1. IntroductionPhytoplasmas are non

1. Introduction
Phytoplasmas are non-helical mollicutes causing diseases characterized by flower malformation, growth aberrations, yellowing and/or decline in many plant species (Seemuller et al., 1998 and Lee et al., 2000). Phytoplasmal diseases are spread by leaf hoppers and plant hoppers besides spread by vegetative propagation through cuttings, storage tubers, rhizomes or bulbs. In recent years molecular methods have been used to identify and differentiate diverse phytoplasmas. Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences and/or RFLP analysis of PCR amplified 16S rDNA sequences were used to differentiate various phytoplasmas (Lee et al., 1993 and Seemuller et al., 1998). Based on the phylogenetic analysis of 16S rDNA gene sequence, 20 distinct phytoplasma groups were identified (Seemuller et al., 1998).

Black pepper, obtained from dried berries of Piper nigrum L., is an important spice of international commerce for many south east Asian countries. India is a leading producer of black pepper in the world and the crop is grown in an area of 1,89,804 ha with a production of 71,160 mt (Source: International Pepper Community, Jakarta, Indonesia). Phyllody disease on black pepper was first reported during 1986 from Wyanad District of Kerala, India ( Sarma et al., 1988). The disease was characterized by malformation of the entire spike and the affected vines showed conspicuous tufts of malformed branches giving a witches broom appearance with yellowing symptoms that were well discernible from a distance ( Sarma et al., 1988). In a recent survey, the occurrence of the disease was also reported from other black pepper growing regions of Kerala state, India. The incidence of the disease was severe in areas adjacent to forests and association of two types of plant hoppers was seen with diseased vines ( Anonymous, 2002). Based on the symptomatology, involvement of a phytoplasma was suspected in the disease. This paper reports the cloning and sequencing of 1.2 kb fragment of 16S rDNA of the phytoplasma from phyllody disease affected black pepper and its identification.

2. Materials and methods
2.1. Phyllody isolates and nucleic acid extraction

Ten phyllody disease affected black pepper samples collected from Kozhikode District of Kerala state, India were used in this study. Spikes collected from asymptomatic black pepper plants from Kannur District of Kerala state, India were used as healthy control. Total DNAs were extracted from healthy and malformed black pepper spikes using DNA Plant kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany). Total DNAs extracted from a known phytoplasma (periwinkle little leaf) was used as positive control. Water control (without template DNA) was also included in all the PCR reaction to check for contamination if any.

2.2. Nested PCR

The total genomic DNA was subjected to nested PCR using universal primers designed to amplify a specific sequence within the 16S rDNA of phytoplasmas (Gundersen and Lee, 1996). Primers P6 (5′ CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3′) (Deng and Hiruki, 1991) and SN910601 (5′ CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3′) (Namba et al., 1993) were used for the first round amplification of the 16S rDNAs. For the second round, to amplify an internal fragment of the 16S rDNA, primers R16F2n (5′ GAAACGACTGCTAAGACTGG 3′) corresponding to bases 144–163 and R16R2 (5′ TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3′) corresponding to bases 1365–1386 (Lee et al., 1993) were used. The PCR reaction (100 μl) contained 200 ng each of the primers, 2.5 units Taq Polymerase 1× PCR buffer, 1.25 mM MgCl2 and 10 μM each of the dNTPs. PCR mix (27 μl) containing the above components was added to the tubes containing the template DNA (73 μl) resulting in a final reaction volume of 100 μl. Amplification was performed in an automated thermal cycler (Eppendorf Master Cycler Gradient) programmed for one cycle of 94 °C for 3 min followed by 35 cycle reaction profile involving 30 s of denaturation at 94 °C, 60 s of annealing at 53 °C and 90 s of extension at 72 °C and single cycle of final extension at 72 °C for 10 min for the first round amplification. The reaction product (1 μl) of first round amplification was used as template for the second round of amplification with similar reaction profile except for the annealing step, which was carried out at 56 °C (instead of 53 °C).

