layer were resuspended in 4 ml of t

layer were resuspended in 4 ml of the CPPD medium and
plated in 1 ml aliquots on filter paper placed on the
solidified R medium. About 2–3 weeks later small rooted
plantlets were transferred to a fresh R medium for further
growth. During plant regeneration the cultures were
maintained in a climate room at 26 ± 2C under 16 h
photoperiod and light intensity 55 lmol m-2
s
-1
.
If not mentioned otherwise, all media and solutions were
adjusted to pH 5.8 and autoclaved.
Rooted plants of cv. Dolanka with 3–4 leaves were
transplanted to the moss-coconut fiber substrate (Ceres
International) and acclimatized to ex vitro conditions for
2 weeks in a climate chamber at 20 ± 1C under 16 h
photoperiod and light intensity 30 lmol m-2
s
-1
. In the first
week the relative humidity was adjusted to 90% while in the
second week humidity was reduced by 2% every day. During
acclimatization, the plants were watered moderately.
Characterization of regenerants
Ploidy level of acclimatized plants was determined by flow
cytometry according to Kielkowska and Adamus (2010).
Potted plants were grown in the greenhouse for about
4 months and then they were vernalized for the next
3 months at 10 ± 2C to induce flowering. Pollen viability
was evaluated according to the Alexander’s procedure
(1969) based on differential staining of aborted (colored as
light green) and non-aborted grains (colored as magentared)
(Fig. 1p). When the stigma was receptive the flowers
were self-pollinated and seed set was scored.
Data collection and statistical analysis
Protoplast isolation efficiency was recorded using hemocytometer
and was expressed as protoplast number per
gram of fresh weight (fw) source tissue. Protoplast viability
was assessed by staining with fluorescein diacetate (FDA)
according to Anthony et al. (1999) on the first, second,
third, and sixth day of culture for cv. Dolanka and only on
the first day for the remaining accessions. Briefly, 60 ll of
0.3% filter-sterilized FDA acetone stock solution was
dissolved in 4 ml of culture medium to prepare FDA
working solution. 100 ll of that solution was added to the
Petri dish with culture of immobilized protoplasts. Applegreen
fluorescence of live cells (Fig. 1e) was examined
under Zeiss Axiovert S100 microscope equipped with
the appropriate filter set (kEx = 485 nm, kEm = 515 nm).
The percentage of cell colonies formation (number of cell
colonies/total number of observed protoplasts 9 100) was
determined and expressed as plating efficiency. Additionally,
in the first experiments with Dolanka the number of
two-, four-, and multi-cell colonies was determined at the
same time points.
The treatments were set up in three replicates, 3–4
independent experiments were carried out. For protoplast
