neutropenia (ANC below 0.5  109 ce

neutropenia (ANC below 0.5  109 cells/L) induced by chemotherapy
were eligible for this study. Multiple FNEs per patient were
allowed in this study. Written informed consent was obtained from
patients or from the parents of patients who were 15 years old or
younger. The study was approved by the ethics committee of Kawasaki
Medical School. We took two 10 ml blood cultures from
adult patients with FNEs; one was inoculated into an aerobic bottle
and the other into an anaerobic bottle. For child patients, we
collected only 3 ml of blood in a pediatric aerobic bottle. Blood
culture samples were set in a BACTEC FX blood culture system
(Becton, Dickinson and Company, Tokyo, Japan). The isolates were
identified to the species or genus level by API microorganism
identification test kits (bioMerieux, Inc., Lyon, France).
b-D-Gulcan
was measured in each sample. Blood culture samples were also
used for nucleic acid amplification tests as described below.
2.2. DNA extraction protocol
A liquots of 800 mL of EDTA-anticoagulated peripheral blood
were used for the real-time PCR assay. Samples were stored
at 80 C until DNA extraction. For DNA extraction, a QIAamp UCP
Pathogen Mini Kit (QIAGEN, Basel, Switzerland) was used, according
to the instructions of the manufacturer. DNA was eluted in
30 mL of Buffer AVE, provided with the kit, and 5 mL was used for
the real-time PCR assay. To prevent contamination, all procedures
were performed inside laminar flow clean bench and no more
than two tubes were opened simultaneously. We used hydrophobic
filter barrier pipette tips. Pipettes were disinfected with 5%
sodium hypochlorite and exposed to UV light after the experiments
[1].
2.3. Real-time PCR assay
For the bacterial PCR assay, primer pairs specific for conserved
DNA sequences of the 16S rRNA gene region were used [3,4]. The
real-time PCR reaction mixtures were prepared using 10 mL of
enzyme mixture (SsoFast Probes Supermix; Bio-Rad Laboratories,
Inc., Hercules, CA, USA), 1 mL of 10 mM forward primer (AGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG;
SigmaeAldrich, Tokyo, Japan), 1 mL of 10 mM
reverse primer (GGACTAC(C/T/A)AGGGTATCTAAT; SigmaeAldrich),
0.5 mL of 10 mM probe (CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC; SigmaeAldrich)
and 5 mL of sample DNA. The reaction mixture was made
up to 20 mL with water. PCR was performed in a Bio-Rad CFX96
Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories, Inc.) with initial
denaturation at 95 C for 1 min, followed by 40 amplification cycles
(with a temperature transition rate of 3.3 C/second) of denaturation
at 95 C for 5 s, annealing at 53 C for 10 s, and primer
extension at 72 C for 20 s.
For the fungal PCR assay, primer pairs specific for conserved
DNA sequences of the 18S rRNA gene region were used [6e9].
These primers and panfungal oligonucleotide probes were used
to bind to a common sequence present in all fungal species.
Reaction mixtures consisted of 10 mL of enzyme mixture (SsoFast
Probes Supermix; Bio-Rad Laboratories, Inc.), 0.9 mL of 10 mM
forward primer (ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG; SigmaeAldrich),
0.9 mL of 10 mM reverse primer (CCGATCCCTAGTCGGCATAGSeAl
drich), and 0.5 mL of 10 mM probes (TTCAACTACGAGCTTTTT
AACTG; SigmaeAldrich) made up to 20 mL with water.
PCR was performed using a Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System
(Bio-Rad Laboratories, Inc.) with initial denaturation at 95 C
for 1 min, followed by 40 amplification cycles (with a temperature
transition rate of 3.3 C/second) of denaturation at 95 C for 5 s and
annealing and primer extension at 60 C for 30 s, with a single
fluorescence acquisition step at the end of extension.
