรุงการทำงานของ T-Iymphocyte กับความสำเร็จในหนึ่งใน
สองผู้ป่วยหมุนเวียนระดับ ADA เม็ดโลหิตขาวเทียบเท่ากับหนึ่งในสี่ของผู้ที่อยู่ใน
บุคคลปกติ ถึงแม้ว่าจะมีผลกระตุ้นให้กับเซลล์เม็ดเลือดขาว T ผู้ใหญ่
การแก้ไขทางพันธุกรรมของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดอาจสร้างแหล่งเพิ่มเติมยาวนานของ
ADA-แสดง lymphocytes T ข้อมูลที่ได้จากการรักษาของการขาด ADA
จะใช้บังคับกับการใช้เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดสำหรับการรักษาด้วยยีนอื่น ๆ
รูปแบบ aetiologic ของวทครและโรคทางพันธุกรรมอื่น ๆ ที่มีผลต่อการสร้างเม็ดเลือดและ
เซลล์ต่อมน้ำเหลือง.
ในฤดูใบไม้ผลิของปี 1993, ผู้หญิงสามคนที่เป็นที่รู้จัก จะ heterozygous สำหรับ ADA
ขาดถูกระบุที่จะแบกทารก ADA ขาด หลังจากที่ทางพันธุกรรมที่เป็นอิสระ
ให้คำปรึกษาในครอบครัวแต่ละคนเลือกที่จะดำเนินการตั้งครรภ์ของแต่ละระยะ เพราะ
การวินิจฉัยก่อนคลอดโอกาสที่ถูกเจ้าตัวจะพยายามรักษาด้วยยีนสำหรับ
ทารกแรกเกิดโดยใช้เลือดจากสายสะดือของพวกเขาเป็นแหล่งที่มาของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด.
ข้อมูลที่กว้างขวางได้รับการสะสมเพื่อแสดงว่าเลือดสายสะดือมี
เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด; กว่าสี่สิบผู้ป่วยที่มีประสบความสำเร็จ haematopoietic
ปฏิสังขรณ์โดยการปลูกของเม็ดเลือดขาวในเลือดสาย allogeneic ต่อไปนี้
conditioning7,8 cytoablative.
ได้รับอนุมัติให้ดำเนินการถ่ายโอนยีนเข้าสู่กระแสเลือดสายสะดือทารกแรกเกิด 'ตามด้วย
การปลูกถ่ายเซลล์ที่ได้รับจากคณะกรรมการทบทวนสถาบัน
ดีเอ็นเอคณะกรรมการที่ปรึกษา (RAC) ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติและ
กรรมการอาหารและยา พ่อแม่ผู้ปกครองของเด็กแต่ละคนให้ความยินยอมในการ
เก็บพลังงานและอีกครั้งแช่ของสายสะดือเลือด CD34 + เซลล์ หลังจากระยะ
การส่งมอบของทารกแต่ละเลือดสายสะดือถูกเก็บรวบรวมและประมวลผลเพื่อแยก
ประชากร CD34 + เซลล์ + CD34 ถูก transduced กับไวรัสเวกเตอร์แลสเซน (Ref.
9) ซึ่งดำเนิน cDNA ADA มนุษย์ปกติและกลับไปยังผู้บริจาคของตนโดยการ
ฉีดเข้าเส้นเลือดดำในวันที่สี่ชีวิตของพวกเขา ต่อจากนั้นเรากำหนด
ประสิทธิภาพของพลังงานยีนและไม่ว่า engraftment ของสายสะดือเลือด
เซลล์ต้นกำเนิดที่เกิดขึ้น เรารายงานที่นี่ผลของการใช้งานครั้งแรกของสายสะดือเลือด
เซลล์ยีนบำบัดทางคลินิก.
แน่นอนทางคลินิก
ที่เกิดการวินิจฉัยก่อนคลอดของ ADA ขาดได้รับการยืนยัน เรืองแสงที่ทำงานโดยใช้
การจัดเรียงเซลล์ (FACS) การวิเคราะห์ตัวอย่างเลือดจากสายสะดือแสดงให้เห็นว่าผู้ป่วยที่
ได้ลดจำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาว T (1.5-2%) เมื่อเทียบกับผู้ที่อยู่ในสะดือปกติ
เลือดจากสายสะดือ (56.6% ± 12.5) ระดับของสารซีรั่ม deoxyadenosine (dAXP) ได้รับการ
ยกระดับ ต่อไปนี้สถาบันการศึกษาของการบำบัดทดแทนเอนไซม์ที่มีพลาสติกคอล
(PEG) รวมกับ ADA ในวันที่ 1-4 ของชีวิต (30 U kg-1 สัปดาห์ละสองครั้งโดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อ
ฉีด) มีการแก้ไขความผิดปกติของการเผาผลาญอาหารที่มีระดับ dAXP ใน
เม็ดเลือดแดงลดลง 160-302 นาโนโมมล-1 (สายเลือดเซลล์เม็ดเลือดแดง (เม็ดเลือดแดง)) เพื่อ <10
นาโนโมมล-1 ภายใน 7-10 สัปดาห์ ทั้งสามผู้ป่วยที่ยังคงอยู่ในการดูแลสุขภาพที่ดีในขณะ
ที่ได้รับ PEG-ADA การเจริญเติบโตและการพัฒนาได้รับปกติที่มีการติดเชื้อที่ไม่มี
ภาวะแทรกซ้อนยกเว้นสำหรับการติดเชื้อทางเดินหายใจส่วนบนกิจวัตรประจำวัน การป้องกันโรคในช่องปากที่มี
trimethoprim / sulphamethoxazole (TMP / SMX) และโกลบูลิแกมมาทางหลอดเลือดดำได้รับ
โคห์นและคณะ หน้า 2
แน็ Med ที่เขียนด้วยลายมือผู้เขียน; ที่มีอยู่ใน PMC วันที่ 3 มกราคม 2011.
NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ
สำหรับงวดหกเดือนแรกที่ผู้ป่วย 1, 2 ผู้ป่วยยังคงอยู่ใน TMP / SMX, 3 และผู้ป่วยยังคง
ที่จะได้รับทั้งโกลบูลิแกมมาทางหลอดเลือดดำและ TMP / SMX.
พลังงานยีนของสายสะดือเลือด CD34 + เซลล์
ระหว่าง 60 และ 200 มิลลิลิตรของเลือดจากสายสะดือที่ได้รับจากสามทารก มาซึ่ง
การวิเคราะห์เม็ดเลือดขาวสายสะดือแสดงให้เห็นว่าระหว่าง 0.7% และ 0.9% ของ
เซลล์ที่เป็นบวกสำหรับเซลล์ต้นกำเนิด / แอนติเจนชนก, CD34 ตัวอย่างเลือดจากสายสะดือถูก
ผสมกับแอนติบอดี biotinylated เพื่อ CD34 และประมวลผลผ่าน avidin
คอลัมน์ immunoaffinlty ประชากรเซลล์ที่เกิดระหว่าง 32% และ 62% CD34
บวกกับอัตราผลตอบแทนระหว่าง 24% และ 89%.