2.3. Cloning of PCR product and sequencing

Following PCR, reaction products were analysed by 1% agarose gel electrophoresis in Tris–acetate EDTA (TAE) buffer containing ethidium bromide (0.4 μg/ml). DNA was visualized and photographed using a UV transilluminator and a gel documentation apparatus (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). 500 bp ladder was used as a size standard. The PCR product was purified using Strata Prep PCR purification kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) followed by polishing the purified PCR product using Pfu DNA Polymerase (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and dNTP mix. The resultant product was then cloned into pPCR Script Amp SK (+) cloning vector using pPCR Script Amp SK (+) cloning vector kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and competent Escherichia coli (strain DH5α) were transformed by following standard molecular biology procedures ( Sambrook and Russell, 2001). Recombinant clones were identified by restriction endonuclease digestion, and selected clones were sequenced with automated sequencing of Applied Biosystems (ABI prism) following dideoxy chain terminator sequencing protocol (Perkin-Elmer).

2.4. Sequence analyses

Sequence data were compiled using Seqaid Version 3.6 (Rhoads and Roufa, 1985). Multiple sequence alignments were made using Clustal W (Thompson et al., 1994). Phylogenetic tree was constructed by Neighborhood Joining Bootstrap method (Bootstrap analysis with 1000 replicates) in Clustal X (1.81) and rooted tree was generated using TREEVIEW software (Win 32) (Page, 1996). The 16S rDNA nucleotide sequences of other phytoplasma isolates used for comparison (Table 1) were obtained from GenBank (Benson et al., 1999). The BLAST programme (Altschul et al., 1997) was used to identify related sequences available from the GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำPhytoplasmas เป็น mollicutes ไม่ใช่ helical ก่อให้เกิดโรคโดยดอกไม้ malformation, aberrations เจริญเติบโต สีเหลือง และ/หรือปฏิเสธในพืชหลายชนิด (Seemuller et al., 1998 และลีและ al., 2000) Phytoplasmal โรคแพร่กระจายไปตามกรวยใบไม้ และพืชกรวยจึง แพร่กระจาย โดยการแพร่กระจายผักเรื้อรัง cuttings เก็บ tubers เหง้า หรือหลอดไฟ ในปีที่ผ่านมา วิธีการระดับโมเลกุลได้ถูกใช้เพื่อระบุ และแยกความแตกต่างหลากหลาย phytoplasmas วิเคราะห์ phylogenetic 16S rDNA ลำดับและ/หรือการวิเคราะห์ RFLP ของ PCR ขยาย 16S rDNA ลำดับใช้เพื่อแบ่งแยกต่าง ๆ phytoplasmas (Lee et al., 1993 และ Seemuller และ al., 1998) จากการวิเคราะห์ phylogenetic 16S rDNA ยีนลำดับ กลุ่ม phytoplasma หมด 20 ได้ระบุ (Seemuller et al., 1998)Black pepper, obtained from dried berries of Piper nigrum L., is an important spice of international commerce for many south east Asian countries. India is a leading producer of black pepper in the world and the crop is grown in an area of 1,89,804 ha with a production of 71,160 mt (Source: International Pepper Community, Jakarta, Indonesia). Phyllody disease on black pepper was first reported during 1986 from Wyanad District of Kerala, India ( Sarma et al., 1988). The disease was characterized by malformation of the entire spike and the affected vines showed conspicuous tufts of malformed branches giving a witches broom appearance with yellowing symptoms that were well discernible from a distance ( Sarma et al., 1988). In a recent survey, the occurrence of the disease was also reported from other black pepper growing regions of Kerala state, India. The incidence of the disease was severe in areas adjacent to forests and association of two types of plant hoppers was seen with diseased vines ( Anonymous, 2002). Based on the symptomatology, involvement of a phytoplasma was suspected in the disease. This paper reports the cloning and sequencing of 1.2 kb fragment of 16S rDNA of the phytoplasma from phyllody disease affected black pepper and its identification.2. Materials and methods2.1. Phyllody isolates and nucleic acid extractionTen phyllody disease affected black pepper samples collected from Kozhikode District of Kerala state, India were used in this study. Spikes collected from asymptomatic black pepper plants from Kannur District of Kerala state, India were used as healthy control. Total DNAs were extracted from healthy and malformed black pepper spikes using DNA Plant kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany). Total DNAs extracted from a known phytoplasma (periwinkle little leaf) was used as positive control. Water control (without template DNA) was also included in all the PCR reaction to check for contamination if any.
2.2. Nested PCR