viability and colony formation, counting was carried out in
five microscopic fields on 100–300 cells per Petri dish.
The mean values and standard errors were calculated.
The overall effect of treatments was assessed using analysis
of variance (ANOVA) and Tukey’s honestly signifi-
cant difference (HSD) test in Statistica 8.0 (Stat Soft. Inc.).
R

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ชั้นถูก resuspended ใน 4 ml ของกลาง CPPD และชุบใน 1 มล. aliquots บนกระดาษกรองที่วางอยู่บนการเสริมความมั่นคงปานกลาง R หลังเล็ก ๆ ประมาณ 2-3 สัปดาห์รากplantlets ถูกโอนปานกลาง R สดสำหรับเพิ่มเติมเจริญเติบโต ในระหว่างการฟื้นฟูโรงงาน วัฒนธรรมได้รักษาในห้องพักอากาศที่ 26 ± 2C 16 ชมช่วงแสงและความเข้มแสง 55 lmol m-2s-1.ถ้าไม่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น สื่อและโซลูชั่นทั้งหมดได้ปรับค่า pH 5.8 และนึ่งพืชรากของพันธุ์ Dolanka มีใบ 3 – 4 มีมาพื้นผิวเส้นใยมะพร้าวมอส (Ceresนานาชาติ และ acclimatized ให้เช่นเงื่อนไขของหลอดทดลอง2 สัปดาห์ในห้องอากาศที่ 20 ± 1C 16 ชมช่วงแสงและความเข้มแสง 30 lmol m-2s-1. ในครั้งแรกปรับปรุงความชื้นสัมพัทธ์ 90% ในขณะที่ในสัปดาห์นี้สัปดาห์สองความชื้นลดลง 2% ทุกวัน ในระหว่างการacclimatization พืชถูกรดน้ำปานกลางสมบัติของ regenerantsพล็อยดีระดับ acclimatized พืชถูกกำหนด โดยไหลตรวจวิเคราะห์เซลล์ตาม Kielkowska และ Adamus (2010)กระถางที่ปลูกในเรือนกระจกสำหรับเกี่ยวกับ4 เดือน และพวกเขาได้ vernalized สำหรับถัดไปเดือนที่ 10 ± 2C ก่อให้เกิดดอกการ ชีวิตเกสรรับการประเมินตามขั้นตอนของอเล็กซานเดอร์ยกเลิก (1969) ตามต่างย้อม (สีเป็นแสงสีเขียว) และเมล็ดที่ไม่ได้ถูกยกเลิก (สีเป็น magentared)(รูปที่ 1 p) เมื่อความอัปยศถูกเปิดกว้างดอกไม้มี self-pollinated และเมล็ดชุดถูกยิงได้รวบรวมข้อมูลและวิเคราะห์ทางสถิติประสิทธิภาพการแยก protoplast ถูกบันทึกโดยใช้ hemocytometerและถูกแสดงเป็นเลข protoplast ต่อกรัมของเนื้อเยื่อของต้นน้ำหนักสด (fw) ชีวิต protoplastถูกประเมิน โดยการย้อมสีด้วย fluorescein diacetate (FDA)ตาม Anthony et al. (1999) ที่หนึ่ง ที่สองสาม และหก วันวัฒนธรรม สำหรับพันธุ์ Dolanka เท่านั้นวันที่แรกสำหรับ accessions เหลือ สั้น ๆ 60 จะของ0.3% กรองฆ่าเชื้อ FDA โตนหุ้นเป็นละลายใน 4 ml ของวัฒนธรรมกลางเตรียม FDAการแก้ไขปัญหาการทำงาน 100 ll ของโซลูชันที่ถูกเพิ่มไปจานเพาะเชื้อกับวัฒนธรรมการตรึงพลาสต์ Applegreenมีการตรวจสอบการเรืองแสงของเซลล์สด (รูปที่ 1e)ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Zeiss Axiovert S100 พร้อมการตั้งค่าตัวกรองที่เหมาะสม (เก๊ก = 485 nm เก็ม = 515 nm)เปอร์เซ็นต์ของการสร้างอาณานิคมเซลล์ (จำนวนของเซลล์อาณานิคม/รวมจำนวนของพลาสต์สังเกต 9 100)กำหนด และแสดงเป็นชุบอย่างมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ในครั้งแรกจากการทดลองกับ Dolanka จำนวนกำหนดสอง สี่ และอาณานิคมหลายเซลล์ในการจุดเวลาเดียวกันรักษาที่ตั้งขึ้นในเหมือนกับ 3, 3-4อิสระทดลองดำเนินการ สำหรับ protoplastชีวิตและก่อตั้งอาณานิคม นับถูกดำเนินการฟิลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ห้าบนเซลล์ 100 – 300 ต่อจานเพาะเชื้อมีคำนวณค่าเฉลี่ยและข้อผิดพลาดมาตรฐานรับการประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ผลรวมของการรักษาความแปรปรวน (ANOVA) และของ Tukey สุจริตความไม่แตกต่าง (HSD) ทดสอบใน Statistica 8.0 (สถิตินุ่ม Inc.)R