เซลล์อุดม CD34 + ถูก transduced กับสามรอบของแลสเซนไวรัส vectorcontaining
ใสในการปรากฏตัวของปัจจัยการเจริญเติบโต recombinant haematopoietic
(interleukin-3 ( IL-3), IL-6 และปัจจัยเซลล์ต้นกำเนิด) เพื่อเพิ่มศักยภาพในการถ่ายโอนยีน หลังจากสามวันของ
วัฒนธรรมตัวเลขรวมของเม็ดเลือดขาวเพิ่มขึ้น 1.3- ถึง 2.4 เท่า แลสเซน-transduced
สายสะดือเซลล์เม็ดเลือดจากนั้นได้รับการฉีดเข้าเส้นเลือดดำสีลงไปในผู้ป่วยแต่ละรายที่สี่ของเขา
วันของชีวิต พิษไม่ถูกตั้งข้อสังเกตในระหว่างหรือหลังจาก infusions.
เพื่อประเมินประสิทธิภาพของพลังงานไวรัสพึ่งของเม็ดเลือด clonogenic
บรรพบุรุษที่มีอยู่ภายในเซลล์เลือดจากสายก่อนที่จะปลูกตัวอย่างถูก
ชุบในหน่วยอาณานิคมขึ้นรูป granulocyte-macrophage (CFU-GM) ในการตรวจ ที่มีและไม่มี
อนาล็อก NEOMYCIN เลือก g418 การแสดงออกของยีนใหม่ที่มีอยู่ใน
เวกเตอร์แลสเซนอนุญาตให้อาณานิคมมาจากบรรพบุรุษ transduced จะอยู่รอดใน g418.
จากสามของผู้ป่วย, 21.5%, 12.5% และ 19.4% ของบรรพบุรุษ clonogenic เป็น G418-
ทน.
เม็ดเลือดขาวเลือด
เพื่อตรวจสอบว่า เซลล์ transduced CD34 + ได้ทรงปลูกฝังและไม่ว่าจะ
มีส่วนทำให้การไหลเวียนของประชากรเม็ดโลหิตขาว, เราได้รับเลือดอนุกรม
ตัวอย่างรายเดือนในช่วงเวลาหลังการปลูก ความถี่ของเลือด
โมโนนิวเคลียร์เซลล์และ granulocytes เวกเตอร์ที่มีลำดับดีเอ็นเอถูกกำหนด
โดยวิธี Polymerase chain reaction เชิงกึ่งปริมาณ (PCR) การวิเคราะห์ ไพรเมอร์พีซีอาร์ได้รับการออกแบบ
มาโดยเฉพาะเพื่อขยายลำดับเวกเตอร์ที่ได้รับมาเท่านั้น หนึ่งเป็นไพรเมอร์เสริมให้กับ
ลำดับของโมโลนีย์ไวรัสโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวหนูกระดูกสันหลังของเวกเตอร์และเป็นหนึ่ง
ประกอบกับยีน ADA ของมนุษย์ (รูป. 1a) ความเข้มของสัญญาณจาก
ตัวอย่างของเม็ดเลือดขาวที่ถูกเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานเพื่อให้การประมาณค่า
ความถี่ของการไหลเวียนของเม็ดเลือดขาวที่มีบูรณาการแลสเซน provirus ชุดเกียร์ SMG
ทารกแรกเกิดด้วย deaminase adenosine ขาด
โดนัลด์บี Kohn1 เคนเน ธ I. Weinberg1 แจ A. Nolta1 ลินดาเอ็น Heiss1 คาร์ล Lenarsky1,
เกย์ M. Crooks1, แมรี่อี Hanley1, Geralyn Annett1 จูดิ ธ เอ Brooks1, แอนโธนี El-
Khoureiy1 คิม Lawrence1 ซูซี่ Wells1, โรเบิร์ตซี Moen2 จอห์น Bastian3, Debora อี
วิลเลียมส์ Herman4 เมลิสสา Elder4 ไดแอน Wara4 โทมัส Bowen5, ไมเคิลเอ Hershfield6,
เครกเอ Mullen7 , อาร์ไมเคิล Blaese7 และโรเบิร์ต Parkman1
1Division วิจัยภูมิคุ้มกัน / ปลูกถ่ายไขกระดูก, โรงพยาบาลเด็ก, Los
Angeles, University of Southern California โรงเรียนแพทย์ 4650 Sunset Boulevard, Los
Angeles, California 90027, USA
2Genetic บำบัด, Inc, 938 Clopper ถนน Gaithersburg, แมรี่แลนด์ 20878, USA
โรงพยาบาล 3Children และศูนย์สุขภาพ, San Diego, California 92123, USA
4Department กุมารเวชศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนียที่ซานฟรานซิส, San Francisco, California
94143, USA
51842 Oak Bay, Victoria, BC, แคนาดา, V8R 1C2
6Department แพทยศาสตร์ดยุคศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยเดอร์แฮม, อร์ทแคโรไลนา 27710, USA
ศูนย์ 7National สำหรับจีโนมมนุษย์วิจัยสถาบันสุขภาพแห่งชาติอาคาร 49 ห้อง
2A03, 4900 คอนแวนต์ Drive, Bethesda, Maryland 20892-4430, USA
บทคัดย่อ
haematopoietic เซลล์ต้นกำเนิดในเลือดสายสะดือเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจสำหรับการรักษาด้วยยีนของ
ข้อผิดพลาดมา แต่กำเนิดของการเผาผลาญ สามทารกแรกเกิดด้วยโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องรวมอย่างรุนแรงได้รับ
การรักษาโดย transduction ไวรัสพึ่งของ CD34 + เซลล์จากเลือดจากสายสะดือของพวกเขา
ที่มี deaminase adenosine มนุษย์ปกติ DNA ประกอบตามด้วย autologous
ปลูก การแสดงตนอย่างต่อเนื่องและการแสดงออกของยีนที่นำมาใช้ในเม็ดเลือดขาวจาก
ไขกระดูกและเลือด 18 เดือนแสดงให้เห็นว่าเซลล์เลือดจากสายสะดือ
อาจถูกดัดแปลงพันธุกรรมที่มีพาหะไวรัสและทรงปลูกฝังในทารกแรกเกิดสำหรับการรักษาด้วยยีน.
สืบทอดขาด deaminase อะดีโนซีน (ADA) เป็น สาเหตุของการประมาณ onequarter
ของกรณีของโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องอย่างรุนแรงรวม (SCID) 1,2 บนพื้นฐานของ
การรักษาที่ประสบความสำเร็จของวทคร ADA ขาดโดยการปลูกถ่ายไขกระดูก allogeneic และ
โคลนปกติมนุษย์ ADA DNA ประกอบ, ADA ขาดได้รับ
เป้าหมายสำคัญสำหรับยีน therapy3,4 ในทางทฤษฎีการแก้ไขพันธุกรรม Tlymphoid autologous
สารตั้งต้นควรจะมีความได้เปรียบในการอยู่รอดที่เลือกข้างที่ไม่ได้รับการแก้ไข ADAdeficient
เซลล์ ระดับวงกว้างของการแสดงออกโดยการใส่ยีน ADA (จากหนึ่งในสิบที่จะ
สูงกว่าปกติ) ควรจะเป็นประโยชน์โดยไม่มีผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์แม้จะไม่มี
ข้อมูลที่เฉพาะเจาะจงเกี่ยวกับผลกระทบของการแสดงออกใหญ่ของ ADA ในเซลล์ของทุก
lineages haematopoietic ดังนั้นแม้จะมีความสามารถในการเจียมเนื้อเจียมตัวในขณะนี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
© 1995 ธรรมชาติของกลุ่มสำนักพิมพ์
จดหมายควรจะจ่าหน้าถึง DBKCAM อยู่ปัจจุบันกรมทดลองกุมารเวชศาสตร์มหาวิทยาลัยเท็กซัส
MD Anderson Cancer Center, กล่อง 88 ห้อง AC6.004, 1515 Holcombe Boulevard, ฮูสตัน, เท็กซัส, 77030, USA.