The total genomic DNA was subjected to nested PCR using universal primers designed to amplify a specific sequence within the 16S rDNA of phytoplasmas (Gundersen and Lee, 1996). Primers P6 (5′ CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3′) (Deng and Hiruki, 1991) and SN910601 (5′ CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3′) (Namba et al., 1993) were used for the first round amplification of the 16S rDNAs. For the second round, to amplify an internal fragment of the 16S rDNA, primers R16F2n (5′ GAAACGACTGCTAAGACTGG 3′) corresponding to bases 144–163 and R16R2 (5′ TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3′) corresponding to bases 1365–1386 (Lee et al., 1993) were used. The PCR reaction (100 μl) contained 200 ng each of the primers, 2.5 units Taq Polymerase 1× PCR buffer, 1.25 mM MgCl2 and 10 μM each of the dNTPs. PCR mix (27 μl) containing the above components was added to the tubes containing the template DNA (73 μl) resulting in a final reaction volume of 100 μl. Amplification was performed in an automated thermal cycler (Eppendorf Master Cycler Gradient) programmed for one cycle of 94 °C for 3 min followed by 35 cycle reaction profile involving 30 s of denaturation at 94 °C, 60 s of annealing at 53 °C and 90 s of extension at 72 °C and single cycle of final extension at 72 °C for 10 min for the first round amplification. The reaction product (1 μl) of first round amplification was used as template for the second round of amplification with similar reaction profile except for the annealing step, which was carried out at 56 °C (instead of 53 °C).

2.3. Cloning of PCR product and sequencing

Following PCR, reaction products were analysed by 1% agarose gel electrophoresis in Tris–acetate EDTA (TAE) buffer containing ethidium bromide (0.4 μg/ml). DNA was visualized and photographed using a UV transilluminator and a gel documentation apparatus (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). 500 bp ladder was used as a size standard. The PCR product was purified using Strata Prep PCR purification kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) followed by polishing the purified PCR product using Pfu DNA Polymerase (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and dNTP mix. The resultant product was then cloned into pPCR Script Amp SK (+) cloning vector using pPCR Script Amp SK (+) cloning vector kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and competent Escherichia coli (strain DH5α) were transformed by following standard molecular biology procedures ( Sambrook and Russell, 2001). Recombinant clones were identified by restriction endonuclease digestion, and selected clones were sequenced with automated sequencing of Applied Biosystems (ABI prism) following dideoxy chain terminator sequencing protocol (Perkin-Elmer).