2.4. Seq

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

neutropenia (เมือปีต่ำกว่า 0.5 109 เซลล์/L) เกิดจากเคมีบำบัดมีสิทธิได้รับการศึกษานี้ FNEs หลายต่อผู้ป่วยได้อนุญาตให้ใช้ในการศึกษานี้ แจ้งความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรได้รับจากผู้ป่วยหรือ จากผู้ปกครองของผู้ป่วยที่มีอายุ 15 ปี หรืออายุ การศึกษาได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการจริยธรรมของคาวาซากิโรงเรียนแพทย์ เราเอาสอง 10 ml เลือดวัฒนธรรมจากผู้ป่วยผู้ใหญ่ FNEs หนึ่งถูก inoculated ในขวดการเต้นแอโรบิกและอื่น ๆ ลงในขวดไม่ใช้ออกซิเจน สำหรับผู้ป่วยเด็ก เรารวบรวมเฉพาะ 3 มล.ของเลือดในขวดเด็กเต้นแอโรบิก เลือดสร้างตัวอย่างวัฒนธรรมในระบบ BACTEC FX เลือดวัฒนธรรม(Becton สัน และ บริษัท โตเกียว ญี่ปุ่น) แยกได้ระบุชนิดหรือสกุลระดับ API จุลินทรีย์ชุดการทดสอบรหัส (bioMerieux, Inc. ลียง ฝรั่งเศส) b-D-Gulcanมีวัดในแต่ละตัวอย่าง ตัวอย่างวัฒนธรรมเลือดแนะใช้สำหรับทดสอบขยายเอ็นตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง2.2. ดีเอ็นเอแยกโพรโทคอลLiquots ของ 800 มล.ของเลือด EDTA anticoagulated อุปกรณ์ต่อพ่วงใช้สำหรับทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์ ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ 80 C จนสกัดดีเอ็นเอ การสกัดดีเอ็นเอ QIAamp UCPการศึกษาชุดมินิ (QIAGEN บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) ใช้ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ดีเอ็นเอที่ eluted ใน30 mL ของบัฟเฟอร์ AVE มีชุด และ 5 mL ใช้สำหรับทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์ เพื่อป้องกันการปนเปื้อน กระบวนงานทั้งหมดwere performed inside laminar flow clean bench and no morethan two tubes were opened simultaneously. We used hydrophobicfilter barrier pipette tips. Pipettes were disinfected with 5%sodium hypochlorite and exposed to UV light after the experiments[1].2.3. Real-time PCR assayFor the bacterial PCR assay, primer pairs specific for conservedDNA sequences of the 16S rRNA gene region were used [3,4]. Thereal-time PCR reaction mixtures were prepared using 10 mL ofenzyme mixture (SsoFast Probes Supermix; Bio-Rad Laboratories,Inc., Hercules, CA, USA), 1 mL of 10 mM forward primer (AGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG;SigmaeAldrich, Tokyo, Japan), 1 mL of 10 mMreverse primer (GGACTAC(C/T/A)AGGGTATCTAAT; SigmaeAldrich),0.5 mL of 10 mM probe (CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC; SigmaeAldrich)and 5 mL of sample DNA. The reaction mixture was madeup to 20 mL with water. PCR was performed in a Bio-Rad CFX96Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories, Inc.) with initialdenaturation at 95 C for 1 min, followed by 40 amplification cycles(with a temperature transition rate of 3.3 C/second) of denaturationat 95 C for 5 s, annealing at 53 C for 10 s, and primerextension at 72 C for 20 s.For the fungal PCR assay, primer pairs specific for conservedDNA sequences of the 18S rRNA gene region were used [6e9].These primers and panfungal oligonucleotide probes were usedto bind to a common sequence present in all fungal species.Reaction mixtures consisted of 10 mL of enzyme mixture (SsoFastProbes Supermix; Bio-Rad Laboratories, Inc.), 0.9 mL of 10 mM
forward primer (ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG; SigmaeAldrich),
0.9 mL of 10 mM reverse primer (CCGATCCCTAGTCGGCATAGSeAl
drich), and 0.5 mL of 10 mM probes (TTCAACTACGAGCTTTTT
AACTG; SigmaeAldrich) made up to 20 mL with water.
PCR was performed using a Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System
(Bio-Rad Laboratories, Inc.) with initial denaturation at 95 C
for 1 min, followed by 40 amplification cycles (with a temperature
transition rate of 3.3 C/second) of denaturation at 95 C for 5 s and
annealing and primer extension at 60 C for 30 s, with a single
fluorescence acquisition step at the end of extension.