NIH สาธารณะเข้าถึง
ผู้เขียนต้นฉบับ
แน็ Med ที่เขียนด้วยลายมือผู้เขียน; ที่มีอยู่ใน PMC 3 มกราคม 2011.
ตีพิมพ์ในรูปแบบแก้ไขสุดท้ายเป็น:
ชัยนาท Med 1995 ตุลาคม 1 (10):. 1017-1023
NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ
ยีนโอนเข้าสู่เซลล์เม็ดเลือดหลักและไม่สามารถที่จะควบคุมการแสดงออกของยีน
ในลักษณะที่แม่นยำ SCID ADA ขาดอาจตอบสนองต่อยีน การรักษาด้วย.
ทดลองทางคลินิกครั้งแรกของการรักษาด้วยยีนที่เกี่ยวข้องกับเด็กสาวสองคนที่มีการขาด ADA ใช้
lymphocytes T เลือดของพวกเขาเป็นเป้าหมายของ ADA ยีน transfer5,6 หลาย
หลักสูตรของ leukopheresis, พลังงานและอีกครั้งแช่ของเซลล์เม็ดเลือดขาว T นำไปสู่การเพิ่ม
จำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาว T และปรับปรุงการทำงานของ T-Iymphocyte กับความสำเร็จในหนึ่งใน
สองผู้ป่วยหมุนเวียนระดับ ADA เม็ดโลหิตขาวเทียบเท่ากับหนึ่งในสี่ของผู้ที่อยู่ใน
บุคคลปกติ ถึงแม้ว่าจะมีผลกระตุ้นให้กับเซลล์เม็ดเลือดขาว T ผู้ใหญ่
การแก้ไขทางพันธุกรรมของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดอาจสร้างแหล่งเพิ่มเติมยาวนานของ
ADA-แสดง lymphocytes T ข้อมูลที่ได้จากการรักษาของการขาด ADA
จะใช้บังคับกับการใช้เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดสำหรับการรักษาด้วยยีนอื่น ๆ
รูปแบบ aetiologic ของวทครและโรคทางพันธุกรรมอื่น ๆ ที่มีผลต่อการสร้างเม็ดเลือดและ
เซลล์ต่อมน้ำเหลือง.
ในฤดูใบไม้ผลิของปี 1993, ผู้หญิงสามคนที่เป็นที่รู้จัก จะ heterozygous สำหรับ ADA
ขาดถูกระบุที่จะแบกทารก ADA ขาด หลังจากที่ทางพันธุกรรมที่เป็นอิสระ
ให้คำปรึกษาในครอบครัวแต่ละคนเลือกที่จะดำเนินการตั้งครรภ์ของแต่ละระยะ เพราะ
การวินิจฉัยก่อนคลอดโอกาสที่ถูกเจ้าตัวจะพยายามรักษาด้วยยีนสำหรับ
ทารกแรกเกิดโดยใช้เลือดจากสายสะดือของพวกเขาเป็นแหล่งที่มาของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด.
ข้อมูลที่กว้างขวางได้รับการสะสมเพื่อแสดงว่าเลือดสายสะดือมี
เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด; กว่าสี่สิบผู้ป่วยที่มีประสบความสำเร็จ haematopoietic
ปฏิสังขรณ์โดยการปลูกของเม็ดเลือดขาวในเลือดสาย allogeneic ต่อไปนี้
conditioning7,8 cytoablative.
ได้รับอนุมัติให้ดำเนินการถ่ายโอนยีนเข้าสู่กระแสเลือดสายสะดือทารกแรกเกิด 'ตามด้วย
การปลูกถ่ายเซลล์ที่ได้รับจากคณะกรรมการทบทวนสถาบัน
ดีเอ็นเอคณะกรรมการที่ปรึกษา (RAC) ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติและ
กรรมการอาหารและยา พ่อแม่ผู้ปกครองของเด็กแต่ละคนให้ความยินยอมในการ
เก็บพลังงานและอีกครั้งแช่ของสายสะดือเลือด CD34 + เซลล์ หลังจากระยะ
การส่งมอบของทารกแต่ละเลือดสายสะดือถูกเก็บรวบรวมและประมวลผลเพื่อแยก
ประชากร CD34 + เซลล์ + CD34 ถูก transduced กับไวรัสเวกเตอร์แลสเซน (Ref.
9) ซึ่งดำเนิน cDNA ADA มนุษย์ปกติและกลับไปยังผู้บริจาคของตนโดยการ
ฉีดเข้าเส้นเลือดดำในวันที่สี่ชีวิตของพวกเขา ต่อจากนั้นเรากำหนด
ประสิทธิภาพของพลังงานยีนและไม่ว่า engraftment ของสายสะดือเลือด
เซลล์ต้นกำเนิดที่เกิดขึ้น เรารายงานที่นี่ผลของการใช้งานครั้งแรกของสายสะดือเลือด
เซลล์ยีนบำบัดทางคลินิก.
แน่นอนทางคลินิก
ที่เกิดการวินิจฉัยก่อนคลอดของ ADA ขาดได้รับการยืนยัน เรืองแสงที่ทำงานโดยใช้
การจัดเรียงเซลล์ (FACS) การวิเคราะห์ตัวอย่างเลือดจากสายสะดือแสดงให้เห็นว่าผู้ป่วยที่
ได้ลดจำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาว T (1.5-2%) เมื่อเทียบกับผู้ที่อยู่ในสะดือปกติ
เลือดจากสายสะดือ (56.6% ± 12.5) ระดับของสารซีรั่ม deoxyadenosine (dAXP) ได้รับการ
ยกระดับ ต่อไปนี้สถาบันการศึกษาของการบำบัดทดแทนเอนไซม์ที่มีพลาสติกคอล
(PEG) รวมกับ ADA ในวันที่ 1-4 ของชีวิต (30 U kg-1 สัปดาห์ละสองครั้งโดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อ
ฉีด) มีการแก้ไขความผิดปกติของการเผาผลาญอาหารที่มีระดับ dAXP ใน
เม็ดเลือดแดงลดลง 160-302 นาโนโมมล-1 (สายเลือดเซลล์เม็ดเลือดแดง (เม็ดเลือดแดง)) เพื่อ <10
นาโนโมมล-1 ภายใน 7-10 สัปดาห์ ทั้งสามผู้ป่วยที่ยังคงอยู่ในการดูแลสุขภาพที่ดีในขณะ
ที่ได้รับ PEG-ADA การเจริญเติบโตและการพัฒนาได้รับปกติที่มีการติดเชื้อที่ไม่มี
ภาวะแทรกซ้อนยกเว้นสำหรับการติดเชื้อทางเดินหายใจส่วนบนกิจวัตรประจำวัน การป้องกันโรคในช่องปากที่มี
trimethoprim / sulphamethoxazole (TMP / SMX) และโกลบูลิแกมมาทางหลอดเลือดดำได้รับ
โคห์นและคณะ หน้า 2
แน็ Med ที่เขียนด้วยลายมือผู้เขียน; ที่มีอยู่ใน PMC วันที่ 3 มกราคม 2011.
NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ NIH-PA ผู้เขียนต้นฉบับ
สำหรับงวดหกเดือนแรกที่ผู้ป่วย 1, 2 ผู้ป่วยยังคงอยู่ใน TMP / SMX, 3 และผู้ป่วยยังคง
ที่จะได้รับทั้งโกลบูลิแกมมาทางหลอดเลือดดำและ TMP / SMX.
พลังงานยีนของสายสะดือเลือด CD34 + เซลล์
ระหว่าง 60 และ 200 มิลลิลิตรของเลือดจากสายสะดือที่ได้รับจากสามทารก มาซึ่ง
การวิเคราะห์เม็ดเลือดขาวสายสะดือแสดงให้เห็นว่าระหว่าง 0.7% และ 0.9% ของ
เซลล์ที่เป็นบวกสำหรับเซลล์ต้นกำเนิด / แอนติเจนชนก, CD34 ตัวอย่างเลือดจากสายสะดือถูก
ผสมกับแอนติบอดี biotinylated เพื่อ CD34 และประมวลผลผ่าน avidin
คอลัมน์ immunoaffinlty ประชากรเซลล์ที่เกิดระหว่าง 32% และ 62% CD34
บวกกับอัตราผลตอบแทนระหว่าง 24% และ 89%.
เซลล์อุดม CD34 + ถูก transduced กับสามรอบของแลสเซนไวรัส vectorcontaining
ใสในการปรากฏตัวของปัจจัยการเจริญเติบโต recombinant haematopoietic
(interleukin-3 ( IL-3), IL-6 และปัจจัยเซลล์ต้นกำเนิด) เพื่อเพิ่มศักยภาพในการถ่ายโอนยีน หลังจากสามวันของ
วัฒนธรรมตัวเลขรวมของเม็ดเลือดขาวเพิ่มขึ้น 1.3- ถึง 2.4 เท่า แลสเซน-transduced
สายสะดือเซลล์เม็ดเลือดจากนั้นได้รับการฉีดเข้าเส้นเลือดดำสีลงไปในผู้ป่วยแต่ละรายที่สี่ของเขา
วันของชีวิต พิษไม่ถูกตั้งข้อสังเกตในระหว่างหรือหลังจาก infusions.
เพื่อประเมินประสิทธิภาพของพลังงานไวรัสพึ่งของเม็ดเลือด clonogenic
บรรพบุรุษที่มีอยู่ภายในเซลล์เลือดจากสายก่อนที่จะปลูกตัวอย่างถูก
ชุบในหน่วยอาณานิคมขึ้นรูป granulocyte-macrophage (CFU-GM) ในการตรวจ ที่มีและไม่มี
อนาล็อก NEOMYCIN เลือก g418 การแสดงออกของยีนใหม่ที่มีอยู่ใน
เวกเตอร์แลสเซนอนุญาตให้อาณานิคมมาจากบรรพบุรุษ transduced จะอยู่รอดใน g418.
จากสามของผู้ป่วย, 21.5%, 12.5% และ 19.4% ของบรรพบุรุษ clonogenic เป็น G418-
ทน.
เม็ดเลือดขาวเลือด
เพื่อตรวจสอบว่า เซลล์ transduced CD34 + ได้ทรงปลูกฝังและไม่ว่าจะ
มีส่วนทำให้การไหลเวียนของประชากรเม็ดโลหิตขาว, เราได้รับเลือดอนุกรม
ตัวอย่างรายเดือนในช่วงเวลาหลังการปลูก ความถี่ของเลือด
โมโนนิวเคลียร์เซลล์และ granulocytes เวกเตอร์ที่มีลำดับดีเอ็นเอถูกกำหนด
โดยวิธี Polymerase chain reaction เชิงกึ่งปริมาณ (PCR) การวิเคราะห์ ไพรเมอร์พีซีอาร์ได้รับการออกแบบ
มาโดยเฉพาะเพื่อขยายลำดับเวกเตอร์ที่ได้รับมาเท่านั้น หนึ่งเป็นไพรเมอร์เสริมให้กับ
ลำดับของโมโลนีย์ไวรัสโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวหนูกระดูกสันหลังของเวกเตอร์และเป็นหนึ่ง
ประกอบกับยีน ADA ของมนุษย์ (รูป. 1a) ความเข้มของสัญญาณจาก
ตัวอย่างของเม็ดเลือดขาวที่ถูกเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานเพื่อให้การประมาณค่า
ความถี่ของการไหลเวียนของเม็ดเลือดขาวที่มีบูรณาการแลสเซน provirus ชุดเกียร์ SMG
การแปล กรุณารอสักครู่..
การปลูกถ่ายยีนเลือดสายสะดือในทารกแรกเกิดกับเซลล์ขาด
ดีอะมิเนส โดนัลด์ พ. kohn1 , เคนเนทผม weinberg1 Jan . nolta1 ลินดา ที่ heiss1 คาร์ล lenarsky1
เกย์ , ม. crooks1 Mary E . hanley1 geralyn annett1 จูดิธ , , S . brooks1 แอนโทนี่ เอล -
khoureiy1 คิม lawrence1 ซูซี่ wells1 , โรเบิร์ต C . moen2 จอห์น bastian3 เดบ ่า , E .
williams-herman4 elder4 , เมลิซ่า ,ไดแอน wara4 โทมัส bowen5 ไมเคิล เอส hershfield6
. mullen7 , เครก , ไมเคิล blaese7 อาร์ และ โรเบิร์ตสัน parkman1
1division วิจัยภูมิคุ้มกันวิทยา / การปลูกถ่ายไขกระดูก โรงพยาบาลเด็ก , Los
Angeles , มหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนียภาคใต้โรงเรียนแพทยศาสตร์ 4650 Sunset Boulevard ลอสแองเจลิส รัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา 90027
, ,
2genetic บำบัด , Inc ผม clopper , ถนน , Gaithersburg , แมรี่แลนด์ 20878 USA
ศูนย์สุขภาพและโรงพยาบาล 3children คือ ซานดิเอโก , แคลิฟอร์เนีย 92123 USA
4department กุมารเวชศาสตร์ จากมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียในซานฟรานซิสโก ซานฟรานซิสโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา 94143
,
51842 Oak Bay , Victoria , BC , แคนาดา , v8r 1c2
6department แพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัย Duke ศูนย์การแพทย์ Durham , North Carolina 27710 , สหรัฐอเมริกา
ศูนย์ 7national สำหรับการวิจัยจีโนมมนุษย์ สถาบันสุขภาพแห่งชาติอาคาร 49 ห้อง
2a03 , คอนแวนต์ , ไดรฟ์ , Bethesda , Maryland 20892-4430 USA
ที่แท้จริงเป็นสเต็มเซลล์ในสายสะดือเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจสำหรับยีนบำบัดของ
สายอักขระว่าง . สามทารกแรกเกิดที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องรุนแรงรวมเป็น
ถือว่า retroviral โดยการแปรของ cd34 เซลล์จากเลือดสายสะดือ
กับคนปกติดีอะมิเนสจากดีเอ็นเอของ
ตามด้วยการปลูก ยังคงสถานะและการแสดงออกของยีนชนิดที่แนะนำในไขกระดูกและเลือดจาก
ต่อเป็นเวลา 18 เดือน สะท้อนให้เห็นว่า เลือดจากสายสะดือเซลล์
อาจจะดัดแปลงพันธุกรรมที่มีเวกเตอร์และ retroviral engrafted ในทารกแรกเกิดสำหรับยีนบำบัด .