2.4. Sequence analyses

Sequence data were compiled using Seqaid Version 3.6 (Rhoads and Roufa, 1985). Multiple sequence alignments were made using Clustal W (Thompson et al., 1994). Phylogenetic tree was constructed by Neighborhood Joining Bootstrap method (Bootstrap analysis with 1000 replicates) in Clustal X (1.81) and rooted tree was generated using TREEVIEW software (Win 32) (Page, 1996). The 16S rDNA nucleotide sequences of other phytoplasma isolates used for comparison (Table 1) were obtained from GenBank (Benson et al., 1999). The BLAST programme (Altschul et al., 1997) was used to identify related sequences available from the GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1.
บทนำไฟโตพลาสมามีmollicutes ที่ไม่ก่อให้เกิดโรคลานโดดเด่นด้วยจุกดอกไม้ผิดปกติการเจริญเติบโตสีเหลืองและ / หรือลดลงในพืชหลายชนิด (Seemuller et al., 1998 และลี et al., 2000) โรค Phytoplasmal จะแพร่กระจายโดยกรวยและกรวยใบพืชนอกเหนือจากการแพร่กระจายโดยการขยายพันธุ์พืชที่ผ่านการตัดหัวจัดเก็บเหง้าหรือหลอดไฟ ในปีที่ผ่านวิธีการโมเลกุลที่มีการใช้ในการระบุและแยกความแตกต่างที่หลากหลายไฟโตพลาสมา การวิเคราะห์วิวัฒนาการของ 16S rDNA ลำดับและ / หรือการวิเคราะห์ RFLP ของ PCR ขยาย 16S rDNA ลำดับถูกนำมาใช้เพื่อความแตกต่างไฟโตพลาสมาต่างๆ (Lee et al., 1993 และ Seemuller et al., 1998) ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของยีน 16S rDNA 20 กลุ่มที่แตกต่างกัน phytoplasma ถูกระบุ (Seemuller et al., 1998). พริกไทยดำ, ที่ได้รับจากผลเบอร์รี่แห้งพริกไทยลิตรเป็นเครื่องเทศที่สำคัญของการค้าระหว่างประเทศเพื่อการตะวันออกเฉียงใต้จำนวนมาก ประเทศในเอเชีย อินเดียเป็นผู้ผลิตชั้นนำของพริกไทยดำในโลกและพืชที่ปลูกในพื้นที่ของ 1,89,804 ฮ่ากับการผลิต 71,160 ตัน (ที่มา: นานาชาติพริกไทยชุมชนกรุงจาการ์ตาประเทศอินโดนีเซีย) โรค Phyllody ในพริกไทยดำมีรายงานครั้งแรกในช่วง 1986 จาก Wyanad อำเภอ Kerala อินเดีย (Sarma et al., 1988) โรคก็มีลักษณะไม่สมประกอบของเข็มทั้งหมดและเถาได้รับผลกระทบที่เห็นได้ชัดเจนที่แสดงให้เห็นกระจุกอยู่ในรูปแบบของสาขาให้แม่มดลักษณะไม้กวาดที่มีอาการเหลืองที่ถูกมองเห็นได้ดีจากระยะไกล (ที่ Sarma et al., 1988) ในการสำรวจล่าสุดที่เกิดขึ้นของโรคที่มีรายงานจากพริกไทยดำอื่น ๆ ในภูมิภาคที่เพิ่มขึ้นของรัฐเกรละอินเดีย อุบัติการณ์ของโรคที่รุนแรงในพื้นที่ที่อยู่ติดกับป่าไม้และความสัมพันธ์ของทั้งสองประเภทของเพลี้ยก็เห็นด้วยเถาโรค (ไม่ประสงค์ออกนาม, 2002) ขึ้นอยู่กับอาการที่มีส่วนร่วมของ phytoplasma ถูกสงสัยว่าในการเกิดโรค กระดาษนี้รายงานการโคลนและการหาลำดับเบสของชิ้นส่วน 1.2 กิโลของ 16S rDNA ของ phytoplasma จากโรค phyllody ได้รับผลกระทบพริกไทยดำและบัตรประจำตัวของ. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 Phyllody แยกและการสกัดกรดนิวคลีอิกสิบโรคphyllody ได้รับผลกระทบตัวอย่างพริกไทยดำที่เก็บรวบรวมจากเขต Kozhikode แห่งรัฐเกรละอินเดียถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ แหลมที่เก็บได้จากพืชพริกไทยดำไม่มีอาการจากนูร์เขตรัฐเกรละอินเดียถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมที่มีสุขภาพดี DNAs ทั้งหมดถูกสกัดจากสุขภาพดีและไม่ถูกต้องแหลมพริกไทยดำโดยใช้ชุดดีเอ็นเอ Plant (Macherey-แจคกี้ Duren, เยอรมนี) รวมดีเอ็นเอที่สกัดจาก phytoplasma ที่รู้จักกัน (หอยขมใบเล็ก ๆ ) ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก การควบคุมน้ำ (ไม่ดีเอ็นเอแม่แบบ) ก็รวมอยู่ในทุกปฏิกิริยา PCR ในการตรวจสอบการปนเปื้อนถ้ามี. 