2.4. Seq

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

neutropenia (ANC ด้านล่าง 0.5 109 เซลล์ / ลิตร) ที่เกิดจากยาเคมีบำบัด
มีคุณสมบัติเหมาะสมสำหรับการศึกษาครั้งนี้ FNEs หลายต่อผู้ป่วยที่ได้รับ
อนุญาตให้ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรที่ได้รับจาก
ผู้ป่วยหรือจากพ่อแม่ของผู้ป่วยที่อายุ 15 ปีหรือ
อายุน้อยกว่า การศึกษาได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของคาวาซากิ
โรงเรียนแพทย์ เราเอาสอง 10 ml วัฒนธรรมเลือดจาก
ผู้ป่วยผู้ใหญ่ที่มี FNEs; ใครได้รับเชื้อเข้าไปในขวดแอโรบิก
และอื่น ๆ ลงในขวดแบบไม่ใช้ออกซิเจน สำหรับผู้ป่วยเด็กเรา
เก็บเพียง 3 มิลลิลิตรของเลือดในขวดแอโรบิกในเด็ก เลือด
ตัวอย่างวัฒนธรรมที่ตั้งอยู่ใน BACTEC FX ระบบวัฒนธรรมเลือด
(Becton ดิกคินสันและ บริษัท โตเกียวญี่ปุ่น) สายพันธุ์ที่ได้รับ
การระบุสายพันธุ์หรือระดับประเภทโดยจุลินทรีย์ API
ประจำตัวชุดทดสอบ (bioMerieux, Inc, ลียง, ฝรั่งเศส) ? BD-Gulcan
วัดในแต่ละตัวอย่าง ตัวอย่างวัฒนธรรมเลือดก็ถูก
นำมาใช้สำหรับการทดสอบกรดนิวคลีอิกขยายตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง.
2.2 สกัดดีเอ็นเอโปรโตคอล
liquots 800 มิลลิลิตร EDTA-anticoagulated เลือด
ที่ใช้ในแบบ real-time PCR ทดสอบ ตัวอย่างถูกเก็บไว้
ที่? 80 C จนกระทั่งสกัดดีเอ็นเอ สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ QIAamp UCP
เชื้อโรคมินิ Kit (QIAGEN, บาเซิล, สวิตเซอร์) ที่ใช้ตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต ดีเอ็นเอถูกชะใน
30 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ AVE ให้กับชุดและ 5 มิลลิลิตรที่ใช้สำหรับ
แบบ real-time PCR ทดสอบ เพื่อป้องกันการปนเปื้อนทุกขั้นตอน
ได้ดำเนินการภายในม้านั่งไหลที่สะอาดและไม่มีอะไรมากไป
กว่าสองหลอดถูกเปิดพร้อมกัน เราใช้ไม่ชอบน้ำ
กรองเคล็ดลับปิเปตอุปสรรค ปิเปตได้รับการฆ่าเชื้อ 5%
โซเดียมไฮโปคลอไรต์และสัมผัสกับแสงยูวีหลังจากการทดลอง
[1].
2.3 ทดสอบ real-time PCR
สำหรับการทดสอบ PCR แบคทีเรียคู่ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับอนุรักษ์
ลำดับดีเอ็นเอของภูมิภาค 16S rRNA ยีนถูกนำมาใช้ [3,4]
real-time PCR ผสมปฏิกิริยาถูกจัดทำขึ้นโดย 10 มิลลิลิตร
ผสมเอนไซม์ (SsoFast Probes Supermix; Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ,
Inc. , Hercules, CA, USA) 1 มิลลิลิตรของ 10 มมไพรไปข้างหน้า (AGTTTGATC (A / C) TGGCTCAG ;
SigmaeAldrich, โตเกียว, ญี่ปุ่น), 1 มิลลิลิตรของ 10 มม
ไพรย้อนกลับ (GGACTAC (C / T / A) AGGGTATCTAAT; SigmaeAldrich)
0.5 มิลลิลิตร 10 มมสอบสวน (CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC; SigmaeAldrich)
และ 5 มิลลิลิตรของดีเอ็นเอตัวอย่าง ผสมปฏิกิริยาถูกสร้างขึ้นมา
ได้ถึง 20 มิลลิลิตรด้วยน้ำ PCR ได้รับการดำเนินการใน Bio-Rad CFX96
Real-Time PCR ระบบ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Inc) เริ่มต้นด้วยการ
สูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วย 40 รอบการขยาย
(ที่มีอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 3.3 C / วินาที) ของ denaturation
ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที, การอบที่ 53 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาทีและไพรเมอร์
ส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 วินาที.