กระเหม่นของดีอะมิเนส ( ADA ) เป็นสาเหตุประมาณ onequarter
กรณีรุนแรง รวมภูมิคุ้มกันบกพร่อง ( สคิด ) 1 , 2 ขึ้นอยู่กับการรักษาที่ประสบความสําเร็จของ ADA ขาด
allogeneic สคิด โดยการปลูกถ่ายไขกระดูกและ
โคลนนิ่งของมนุษย์ปกติเอประกอบดีเอ็นเอ , ADA ขาดได้รับยีนเป้าหมายหลัก
therapy3,4 . ในทางทฤษฎีแก้ไขพันธุกรรมของ tlymphoid
ตั้งต้นควรเลือกที่ไม่รอดจากการแก้ไข adadeficient
เซลล์ กว้างระดับการแสดงออกของยีนโดยแทรก ADA ( จากหนึ่งในสิบ
สูงกว่าปกติ ) ควรเป็นประโยชน์ โดยไม่มีผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ แม้ว่าไม่มี
ข้อมูลเฉพาะเกี่ยวกับผลของ overexpression กว้างใหญ่ของเอในเซลล์ทั้งหมด
เผ่าพันธุ์ที่แท้จริง . ฉะนั้น แม้ในขณะนี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วยเจียมเนื้อเจียมตัวสงวนลิขสิทธิ์ 2538 กลุ่มสำนักพิมพ์ธรรมชาติ
จดหมายควรให้ความสนใจที่จะ d.b.k. c.a.m. ปัจจุบันภาควิชากุมารเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยเท็กซัสทดลอง , M.D . Anderson
ศูนย์มะเร็ง กล่อง ac6.004 1304 88 , ห้อง , โฮลเคิ่มบ์ Boulevard , ฮูสตัน , เท็กซัส , 77030 , USA
NIH เข้าถึงสาธารณะผู้เขียน ต้นฉบับ
แนทด้วย .ต้นฉบับผู้เขียน ; ใช้ได้ใน PMC 2011 มกราคม 3 .
ตีพิมพ์สุดท้ายแก้ไขแบบฟอร์ม :
แนทด้วย . ตุลาคม 2538 ; 2 ( 10 ) : 1017 - 1023 .
nih-pa ผู้เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ
ถ่ายโอนยีนเข้าสู่เซลล์หลักที่แท้จริงและไม่สามารถที่จะควบคุม
การแสดงออกของยีนในลักษณะที่แม่นยำ , ADA ขาดสคิดอาจตอบสนองต่อการรักษายีน .
การทดลองทางคลินิกครั้งแรกของยีนบำบัดเกี่ยวข้องกับสองหนุ่มสาวกับ ADA ขาด ใช้ของเม็ดเลือดขาวลิมโฟซัยท์ T
เป็นเป้าหมายสำหรับ Ada จีน transfer5,6 . หลักสูตรของหลาย
leukopheresis ผ่าน , และแบบไม่ก่อให้เกิดการเพิ่มจำนวนของเม็ดเลือดขาวลิมโฟซัยท์และฟังก์ชัน T
t-iymphocyte ดีขึ้นกับภูมิปัญญาในหนึ่ง
สองผู้ป่วยเม็ดโลหิตขาวเอระดับเทียบเท่ากับหนึ่งในสี่ของผู้ที่อยู่ใน
บุคคลปกติหมุนเวียน . แม้เหล่านี้เล็กผลด้วยทีลิมโฟซัยท์ ,
แก้ไขพันธุกรรมของสเต็มเซลล์ที่แท้จริงอาจสร้างมากขึ้นในระยะยาวแหล่ง
เอแสดงทีลิมโฟซัยท์ . ข้อมูลที่ได้รับจากการรักษาของ ADA ขาด
จะใช้เพื่อการใช้สเต็มเซลล์ที่แท้จริงสำหรับยีนบำบัดสำหรับรูปแบบอื่น ๆของ
aetiologic สคิดและโรคทางพันธุกรรมอื่น ๆ ที่มีผลต่อเซลล์เม็ดเลือดที่แท้จริงและ
.
ในฤดูใบไม้ผลิของปี 1993 สามผู้หญิงที่รู้จักกันเป็น homozygous สำหรับ Ada
ขาดระบุต้องแบก ADA ขาดสาย . หลังจากเป็นอิสระทางพันธุกรรม
ให้คำปรึกษาแต่ละครอบครัวเลือกที่จะแบกของการตั้งครรภ์ที่เกี่ยวข้องกับระยะ เพราะ
การวินิจฉัยก่อนคลอด โอกาสพิเศษ คือ ให้พยายามรักษายีนเพื่อใช้เลือดสายสะดือของทารกแรกเกิด
ที่แท้จริงเป็นแหล่งของสเต็มเซลล์ .
ข้อมูลอย่างละเอียดได้สะสมเพื่อแสดงว่าเลือดสายสะดือมีสเต็มเซลล์
ที่แท้จริง ;มากกว่าผู้ป่วยสี่สิบมีประสบความสำเร็จที่แท้จริงโดยการสร้างใหม่ของ allogeneic
cytoablative สายเลือดเม็ดเลือดขาวตาม conditioning7,8 .
ขออนุมัติเพื่อดำเนินการถ่ายโอนยีนเข้าสู่เลือดสายสะดือทารกแรกเกิด ' ตามด้วย
การปลูกถ่ายของเซลล์ที่ได้รับจากคณะกรรมการทบทวน
สถาบันดีเอ็นเอคณะกรรมการที่ปรึกษา ( RAC ) ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ ,
สำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา ผู้ปกครองของเด็กแต่ละคนได้ให้ความยินยอมสำหรับ
คอลเลกชัน ผ่านและฉีดของเลือดสายสะดือ cd34 เซลล์ หลังจากเทอม
ส่งแต่ละเลือดสายสะดือทารกแรกเกิด ถูกเก็บรวบรวมและประมวลผลเพื่อแยก
cd34 ประชากรเซลล์ cd34 เป็น transduced กับเวกเตอร์อังกฤษ แล ซน retroviral
9 ) ซึ่งถือเป็นมนุษย์ธรรมดา ADA cDNA และส่งกลับมาให้ตน โดยการฉีดของผู้บริจาค
วันที่สี่ของชีวิต ต่อมา เรามุ่งมั่น
ประสิทธิผลของยีนผ่านและว่าสเต็มเซลล์ปลูกถ่ายเลือดสายสะดือของ
เกิดขึ้นเรารายงานมา ผลของการใช้ครั้งแรกของเลือดสายสะดือ
เซลล์สำหรับยีนบำบัดที่คลินิก คลินิกแน่นอน
ที่คลอดก่อนคลอดการวินิจฉัยของ ADA ขาดได้รับการยืนยันแล้ว การเปิดใช้งาน
เซลล์เรียง ( facs ) การวิเคราะห์ตัวอย่างเลือดสายสะดือ พบว่า ผู้ป่วยมีการลดจำนวนของเม็ดเลือดขาว
T ( 1.5 – 2 % ) เมื่อเทียบกับคนปกติ
สายสะดือเลือดสายสะดือ ( 56.6% ± 12.5 ) ระดับของซีรั่มสารดีอ ซีแอดีโนซีน ( daxp )
ยกระดับ ตามสถาบันของเอนไซม์ทดแทนด้วย polyethylene glycol ( PEG )
รวมกับเอวันที่ 1 – 4 ของชีวิต ( 30 และ kg-1 สองสัปดาห์ โดยฉีด
) , มีการแก้ไขความผิดปกติการเผาผลาญอาหารที่มีระดับ daxp ใน
เม็ดเลือดแดงลดลงจาก 160 – 302 ซึ่งแน่นอน ( สายเลือดเซลล์เม็ดเลือดแดง ( rbcs ) ) < 10
? แน่นอนภายใน 7 – 10 สัปดาห์ ทั้งสามคนยังคงสุขภาพดีในขณะที่
รับหมุด - เอ การเจริญเติบโตและพัฒนาการได้ปกติไม่มีภาวะแทรกซ้อนติดเชื้อ
ยกเว้นขั้นตอนการติดเชื้อระบบทางเดินหายใจส่วนบน . การป้องกันโรคในช่องปาก
ด้วยไตรเมโธพริมซัลฟาเมท ซาโซล ( / tmp / smx แกมมาโกลบูลิน ) และการได้รับ
คอร์น et al . หน้า 2
แนทด้วย . ต้นฉบับผู้เขียน ; ใช้ได้ใน PMC 2011 มกราคม 3 .
