5. Separation and quantification of

5. Separation and quantification of thiol containing peptides
Arsenic- and Cd-treated (1000 mg L_1) leaf samples (500mg fresh wt) were homogenized in a stirrer (Yamato Labo-Stirrer,L- 35, Japan) in 5 mL of ice cold 50 mM Tris–Cl (Promega, USA and Wako Pure Chemical Ind. Ltd., Japan) buffer, pH 7.4, containing 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS; Sigma, USA). Homogenized samples were then centrifuged (Kubota 6200 Centrifuger, Japan) at 10,000×g for 30 min at 4 °C. The obtained supernatants were filtered through a 0.45-μm syringe-driven filter unit (Millipore, Billerica, USA) and immediately 3.0 mL of supernatant was on agel filtration column chromatography equipped with a column (1.1×110 cm2) containing Sephadex G-50 (Pharmacia, Sweden). The chromatography was carried out in the presence of 50 mM Tris–Cl buffer pH 7.4 (Schmoger et al.,2000) and eluted at a flow rate of 2.5 mL/min. Sixty fractions of the eluate (2 mL fraction size) were measured for As (using ICP-MS )or Cd (by AAS) andabsor- bance at 280 nm of each fraction using a UV/Vis spectro- photometer (Beckman, DU-65 Spectrophotometer, USA) for pro- tein quantification (Walker,1996). Thiol-containing peptides (GSH, PCs and related peptides) were detected at 412 nm after post column derivatization with Ellman's reagent (5-5′dithio(2-ni-trobenzoic acid); Sanita‘ di Toppi et al., 2007). For Cd-treated leaves, we again concentrated the Cd containing fractions and applied them to a gel filtration column chromatography equipped with a column (1.1×10cm2) containing Sephadex G-15 (Phar- macia, Sweden). The chromatography was carried out in the pre- sence of 50 mM Tris–Cl solution and eluted at a flow rate of 0.8 mL/min (Schmoger et al.,2000). Sixty fractions of the eluate (2 mL fraction size) were tested for Cd (by AAS), and Cd containing fractions were separated out. After drying these samples using a SpeedVac Concentrator SVC100H (Savant, USA), performic acid oxidation (Walker, 1996) was performed using 1.5 mL performic acid (HCOOH:H2O2=9:1) at 6°C for 24h. Again, samples were dried and analyzed for cysteine or cysteic acid and other amino acids using a High Performance Amino Acid Analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5. การแยกและการนับจำนวนที่ประกอบด้วยเปปไทด์ thiol สารหนู และ Cd-ธรรมดา (1000 มิลลิกรัม L_1) ตัวอย่างใบ (wt สด 500 มิลลิกรัม) ถูก homogenized ในการช้อนคน (Yamato อักช้อนคน L - 35 ญี่ปุ่น) ใน 5 มล.ของบัฟเฟอร์น้ำแข็งเย็น 50 มม.ทริสเรทติ้ง – Cl (Promega สหรัฐอเมริกา และ Wako เพียวเคมี ind. จำกัด ญี่ปุ่น) ค่า pH 7.4 ประกอบด้วย 0.1% โซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS ซิกม่า สหรัฐอเมริกา) การเก็บตัวอย่าง homogenized แล้วจาก (คูโบต้า 6200 Centrifuger ญี่ปุ่น) ที่ 10, 000 × g 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส Supernatants ได้รับการกรองผ่านหน่วยขับเคลื่อนเข็มกรอง 0.45 ไมครอน (มิลลิพอร์ Billerica สหรัฐอเมริกา) และทันที 3.0 mL ของ supernatant วันที่ agel กรอง chromatography คอลัมน์ที่ประกอบ ด้วยคอลัมน์ (cm2 ที่ 110 1.1 ×) ที่ประกอบด้วย Sephadex G-50 (ฟาร์ สวีเดน) Chromatography ที่ดำเนินการใน 50 มม.