2.9. Analysis of DNA damageAnalysis

2.9. Analysis of DNA damage
Analysis of DNA damage was carried out by using the comet assay in the murine embryonic fibroblast line, 3T3-L1 (ATCC). The 3T3-L1 cells were cultured in 12-well tissue culture plates (1 _ 105 cells/well) for 24 h at 37 _C, in a humidified atmosphere containing 5% CO2. Then the cells were pre-treated for 24 h with WTE at concentrations of 5–25 lg/ml. After 24 h of incubation, the cells were treated with 100 lM of H2O2 for 60 min in an ice bath to prevent the action of DNA repair mechanisms and then harvested using trypsin– EDTA, centrifuged for 5 min at 1500 rpm and resuspended in 1 ml of PBS. A volume of 25 ll of cell suspension was mixed with 75 ll of 0.6% low melting agarose. The suspension was spread on a frosted microscopic slide pre-coated with 250 ll of 0.8% normal melting agarose, covered with a cover slip, and then allowed to solidify on ice for 10 min. The cover slips were then removed and the slides were immersed in cold lysis solution containing 1% sodium dodecyl sulphate, 2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 1% Triton X-100, and 10% DMSO, with the DMSO for 1 h at 4 _C in the dark. The slides were arranged in an electrophoresis tank filled with pre-chilled electrophoretic buffer (1 mM Na2EDTA and 300 mM NaOH) and incubated for 20 min. Electrophoresis was conducted at 25 V (300 mA) for 20 min using a power supply. The slides were washed with 0.4 M Tris–HCl (pH 7.5) and stained with 20 lg/ml ethidium bromide. An Olympus BX50 fluorescence microscope was used for viewing the slides. A total of 50 cells in triplicate per group were used to calculate the DNA damage induced by hydrogen peroxide. The comet tail length was measured using an ocular micrometer and the DNA damage was calculated by the following formula: Comet tail length ผ maximum total length _ head diameter

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.9 การวิเคราะห์ความเสียหายของดีเอ็นเอวิเคราะห์ความเสียหายของดีเอ็นเอถูกดำเนิน โดยวิเคราะห์ดาวหางในบรรทัด fibroblast murine ตัวอ่อน 3T3-L1 (ATCC) เซลล์ 3T3 L1 มีอ่างในเยื่อดี 12 แผ่น (1 _ 105 เซลล์/ดี) ใน 24 ชมที่ 37 _C ในบรรยากาศ humidified ประกอบด้วย 5% CO2 จากนั้น เซลล์ได้ก่อนถือว่าสำหรับ h 24 กับ WTE ที่ความเข้มข้นของแอล จี/ml 5-25 หลังจาก 24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ เซลล์ได้รับการรักษา 100 lM ของ H2O2 ใน 60 นาทีในการอาบน้ำแข็งเพื่อป้องกันการดำเนินการของดีเอ็นเอกลไกการซ่อมแซมแล้วเก็บเกี่ยวผลผลิตใช้ทริปซิน – EDTA, centrifuged ใน 5 นาทีที่ 1500 รอบต่อนาที และ resuspended ใน 1 ml ของ PBS ปริมาตร 25 จะระงับเซลล์ถูกผสมกับ 75 จะ 0.6% agarose ละลายต่ำ การระงับได้แพร่กระจายไปบนภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ฝ้าก่อนเคลือบ ด้วย 250 จะ 0.8% ปกติละลาย agarose ปกคลุม ด้วยใบปก และสามารถเข้ากับน้ำแข็ง 10 นาที แล้วออกใบปก และภาพนิ่งที่ถูกแช่อยู่ในโซลูชัน lysis เย็นประกอบด้วย 1% โซเดียมซัลเฟต dodecyl, 2.5 M NaCl, Na2EDTA 100 มม. 1% ไตรตั้น X 100 และ 10% DMSO ด้วย DMSO สำหรับ h 1 ที่ _C 4 ในมืด มีการจัดเรียงภาพนิ่งใน electrophoresis เป็น วิธีถัง ด้วยเย็นก่อนด้วยบัฟเฟอร์ (Na2EDTA 1 มม.