nih-pa ผู้เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ
สำหรับหกเดือนแรกผู้ป่วย 1 ผู้ป่วย 2 ยังคงอยู่ใน tmp / smx และผู้ป่วยที่ได้รับยาทั้ง 3 ยังคง
แกมมาโกลบูลิน และ tmp /
smx .ยีนการแปรของเลือดสายสะดือเซลล์ cd34
ระหว่าง 60 และ 200 มิลลิลิตรของเลือดสายสะดือที่ได้รับจากสามทารก facs
การวิเคราะห์ของเม็ดเลือดขาวสายสะดือ แสดงให้เห็นว่าระหว่าง 0.7 % และ 0.9% ของ
เซลล์เป็นบวก สำหรับสเต็มเซลล์ / ต้นตระกูลแอนติเจน cd34 . เลือดสายสะดือจำนวน
ผสมกับโมโนโคลนอลแอนติบอดีเพื่อ cd34 ไลและประมวลผลผ่านวิดิน
immunoaffinlty คอลัมน์ ส่งผลให้เซลล์จำนวนระหว่าง 32 และ 62 เปอร์เซ็นต์ cd34
บวกกับผลผลิตระหว่าง 24% และ 89 %
อุดม cd34 cells transduced กับสามรอบ แล ซน retroviral vectorcontaining
นำในการแสดงตนของยีนปัจจัยการเจริญเติบโต
ที่แท้จริง( interleukin-3 ( ปกติ ) , IL-6 และลำต้นปัจจัยเซลล์ ) เพื่อเพิ่มการถ่ายโอนยีน หลังจากสามวันของ
วัฒนธรรม ตัวเลขรวมของเม็ดเลือดขาวเพิ่มขึ้น 1.3 - 2.4-fold . การ แล ซน transduced
สายสะดือเซลล์แล้วผสมเข้าเป็นผู้ป่วยแต่ละรายในวันที่สี่
ของชีวิต ไม่มีความเป็นพิษถูกระบุในระหว่างหรือหลังจากการ infusions
เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ retroviral โดยการแปรของ clonogenic 10
ตั้งต้นที่มีอยู่ภายในเซลล์ก่อนการปลูกถ่ายเลือดสายสะดือกลุ่มตัวอย่าง
ชุบอาณานิคมสร้างแมโครเฟจแกรนูโลไซต์ ( หน่วย cfu-gm ) โดยมี
อนาล็อก นีโอไมซินเลือก g418 . การแสดงออกของยีนที่มีอยู่ใน
นีโอเวกเตอร์ แล ซนให้อาณานิคมที่ได้มาจาก transduced ตั้งต้นเพื่อความอยู่รอดใน g418 .
จากสามราย , 21.5 เปอร์เซ็นต์ 12.5 % และ 19.4% ของตั้งต้น clonogenic เป็น g418 -
ทน เม็ดเลือดขาวชนิด พบว่าเซลล์มี transduced cd34 engrafted และไม่ว่าจะ
ส่วนประชากรเลือดหมุนเวียน เราได้ต่อเนื่อง เม็ดเลือดขาว
ตัวอย่างในช่วงเดือนหลังการปลูก ความถี่ของเม็ดเลือดขาวปกติเซลล์และกรานูโลไซต์
ที่มีเวกเตอร์ลำดับดีเอ็นเอตั้งใจ
บริโภคโดยปฏิกิริยาลูกโซ่ ) การวิเคราะห์ PCR ไพรเมอร์ที่ออกแบบ
โดยเฉพาะขยายเพียงเวกเตอร์ได้ลำดับ ; หนึ่งคือ
รองพื้นเสริมลำดับของเมอโลนีย์ ~ ลูคีเมียไวรัสกระดูกสันหลังของเวกเตอร์และหนึ่งคือ
ประกอบกับ cDNA ADA มนุษย์ ( รูปที่ 1A ) มีความเข้มของสัญญาณจากตัวอย่างเลือด
เปรียบเทียบกับของเส้นโค้งมาตรฐานเพื่อให้ประมาณ
ความถี่ของเม็ดเลือดขาวที่มีหมุนเวียนรวมโปรไวรัส sequ แล ซน
ดีอะมิเนส โดนัลด์ พ. kohn1 , เคนเนทผม weinberg1 Jan . nolta1 ลินดา ที่ heiss1 คาร์ล lenarsky1
เกย์ , ม. crooks1 Mary E . hanley1 geralyn annett1 จูดิธ , , S . brooks1 แอนโทนี่ เอล -
khoureiy1 คิม lawrence1 ซูซี่ wells1 , โรเบิร์ต C . moen2 จอห์น bastian3 เดบ ่า , E .
williams-herman4 elder4 , เมลิซ่า ,ไดแอน wara4 โทมัส bowen5 ไมเคิล เอส hershfield6
. mullen7 , เครก , ไมเคิล blaese7 อาร์ และ โรเบิร์ตสัน parkman1
1division วิจัยภูมิคุ้มกันวิทยา / การปลูกถ่ายไขกระดูก โรงพยาบาลเด็ก , Los
Angeles , มหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนียภาคใต้โรงเรียนแพทยศาสตร์ 4650 Sunset Boulevard ลอสแองเจลิส รัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา 90027
, ,
2genetic บำบัด , Inc ผม clopper , ถนน , Gaithersburg , แมรี่แลนด์ 20878 USA
ศูนย์สุขภาพและโรงพยาบาล 3children คือ ซานดิเอโก , แคลิฟอร์เนีย 92123 USA
4department กุมารเวชศาสตร์ จากมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียในซานฟรานซิสโก ซานฟรานซิสโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา 94143
,
51842 Oak Bay , Victoria , BC , แคนาดา , v8r 1c2
6department แพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัย Duke ศูนย์การแพทย์ Durham , North Carolina 27710 , สหรัฐอเมริกา
ศูนย์ 7national สำหรับการวิจัยจีโนมมนุษย์ สถาบันสุขภาพแห่งชาติอาคาร 49 ห้อง
2a03 , คอนแวนต์ , ไดรฟ์ , Bethesda , Maryland 20892-4430 USA
ที่แท้จริงเป็นสเต็มเซลล์ในสายสะดือเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจสำหรับยีนบำบัดของ
สายอักขระว่าง . สามทารกแรกเกิดที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องรุนแรงรวมเป็น
ถือว่า retroviral โดยการแปรของ cd34 เซลล์จากเลือดสายสะดือ
กับคนปกติดีอะมิเนสจากดีเอ็นเอของ
ตามด้วยการปลูก ยังคงสถานะและการแสดงออกของยีนชนิดที่แนะนำในไขกระดูกและเลือดจาก
ต่อเป็นเวลา 18 เดือน สะท้อนให้เห็นว่า เลือดจากสายสะดือเซลล์
อาจจะดัดแปลงพันธุกรรมที่มีเวกเตอร์และ retroviral engrafted ในทารกแรกเกิดสำหรับยีนบำบัด .