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ชั้นถูก resuspended 4 มล. ของกลาง CPPD
และชุบใน1 มิลลิลิตร aliquots
บนกระดาษกรองที่วางอยู่บนกลางR แข็ง ประมาณ 2-3 สัปดาห์ต่อมาฝังรากเล็ก ๆ
ต้นถูกย้ายไปเป็นสื่อ R
สดต่อการเจริญเติบโต ในระหว่างการฟื้นฟูโรงงานวัฒนธรรมที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ในห้องพักสภาพภูมิอากาศที่ 26 ± 2C อายุต่ำกว่า 16 ชั่วโมงต่อช่วงแสงและความเข้มของแสง55 ม. lmol-2 s -1. หากไม่ได้กล่าวถึงเป็นอย่างอื่นทุกสื่อและการแก้ปัญหาที่ถูกปรับให้มีค่า pH 5.8 และเบา. พืชราก พันธุ์ Dolanka 3-4 ใบถูกย้ายไปยังพื้นผิวเส้นใยมะพร้าวมอส(Ceres นานาชาติ) และปรับสภาพอดีตหลอดทดลองเงื่อนไขใน2 สัปดาห์ที่ผ่านมาในห้องสภาพภูมิอากาศที่ 20 ± 1C ชั่วโมง 16 ภายใต้แสงและความเข้มของแสง30 ม. lmol-2 s - 1 ในครั้งแรกสัปดาห์ความชื้นสัมพัทธ์มีการปรับถึง 90% ในขณะที่ความชื้นสัปดาห์ที่สองลดลง2% ทุกวัน ในช่วงเคยชินกับสภาพพืชถูกรดน้ำปานกลาง. the ลักษณะของเพาะระดับ ploidy ของพืชปรับสภาพถูกกำหนดโดยการไหลของภูมิคุ้มกันตามKielkowska และ Adamus (2010). ไม้กระถางปลูกในเรือนกระจกประมาณ4 เดือนและจากนั้นพวกเขาก็ถูก vernalized สำหรับถัดไป3 เดือนที่ 10 ± 2C เพื่อก่อให้เกิดการออกดอก ความมีชีวิตของละอองเกสรถูกประเมินตามขั้นตอนของอเล็กซานเด(1969) ตามความแตกต่างของการย้อมสียกเลิก (สีเป็นสีเขียวอ่อน) และธัญพืชที่ไม่ยกเลิก (สีเป็น magentared) (รูป. 1p) เมื่อปานได้เปิดกว้างดอกไม้ที่ได้รับการผสมตัวเองและติดเมล็ดได้รับคะแนน. การเก็บรวบรวมข้อมูลและการวิเคราะห์ทางสถิติประสิทธิภาพการแยกโปรโตพลาถูกบันทึกโดย hemocytometer และได้รับการแสดงเป็นจำนวนโปรโตพลาต่อกรัมน้ำหนักสด (จืด) เนื้อเยื่อแหล่งที่มา โปรโตพลามีชีวิตได้รับการประเมินโดยการย้อมสีที่มี fluorescein diacetate (FDA) ตามที่แอนโธนีและอัล (1999) ในครั้งแรกที่สองสามและวันที่หกของวัฒนธรรมสำหรับพันธุ์ Dolanka และเฉพาะในวันแรกสำหรับสายที่เหลือ สั้น ๆ , 60 LL ของ0.3% อะซีโตนองค์การอาหารและยาฆ่าเชื้อกรองหุ้นวิธีการแก้ปัญหาที่ถูกกลืนหายไปใน4 มล. ของกลางวัฒนธรรมองค์การอาหารและยาเพื่อเตรียมความพร้อมการแก้ปัญหาการทำงาน 100 LL ของการแก้ปัญหาที่ถูกเพิ่มลงในจานเลี้ยงเชื้อที่มีวัฒนธรรมของโปรโตพลาตรึง APPLEGREEN การเรืองแสงของเซลล์สด (รูป. 1e) ได้รับการตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์Zeiss Axiovert S100 มาพร้อมกับชุดกรองที่เหมาะสม(KEX = 485 นาโนเมตร Kem = 515 นาโนเมตร). ร้อยละของอาณานิคมมือถือรูปแบบ (จำนวนเซลล์โคโลนี/ จำนวน สังเกต protoplasts 9 100) ได้รับการพิจารณาและแสดงประสิทธิภาพชุบ นอกจากนี้ในการทดลองครั้งแรกกับ Dolanka จำนวนสอง, สี่และอาณานิคมหลายเซลล์ที่ถูกกำหนดที่จุดในเวลาเดียวกัน. การรักษาได้รับการจัดตั้งขึ้นในสามซ้ำ 3-4 ทดลองที่เป็นอิสระได้ดำเนินการ สำหรับโปรโตพลามีชีวิตและการสร้างอาณานิคมนับได้ดำเนินการในห้าสาขากล้องจุลทรรศน์ใน100-300 เซลล์ต่อจานเลี้ยงเชื้อ. ค่าเฉลี่ยมาตรฐานและข้อผิดพลาดจะถูกคำนวณ. ผลกระทบโดยรวมของการรักษาที่ได้รับการประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) และตรงไปตรงมาของ Tukey signifi- แตกต่างลาดเท (HSD) การทดสอบใน Statistica 8.0 (สถิติของซอฟท์. Inc). R