ทริสเรทติ้ง – Cl บัฟเฟอร์ pH 7.4 (Schmoger et al. 2000) และ eluted ที่อัตราการไหลของ 2.5 มล./นาทีหกสิบเศษ eluate (เศษขนาด 2 mL) ถูกวัดเป็น (ใช้ ICP MS) หรือซีดี (โดย AAS) andabsor-bance ที่ 280 nm ของแต่ละเศษส่วนใช้การรโฟโตโฟโตเครื่องวัดความสว่าง (Beckman สเปค DU-65 สหรัฐอเมริกา) สำหรับ pro เทียนนับ (Walker, 1996) เปปไทด์ที่ประกอบด้วย thiol (GSH พีซี และเปปไทด์ที่เกี่ยวข้อง) พบที่ 412 nm หลัง derivatization คอลัมน์โพสต์กับรีเอเจนต์ของ Ellman (5-5′dithio(2-ni-trobenzoic acid) ซานิตา ' di Toppi et al. 2007) ซีดีถือใบ เราอีกเข้มข้นซีดีที่ประกอบด้วยเศษส่วน และใช้คอลัมน์ chromatography กรองเจลพร้อมกับคอลัมน์ (1.1 × 10 ซม. 2) ที่ประกอบด้วย Sephadex G-15 (macia แครง สวีเดน) Chromatography ที่ดำเนินการในรู้สึกก่อน 50 มม.ทริสเรทติ้ง – Cl โซลูชัน และ eluted ที่อัตราการไหล 0.8 มิลลิลิตร/นาที (Schmoger et al. 2000) หกสิบเศษ eluate (เศษขนาด 2 mL) ถูกทดสอบสำหรับซีดี (โดย AAS), และเศษส่วนที่มีซีดีถูกแยกออก หลังจากแห้งตัวอย่างเหล่านี้โดยใช้การ SpeedVac หัว SVC100H (เมธี สหรัฐอเมริกา), performic ออกซิเดชันกรด (Walker, 1996) ได้ดำเนินการโดยใช้กรด performic 1.5 mL (HCOOH:H2O2 = 9:1) 6 ° c ใน 24 ชม อีกครั้ง ตัวอย่างแห้ง และวิเคราะห์สำหรับ cysteine หรือกรด cysteic และกรดอะมิโนอื่น ๆ ใช้วิเคราะห์กรดอะมิโนประสิทธิภาพที่สูง (บริษัทเทคโนโลยีสูงฮิตาชิ โตเกียว ญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5. การแยกและการหาปริมาณของเปปไทด์ที่มี thiol
Arsenic- และ CD-รับการรักษา (1000 มิลลิกรัม L_1) ตัวอย่างใบ (500mg น้ำหนักสด) ถูกปั่นในเครื่องกวน (ยามาโตะ Labo-กวน L- 35, ญี่ปุ่น) ในขนาด 5 ml ของน้ำแข็งเย็น ขนาด 50 มม Tris-Cl (Promega, สหรัฐอเมริกาและ Wako เพียวเคมี Ind จำกัด ประเทศญี่ปุ่น.) บัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 ที่มี 0.1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS; Sigma, สหรัฐอเมริกา) ตัวอย่างหดหายถูกปั่นแล้ว (คูโบต้า 6200 Centrifuger ญี่ปุ่น) 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ° C supernatants ได้ถูกกรองผ่าน 0.45 ไมครอนเข็มฉีดยาที่ขับเคลื่อนด้วยตัวกรองหน่วย (คบิลเลริกา, สหรัฐอเมริกา) และทันทีที่ 3.0 มิลลิลิตรของสารละลายอยู่ใน Agel คอลัมน์กรองพร้อมกับคอลัมน์ (1.1 × 110 cm2) ที่มี Sephadex G-50 ( Pharmacia, สวีเดน) โครมาโตได้ดำเนินการในการปรากฏตัวของขนาด 50 มม Tris-Cl บัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 (Schmoger et al., 2000) และชะที่อัตราการไหล 2.5 มิลลิลิตร / นาที หกสิบเศษของ eluate นี้ (2 มลส่วน) เป็นวัดสำหรับ As (ใช้ ICP-MS) หรือ CD (โดย AAS) andabsor- Bance ที่ 280 นาโนเมตรของแต่ละส่วนโดยใช้ UV / Vis spectro- มาตรวัด (เบคค์, DU-65 spectrophotometer, สหรัฐอเมริกา) สำหรับปริมาณ Tein โปร (วอล์คเกอร์, 1996) เปปไทด์ที่มี thiol (GSH พีซีและเปปไทด์ที่เกี่ยวข้อง) ได้รับการตรวจพบที่ 412 นาโนเมตรหลังจากอนุพันธ์คอลัมน์โพสต์กับน้ำยาของ Ellman (5-5'dithio (2-Ni-trobenzoic กรด);. ศา 'ดิ Toppi et al, 2007) สำหรับใบ Cd รับการรักษาเรามีความเข้มข้นอีกครั้ง Cd มีเศษส่วนและนำพวกเขาไปยังคอลัมน์กรองเจลพร้อมกับคอลัมน์ (1.1 × 10cm2) ที่มี Sephadex G-15 (Phar- Macia, สวีเดน) โครมาโตได้ดำเนินการในความรู้สึกก่อน 50 วิธีการแก้ปัญหา mM Tris-Cl และชะที่อัตราการไหล 0.8 มิลลิลิตร / นาที (Schmoger et al., 2000) เศษส่วนหกสิบของ eluate นี้ (2 มลส่วน) ได้มีการทดสอบสำหรับซีดี (โดย AAS) และ CD ที่มีเศษส่วนถูกแยกออก หลังจากการอบแห้งตัวอย่างเหล่านี้โดยใช้ SpeedVac Concentrator SVC100H (เมธี, สหรัฐอเมริกา), ออกซิเดชันกรด (วอล์คเกอร์, 1996) ได้ดำเนินการโดยใช้ 1.5 มลกรด (HCOOH: H2O2 = 9: 1) ที่ 6 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง อีกครั้งตัวอย่างแห้งและวิเคราะห์ cysteine ​​หรือกรด cysteic และกรดอะมิโนอื่น ๆ ที่ใช้วิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพสูงกรดอะมิโน (Hitachi สูง Technologies Corporation โตเกียวประเทศญี่ปุ่น)