กระเหม่นของดีอะมิเนส ( ADA ) เป็นสาเหตุประมาณ onequarter
กรณีรุนแรง รวมภูมิคุ้มกันบกพร่อง ( สคิด ) 1 , 2 ขึ้นอยู่กับการรักษาที่ประสบความสําเร็จของ ADA ขาด
allogeneic สคิด โดยการปลูกถ่ายไขกระดูกและ
โคลนนิ่งของมนุษย์ปกติเอประกอบดีเอ็นเอ , ADA ขาดได้รับยีนเป้าหมายหลัก
therapy3,4 . ในทางทฤษฎีแก้ไขพันธุกรรมของ tlymphoid
ตั้งต้นควรเลือกที่ไม่รอดจากการแก้ไข adadeficient
เซลล์ กว้างระดับการแสดงออกของยีนโดยแทรก ADA ( จากหนึ่งในสิบ
สูงกว่าปกติ ) ควรเป็นประโยชน์ โดยไม่มีผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ แม้ว่าไม่มี
ข้อมูลเฉพาะเกี่ยวกับผลของ overexpression กว้างใหญ่ของเอในเซลล์ทั้งหมด
เผ่าพันธุ์ที่แท้จริง . ฉะนั้น แม้ในขณะนี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วยเจียมเนื้อเจียมตัวสงวนลิขสิทธิ์ 2538 กลุ่มสำนักพิมพ์ธรรมชาติ
จดหมายควรให้ความสนใจที่จะ d.b.k. c.a.m. ปัจจุบันภาควิชากุมารเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยเท็กซัสทดลอง , M.D . Anderson
ศูนย์มะเร็ง กล่อง ac6.004 1304 88 , ห้อง , โฮลเคิ่มบ์ Boulevard , ฮูสตัน , เท็กซัส , 77030 , USA
NIH เข้าถึงสาธารณะผู้เขียน ต้นฉบับ
แนทด้วย .ต้นฉบับผู้เขียน ; ใช้ได้ใน PMC 2011 มกราคม 3 .
ตีพิมพ์สุดท้ายแก้ไขแบบฟอร์ม :
แนทด้วย . ตุลาคม 2538 ; 2 ( 10 ) : 1017 - 1023 .
nih-pa ผู้เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ
ถ่ายโอนยีนเข้าสู่เซลล์หลักที่แท้จริงและไม่สามารถที่จะควบคุม
การแสดงออกของยีนในลักษณะที่แม่นยำ , ADA ขาดสคิดอาจตอบสนองต่อการรักษายีน .
การทดลองทางคลินิกครั้งแรกของยีนบำบัดเกี่ยวข้องกับสองหนุ่มสาวกับ ADA ขาด ใช้ของเม็ดเลือดขาวลิมโฟซัยท์ T
เป็นเป้าหมายสำหรับ Ada จีน transfer5,6 . หลักสูตรของหลาย
leukopheresis ผ่าน , และแบบไม่ก่อให้เกิดการเพิ่มจำนวนของเม็ดเลือดขาวลิมโฟซัยท์และฟังก์ชัน T
t-iymphocyte ดีขึ้นกับภูมิปัญญาในหนึ่ง
สองผู้ป่วยเม็ดโลหิตขาวเอระดับเทียบเท่ากับหนึ่งในสี่ของผู้ที่อยู่ใน
บุคคลปกติหมุนเวียน . แม้เหล่านี้เล็กผลด้วยทีลิมโฟซัยท์ ,
แก้ไขพันธุกรรมของสเต็มเซลล์ที่แท้จริงอาจสร้างมากขึ้นในระยะยาวแหล่ง
เอแสดงทีลิมโฟซัยท์ . ข้อมูลที่ได้รับจากการรักษาของ ADA ขาด
จะใช้เพื่อการใช้สเต็มเซลล์ที่แท้จริงสำหรับยีนบำบัดสำหรับรูปแบบอื่น ๆของ
aetiologic สคิดและโรคทางพันธุกรรมอื่น ๆ ที่มีผลต่อเซลล์เม็ดเลือดที่แท้จริงและ
.
ในฤดูใบไม้ผลิของปี 1993 สามผู้หญิงที่รู้จักกันเป็น homozygous สำหรับ Ada
ขาดระบุต้องแบก ADA ขาดสาย . หลังจากเป็นอิสระทางพันธุกรรม
ให้คำปรึกษาแต่ละครอบครัวเลือกที่จะแบกของการตั้งครรภ์ที่เกี่ยวข้องกับระยะ เพราะ
การวินิจฉัยก่อนคลอด โอกาสพิเศษ คือ ให้พยายามรักษายีนเพื่อใช้เลือดสายสะดือของทารกแรกเกิด
ที่แท้จริงเป็นแหล่งของสเต็มเซลล์ .
ข้อมูลอย่างละเอียดได้สะสมเพื่อแสดงว่าเลือดสายสะดือมีสเต็มเซลล์
ที่แท้จริง ;มากกว่าผู้ป่วยสี่สิบมีประสบความสำเร็จที่แท้จริงโดยการสร้างใหม่ของ allogeneic
cytoablative สายเลือดเม็ดเลือดขาวตาม conditioning7,8 .