สำหรับการทดสอบ PCR เชื้อราคู่ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับอนุรักษ์
ลำดับดีเอ็นเอของภูมิภาค 18S rRNA ยีนถูกนำมาใช้ [6E9 .]
ไพรเหล่านี้และ probes oligonucleotide panfungal ถูกนำมาใช้
ในการผูกปัจจุบันลำดับที่พบบ่อยในสายพันธุ์ของเชื้อราทั้งหมด.
ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 10 มิลลิลิตรผสมเอนไซม์ (SsoFast
Probes Supermix; Bio-Rad Laboratories, Inc. ), 0.9 มิลลิลิตร 10 มม
ไพรเมอร์ไปข้างหน้า (ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG; SigmaeAldrich)
0.9 มิลลิลิตร 10 มมไพรย้อนกลับ (CCGATCCCTAGTCGGCATAGSeAl
drich) และ 0.5 มิลลิลิตร 10 probes มิลลิ (TTCAACTACGAGCTTTTT
AACTG; SigmaeAldrich) ทำถึง 20 มิลลิลิตรด้วยน้ำ.
PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ Bio-Rad CFX96 ระบบ PCR แบบ Real-Time
(ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Inc) กับ denaturation เริ่มต้นที่ 95 C
เป็นเวลา 1 นาทีตามด้วย 40 รอบการขยาย (ที่มีอุณหภูมิ
การเปลี่ยนแปลงของอัตรา 3.3 C / วินาที) ของ denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 และ
การอบและการขยายไพรเมอร์ที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, มีเพียงหนึ่งเดียว
ในขั้นตอนการเข้าซื้อกิจการเรืองแสงในตอนท้ายของการขยาย.
2.4 ลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดังนั้น ( ANC ต่ำกว่า 0.5  109 เซลล์ / ลิตร ) ที่เกิดจากเคมีบำบัด
ผู้มีสิทธิ์การศึกษา fnes หลายต่อผู้ป่วย
อนุญาตในการศึกษานี้ เขียนโดยความยินยอมจาก
จากผู้ปกครองของผู้ป่วย หรือผู้ป่วย ที่มีอายุ 15 ปีขึ้นไปหรือ
น้อง การศึกษาที่ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของโรงเรียนแพทย์คาวาซากิ

เราเอาสองวัฒนธรรมเลือด 10 ml
ในผู้ป่วยผู้ใหญ่ที่มี fnes ; หนึ่งเป็นเชื้อเป็น
ขวดแอโรบิกและอื่น ๆ ลงในขวดแบบไม่ใช้ออกซิเจน สำหรับผู้ป่วยเด็ก เราเก็บแค่ 3 ml
เลือดในเด็ก แบบขวด ตัวอย่างวัฒนธรรมเลือด
ถูกตั้งค่าใน bactec FX การเพาะเชื้อในเลือดระบบ
( เบคตอนดิกคินสันและ บริษัท , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ที่แยกได้ถูกระบุชนิดหรือสกุล

โดย API ระดับจุลินทรีย์ชุดทดสอบการ biomerieux , อิงค์ , ลียง , ฝรั่งเศส )
b-d-gulcan
เป็นวัดในแต่ละตัวอย่าง ตัวอย่างวัฒนธรรมเลือดยัง
ใช้กรดนิวคลีอิกขยายการทดสอบตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง .
2.2 . ขั้นตอนการสกัดดีเอ็นเอ : liquots 800 มิลลิลิตรของเลือดส่วนปลายกระ anticoagulated
นำมา ( PCR แบบเรียลไทม์ ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้
 80 C จนกระทั่งการสกัดดีเอ็นเอ การสกัดดีเอ็นเอเป็น qiaamp ucp
เชื้อโรค Mini Kit ( QIAGEN , Basel , Switzerland ) ถูกใช้ตาม
กับคําแนะนําของผู้ผลิต ตัวอย่างดีเอ็นเอใน
30 ml ของบัฟเฟอร์ Ave , ที่มากับชุดและ 5 ml ใช้
( PCR แบบเรียลไทม์ เพื่อป้องกันการปนเปื้อน ทุกขั้นตอนในการทำความสะอาด
แสดงม้านั่งไหลและไม่มี
2 ท่อ คือเปิดได้พร้อมกัน เราใช้ hydrophobic
กรองเคล็ดลับเปตกั้น ปิเปตมีฆ่าเชื้อด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 5%
และสัมผัสกับแสงยูวี หลังจากการทดลอง
[ 1 ] .
2.3 เวลาใช้จริง )
( PCR ไพรเมอร์คู่แบคทีเรียที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการอนุรักษ์
ลำดับดีเอ็นเอของยีน 16S rRNA เขตใช้ [ 3 , 4 ]
เวลาจริงเพื่อตรวจหาสารผสมที่เตรียมโดยใช้ 10 มิลลิลิตร ผสมเอนไซม์ ( ssofast supermix
) ;ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ
อิงค์ , Hercules , CA , USA ) 1 ml รองพื้นไปข้างหน้า 10 มม. ( agtttgatc ( A / C ) tggctcag ;
sigmaealdrich , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) 1 ml รองพื้นย้อนกลับ 10 mm
( ggactac ( C / T / A ) agggtatctaat ; sigmaealdrich )
0.5 มิลลิลิตร สอบสวน 10 มม. ( cgtattaccgcggctgctggcac ; sigmaealdrich )
5 ml ของตัวอย่างดีเอ็นเอ ปฏิกิริยาที่ผสมขึ้น
ถึง 20 มิลลิลิตร กับน้ำ ร่วมแสดงในไบโอ ราด cfx96
เวลาจริงระบบ PCR ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Inc . ) เริ่มต้นที่ 95
( นาน 1 นาที ตามด้วย 40 รอบ (
( มีการเปลี่ยนอุณหภูมิ อัตรา 3.3 C / วินาที ) ของ 95 C (
5 S , annealing ที่ 53 C 10 s และรองพื้น
ส่วนขยายที่ 72 C 20 S .
สำหรับ ( PCR ไพรเมอร์คู่ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับรักษาเชื้อรา
ลำดับดีเอ็นเอของยีน 18S rRNA เขตใช้ [ 6e9 ] .
ไพรเมอร์ ซึ่งวิธีการเหล่านี้ และ panfungal ใช้
ผูกทั่วไปลำดับอยู่ในชนิดของเชื้อราทั้งหมด จำนวน 10 มิลลิลิตรปฏิกิริยา
ผสมส่วนผสมของเอนไซม์ ( ssofast
) supermix ; ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Inc . ) , 0.9 ml 10 มม.
ส่งต่อรองพื้น ( attggagggcaagtctggtg ; sigmaealdrich )
09 ml . ไพรเมอร์กลับ 10 มม. ( ccgatccctagtcggcatagseal
drich ) และ 0.5 มิลลิลิตร ) มม. ( 10 ttcaactacgagcttttt
aactg ; sigmaealdrich ) สร้างขึ้น 20 มิลลิลิตร กับน้ำ โดยมีการใช้ไบโอ

) ราด cfx96 เวลาจริงระบบ ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Inc . ) ( เริ่มต้นที่ 95 C
สำหรับ 1 นาที ตามด้วยการเพิ่มรอบ 40 ( อุณหภูมิ
เปลี่ยนคะแนนของ 33 C / 2 ) ที่ระดับ C (
5 S และการหลอมและไพรเมอร์ส่วนขยายที่ 60 C เป็นเวลา 30 วินาที ด้วยการจัดหาเดียว
ขั้นตอนท้ายนามสกุล .
2.4 . seq