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ชั้นเป็น resuspended 4 ml ของ cppd ขนาดกลางชุบ 1 ml เฉยๆบนกระดาษกรองวางบนแข็ง R ) ประมาณ 2 3 สัปดาห์ต่อมา และขนาดเล็ก รากต้นเป็นโอนไปยังตัวกลาง r สดต่อไปการเจริญเติบโต ในระหว่างการปลูกวัฒนธรรมคือรักษาในบรรยากาศห้องพักที่ 26 ± 2C ภายใต้ 16 ชั่วโมงแสงและความเข้มแสง 55 lmol ด้วยs- 1.ถ้าไม่กล่าวถึงสื่อทั้งหมดและโซลูชั่นอื่นปรับ pH 5.8 และ สังเคราะห์ .รากของพืชพันธุ์ dolanka 3 – 4 ใบ คือต้นมอสใยมะพร้าวแผ่น ( เซเรสนานาชาติ ) และปรับสภาพสภาพหลอด EX สำหรับ2 สัปดาห์ ในบรรยากาศห้องที่ 20 ± 1C ภายใต้ 16 ชั่วโมงแสงและความเข้มแสง 30 lmol ด้วยs- 1. ในที่แรกสัปดาห์ปรับความชื้นสัมพัทธ์ 90% ในขณะที่ในสัปดาห์ที่สอง ความชื้นลดลง 2 % ทุกวัน ระหว่างการ , ปลูกรดน้ำปานกลางคุณสมบัติของ regenerantsการปรับสภาพพืชที่ถูกกำหนดโดยระดับของการไหล( ตาม kielkowska และ adamus ( 2010 )ไม้กระถางที่ปลูกในโรงเรือน ประมาณ4 เดือนแล้วที่พวกเขาอายุ สำหรับถัดไป3 เดือนที่ 10 ± 2c เพื่อให้เกิดดอก ความมีชีวิตของละอองเกสรประเมินไปตามขั้นตอนของอเล็กซานเดอร์( 1969 ) ตามความแตกต่างของการย้อม ( สีเป็นสีเขียวอ่อน ) และไม่ยกเลิกธัญพืช ( สีเป็น magentared )( รูปที่ 1 ) เมื่อความอ่อนไหวดอกไม้คือถูกตนเองผสมเมล็ดชุดคะแนนการเก็บรวบรวมข้อมูลและการวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติประสิทธิภาพการแยกโปรโตพลาสต์ที่ถูกบันทึกไว้โดยใช้ hemocytometerและแสดงเป็นโปรหมายเลขต่อกรัมน้ำหนักสด ( FW ) เนื้อเยื่อแหล่ง และโปรโตพลาสต์ประเมินโดยการย้อมด้วยี่ ( FDA ) ได ซิเตทตามแอนโทนี et al . ( 1999 ) ที่ 1 , 2 ,3 วันและหกของวัฒนธรรม คือ dolanka และบนวันแรกสำหรับสายพันธุ์ที่เหลืออยู่ 60 จะสั้น ๆ0.3% กรองสารละลายฆ่าเชื้อ FDA สำหรับหุ้นละลายใน 4 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมอาหารทำงานแก้ปัญหา 100 จะโซลูชั่นที่เพิ่มไปจานเพาะเชื้อที่มีวัฒนธรรมของการตรึงเอนไซม์ . แอปเปิ้ลกรีนเรืองแสงของเซลล์ ( รูปที่ 1e ) คือการตรวจสอบอยู่ภายใต้กล้องจุลทรรศน์พร้อม s100 Zeiss axiovertเหมาะสมการตั้งค่ากรอง ( KEX = 485 นาโนเมตร เขม = 515 nm )ร้อยละของจำนวนเซลล์ ( เซลล์สร้างอาณานิคมอาณานิคม / จำนวนที่สังเกตพบ 9 100 )กำหนดและแสดงเป็นชุบประสิทธิภาพ นอกจากนี้ในการทดลองครั้งแรกกับ dolanka จํานวนสอง - สี่ - และหลายเซลล์อาณานิคมถูกกำหนดที่จุดเวลาเดียวกันวิธีตั้งค่าใน 3 แบบ , 3 – 4การทดลองที่เป็นอิสระ พบว่า สำหรับโปรโตพลาสต์ความมีชีวิตและการสร้างอาณานิคม นับเป็นการทดลองในห้าสาขา 100 – 300 เซลล์ต่อจานเพาะเชื้อ ด้วยกล้องจุลทรรศน์ค่าเฉลี่ย ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน และได้ผลกระทบโดยรวมของการรักษา คือ การประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน ( ANOVA ) และทดสอบ signifi - จริงๆความแตกต่างลาดเท ( HSD ) ทดสอบใน statistica 8.0 ( stat ที่อ่อนนุ่ม อิงค์ )อาร์