ขออนุมัติเพื่อดำเนินการถ่ายโอนยีนเข้าสู่เลือดสายสะดือทารกแรกเกิด ' ตามด้วย
การปลูกถ่ายของเซลล์ที่ได้รับจากคณะกรรมการทบทวน
สถาบันดีเอ็นเอคณะกรรมการที่ปรึกษา ( RAC ) ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ ,
สำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา ผู้ปกครองของเด็กแต่ละคนได้ให้ความยินยอมสำหรับ
คอลเลกชัน ผ่านและฉีดของเลือดสายสะดือ cd34 เซลล์ หลังจากเทอม
ส่งแต่ละเลือดสายสะดือทารกแรกเกิด ถูกเก็บรวบรวมและประมวลผลเพื่อแยก
cd34 ประชากรเซลล์ cd34 เป็น transduced กับเวกเตอร์อังกฤษ แล ซน retroviral
9 ) ซึ่งถือเป็นมนุษย์ธรรมดา ADA cDNA และส่งกลับมาให้ตน โดยการฉีดของผู้บริจาค
วันที่สี่ของชีวิต ต่อมา เรามุ่งมั่น
ประสิทธิผลของยีนผ่านและว่าสเต็มเซลล์ปลูกถ่ายเลือดสายสะดือของ
เกิดขึ้นเรารายงานมา ผลของการใช้ครั้งแรกของเลือดสายสะดือ
เซลล์สำหรับยีนบำบัดที่คลินิก คลินิกแน่นอน
ที่คลอดก่อนคลอดการวินิจฉัยของ ADA ขาดได้รับการยืนยันแล้ว การเปิดใช้งาน
เซลล์เรียง ( facs ) การวิเคราะห์ตัวอย่างเลือดสายสะดือ พบว่า ผู้ป่วยมีการลดจำนวนของเม็ดเลือดขาว
T ( 1.5 – 2 % ) เมื่อเทียบกับคนปกติ
สายสะดือเลือดสายสะดือ ( 56.6% ± 12.5 ) ระดับของซีรั่มสารดีอ ซีแอดีโนซีน ( daxp )
ยกระดับ ตามสถาบันของเอนไซม์ทดแทนด้วย polyethylene glycol ( PEG )
รวมกับเอวันที่ 1 – 4 ของชีวิต ( 30 และ kg-1 สองสัปดาห์ โดยฉีด
) , มีการแก้ไขความผิดปกติการเผาผลาญอาหารที่มีระดับ daxp ใน
เม็ดเลือดแดงลดลงจาก 160 – 302 ซึ่งแน่นอน ( สายเลือดเซลล์เม็ดเลือดแดง ( rbcs ) ) < 10
? แน่นอนภายใน 7 – 10 สัปดาห์ ทั้งสามคนยังคงสุขภาพดีในขณะที่
รับหมุด - เอ การเจริญเติบโตและพัฒนาการได้ปกติไม่มีภาวะแทรกซ้อนติดเชื้อ
ยกเว้นขั้นตอนการติดเชื้อระบบทางเดินหายใจส่วนบน . การป้องกันโรคในช่องปาก
ด้วยไตรเมโธพริมซัลฟาเมท ซาโซล ( / tmp / smx แกมมาโกลบูลิน ) และการได้รับ
คอร์น et al . หน้า 2
แนทด้วย . ต้นฉบับผู้เขียน ; ใช้ได้ใน PMC 2011 มกราคม 3 .
nih-pa ผู้เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ nih-pa เขียนต้นฉบับ
สำหรับหกเดือนแรกผู้ป่วย 1 ผู้ป่วย 2 ยังคงอยู่ใน tmp / smx และผู้ป่วยที่ได้รับยาทั้ง 3 ยังคง
แกมมาโกลบูลิน และ tmp /
smx .ยีนการแปรของเลือดสายสะดือเซลล์ cd34
ระหว่าง 60 และ 200 มิลลิลิตรของเลือดสายสะดือที่ได้รับจากสามทารก facs
การวิเคราะห์ของเม็ดเลือดขาวสายสะดือ แสดงให้เห็นว่าระหว่าง 0.7 % และ 0.9% ของ
เซลล์เป็นบวก สำหรับสเต็มเซลล์ / ต้นตระกูลแอนติเจน cd34 . เลือดสายสะดือจำนวน
ผสมกับโมโนโคลนอลแอนติบอดีเพื่อ cd34 ไลและประมวลผลผ่านวิดิน
immunoaffinlty คอลัมน์ ส่งผลให้เซลล์จำนวนระหว่าง 32 และ 62 เปอร์เซ็นต์ cd34
บวกกับผลผลิตระหว่าง 24% และ 89 %
อุดม cd34 cells transduced กับสามรอบ แล ซน retroviral vectorcontaining
นำในการแสดงตนของยีนปัจจัยการเจริญเติบโต
ที่แท้จริง( interleukin-3 ( ปกติ ) , IL-6 และลำต้นปัจจัยเซลล์ ) เพื่อเพิ่มการถ่ายโอนยีน หลังจากสามวันของ
วัฒนธรรม ตัวเลขรวมของเม็ดเลือดขาวเพิ่มขึ้น 1.3 - 2.4-fold . การ แล ซน transduced
สายสะดือเซลล์แล้วผสมเข้าเป็นผู้ป่วยแต่ละรายในวันที่สี่
ของชีวิต ไม่มีความเป็นพิษถูกระบุในระหว่างหรือหลังจากการ infusions
เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ retroviral โดยการแปรของ clonogenic 10
ตั้งต้นที่มีอยู่ภายในเซลล์ก่อนการปลูกถ่ายเลือดสายสะดือกลุ่มตัวอย่าง
ชุบอาณานิคมสร้างแมโครเฟจแกรนูโลไซต์ ( หน่วย cfu-gm ) โดยมี
อนาล็อก นีโอไมซินเลือก g418 . การแสดงออกของยีนที่มีอยู่ใน
นีโอเวกเตอร์ แล ซนให้อาณานิคมที่ได้มาจาก transduced ตั้งต้นเพื่อความอยู่รอดใน g418 .
จากสามราย , 21.5 เปอร์เซ็นต์ 12.5 % และ 19.4% ของตั้งต้น clonogenic เป็น g418 -
ทน เม็ดเลือดขาวชนิด พบว่าเซลล์มี transduced cd34 engrafted และไม่ว่าจะ
ส่วนประชากรเลือดหมุนเวียน เราได้ต่อเนื่อง เม็ดเลือดขาว
ตัวอย่างในช่วงเดือนหลังการปลูก ความถี่ของเม็ดเลือดขาวปกติเซลล์และกรานูโลไซต์
ที่มีเวกเตอร์ลำดับดีเอ็นเอตั้งใจ
บริโภคโดยปฏิกิริยาลูกโซ่ ) การวิเคราะห์ PCR ไพรเมอร์ที่ออกแบบ
โดยเฉพาะขยายเพียงเวกเตอร์ได้ลำดับ ; หนึ่งคือ
รองพื้นเสริมลำดับของเมอโลนีย์ ~ ลูคีเมียไวรัสกระดูกสันหลังของเวกเตอร์และหนึ่งคือ
ประกอบกับ cDNA ADA มนุษย์ ( รูปที่ 1A ) มีความเข้มของสัญญาณจากตัวอย่างเลือด
เปรียบเทียบกับของเส้นโค้งมาตรฐานเพื่อให้ประมาณ
ความถี่ของเม็ดเลือดขาวที่มีหมุนเวียนรวมโปรไวรัส sequ แล ซน
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- ธนภรณ์ สัตยานุรักษ์
- ฉันไม่เข้าใจ
- จะไม่มีวันเลิกรักเธอ
- อิ่มมาก
- If yes, Specify the Social Security numb
- infection prevention division
- He plays guitar incredibly
- It some time
- The rice you eat are similar in appearan
- หรอ
- 언제와
- Select the Subscription for Sending SMS
- สักวัน
- discuss
- When you do yoya, you feel relaxed
- The main Responsibility is to provide se
- Adjust the Backlight based on the screen
- It blew us all away
- ชอบฟ้าว่ะ
- ห้ามออกนอกเส้นทางที่กำหนด
- Coz girl here with big ass
- I coordinated to vendor webhosting, They
- ฉันว่างเวลานี้ทุกวัน
- ตำบลกู่ อำเภอปรางค์กู่ จังหวัดศรีสะเกษ