และ 300 มม. NaOH) และ incubated สำหรับ 20 นาที Electrophoresis ที่ 25 V (300 mA) สำหรับ 20 นาทีใช้เพาเวอร์ซัพพลาย ภาพนิ่งถูกล้าง ด้วย 0.4 M ตรี – HCl (pH 7.5) และสีกับ 20 โบรไมด์ ethidium lg/ml กล้องจุลทรรศน์ fluorescence Olympus BX50 ถูกใช้สำหรับการดูภาพนิ่ง จำนวนเซลล์ 50 ใน triplicate สำหรับแต่ละกลุ่มถูกใช้เพื่อคำนวณความเสียหายของดีเอ็นเอเกิดจากไฮโดรเจนเพอร์ออกไซด์ ความยาวหางของดาวหางถูกวัดโดยใช้ไมโครมิเตอร์ความแนว และความเสียหายของดีเอ็นเอถูกคำนวณ โดยใช้สูตรต่อไปนี้: เส้นผ่าศูนย์กลางหัวดาวหางหางยาวผ_ความยาวรวมสูงสุด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.9 . การวิเคราะห์การวิเคราะห์ความเสียหาย
ดีเอ็นเอของความเสียหายของดีเอ็นเอโดยใช้ดาวหาง assay ในตัวอ่อน ~ ส่วนบรรทัด 3t3-l1 ( ATCC ) เซลล์ 3t3-l1 เพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อดี ( 1 _ 105 เซลล์ / ดี ) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 _c ใน humidified บรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5% แล้วเซลล์ก็ถือว่าเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อน wte ที่ความเข้มข้น 5 – 25 LG / mlหลังจาก 24 ชั่วโมง 1 , เซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย 100 LM ของ H2O2 60 นาทีในน้ำแข็งอาบน้ำเพื่อป้องกันการกระทำของกลไกการซ่อมแซมดีเอ็นเอแล้วเก็บเกี่ยวโดยใช้เอนไซม์และ EDTA , ไฟฟ้าสำหรับ 5 นาทีที่ 1 , 500 รอบต่อนาทีและ resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของ PBS ปริมาณ 25 จะของเซลล์แขวนลอยผสมกับ 75 จะ 0.6% ( จุดหลอมเหลวต่ำถูกระงับการแพร่กระจายบนฝ้าสไลด์กล้องจุลทรรศน์ก่อนเคลือบด้วย 0.8% ปกติละลาย ( 250 จะปกคลุมด้วยฝาครอบใบ และได้รับอนุญาตแล้วให้แข็งแข็งนาน 10 นาที ฝาหลุดแล้วเอาออกและภาพนิ่งถูกแช่ในสารละลายที่มีความเสื่อม 1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 2.5 M NaCl na2edta 100 มิลลิเมตร 1% Triton X-100 และ DMSO 10% ,ด้วย DMSO ที่ 4 _c เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืด ภาพนิ่งถูกจัดในถังที่เต็มไป ด้วยวิธีก่อนแช่เย็น electrophoretic บัฟเฟอร์ ( na2edta 1 มม. และ 300 มม. NaOH ) บ่มเป็นเวลา 20 นาทีและวิธีดำเนินการที่ 25 V ( MA 300 ) สำหรับ 20 นาทีที่ใช้แหล่งจ่ายไฟ ภาพนิ่งถูกล้างด้วย 0.4 M ทริส– HCl ( pH 7.5 ) และย้อมด้วย 20 LG / มลทิเดียมโบรไมด์ .เป็นกล้องจุลทรรศน์ Olympus bx50 ถูกใช้สำหรับการดูภาพนิ่ง ทั้งหมด 50 เซลล์ทั้งสามใบแต่ละกลุ่มถูกใช้เพื่อคำนวณความเสียหายของดีเอ็นเอที่เกิดจากไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ดาวหางหางความยาวการวัดไมโครมิเตอร์จักษุ และความเสียหายของดีเอ็นเอถูกคำนวณโดยสูตรต่อไปนี้ : ดาวหางหางความยาวผสูงสุดความยาวเส้นผ่าศูนย์กลาง
_ หัว