2.2 PCR ซ้อนดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่ถูกยัดเยียดให้PCR ที่ซ้อนกันโดยใช้ไพรเมอร์สากลที่ออกแบบมาเพื่อขยายลำดับที่เฉพาะเจาะจงภายใน 16S rDNA ของไฟโตพลาสมา (Gundersen และลี, 1996) ไพรเมอร์ P6 (5 'CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3') (เติ้งและ Hiruki, 1991) และ SN910601 (5 'CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3') (Namba et al., 1993) ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายรอบแรกของ 16S rDNAs สำหรับรอบที่สองเพื่อขยายชิ้นส่วนภายในของ 16S rDNA ไพรเมอร์ R16F2n (5 'GAAACGACTGCTAAGACTGG 3') ที่สอดคล้องกับฐาน 144-163 และ R16R2 (5 'TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3') ที่สอดคล้องกับฐาน 1365-1386 (Lee et al, , 1993) ถูกนำมาใช้ ปฏิกิริยา PCR (100 ไมโครลิตร) ที่มี 200 ng แต่ละไพรเมอร์ 2.5 หน่วย Taq โพลิเมอร์ 1 ×บัฟเฟอร์ PCR 1.25 มิลลิ MgCl2 และ 10 ไมครอนแต่ละ dNTPs ผสม PCR (27 ไมโครลิตร) ที่มีส่วนประกอบดังกล่าวข้างต้นถูกบันทึกอยู่ในท่อที่มีแม่แบบดีเอ็นเอ (73 ไมโครลิตร) ส่งผลให้ปริมาณการเกิดปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 ไมโครลิตร ขยายได้ดำเนินการใน Cycler ความร้อนอัตโนมัติ (Eppendorf โท Cycler ไล่โทนสี) โปรแกรมสำหรับหนึ่งรอบ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบรายละเอียดปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับวันที่ 30 ของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ° C 60 ของการอบที่ 53 องศาเซลเซียสและ 90 ของส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสและรอบเดียวของการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีสำหรับการขยายรอบแรก ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา (1 ไมโครลิตร) ของการขยายรอบแรกถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบที่สองของการขยายปฏิกิริยากับโปรไฟล์ที่คล้ายกันยกเว้นสำหรับขั้นตอนการอบซึ่งได้ดำเนินการที่ 56 ° C (แทน 53 ° C). 2.3 โคลนของผลิตภัณฑ์ PCR และลำดับต่อไปนี้PCR ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาวิเคราะห์ 1% agarose ข่าวคราวใน EDTA Tris-acetate (TAE) บัฟเฟอร์ที่มี ethidium bromide (0.4 g / ml) ดีเอ็นเอถูกมองเห็นและถ่ายภาพโดยใช้ transilluminator รังสียูวีและอุปกรณ์เอกสารเจล (อัลฟา Innotech คอร์ปอเรชั่น, CA, USA) 500 bp บันไดที่ใช้เป็นขนาดมาตรฐาน ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์โดยใช้ชุดฟอกชั้นเตรียม PCR (Stratagene, LaJolla, CA, USA) ตามด้วยการขัดผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์โดยใช้ Pfu ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Stratagene, LaJolla, CA, USA) และการผสมผสาน dNTP ผลิตภัณฑ์ผลเป็นโคลนแล้วเป็น pPCR สคริปต์แอมป์เอสเค (+) โคลนเวกเตอร์ใช้ pPCR สคริปต์แอมป์เอสเค (+) โคลนชุดเวกเตอร์ (Stratagene, LaJolla, CA, USA) และมีอำนาจเชื้อ Escherichia coli (สายพันธุ์DH5α) ถูกเปลี่ยนโดยทำตามโมเลกุลมาตรฐาน ขั้นตอนทางชีววิทยา (Sambrook และรัสเซล, 2001) โคลน recombinant ถูกระบุข้อ จำกัด endonuclease การย่อยอาหารและโคลนที่เลือกมีลำดับขั้นตอนที่มีการเรียงลำดับอัตโนมัติของ Applied Biosystems (ปริซึม ABI) ดังต่อไปนี้เทอร์มิโซ่ dideoxy โปรโตคอลลำดับ (เพอร์กินเอลเมอ). 2.4 ลำดับวิเคราะห์ข้อมูลลำดับถูกรวบรวมโดยใช้ Seqaid เวอร์ชั่น 3.6 (โรดห์และ Roufa, 1985) การจัดแนวหลายลำดับที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Clustal วัตต์ (ธ อมป์สัน et al., 1994) Phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้นจากพื้นที่ใกล้เคียงเข้าร่วมวิธีการบูต (วิเคราะห์ Bootstrap 1000 ซ้ำ) ใน Clustal X (1.81) และต้นไม้ที่หยั่งรากถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ TREEVIEW (Win 32) (หน้า 1996) 16S rDNA ลำดับเบสของแยก phytoplasma อื่น ๆ ที่ใช้สำหรับการเปรียบเทียบ (ตารางที่ 1) ที่ได้รับจาก GenBank (เบนสัน et al., 1999) โปรแกรม BLAST (Altschul et al., 1997) ถูกนำมาใช้เพื่อระบุลำดับที่เกี่ยวข้องที่มีอยู่จากฐานข้อมูล GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . phytoplasmas บทนำ
ไม่ใช่ลาน mollicutes ก่อให้เกิดโรคลักษณะผิดปกติของดอกไม้ , การเจริญเติบโต , สีเหลืองและ / หรือปฏิเสธในพืชหลายชนิด ( seemuller et al . , 1998 และลี et al . , 2000 ) phytoplasmal โรคจะแพร่กระจายโดยกรวยและกรวยใบพืชและการขยายพันธุ์นอกจากแพร่กระจายโดยผ่านการตัด และกระเป๋า , เหง้าหรือหลอดไฟในปีล่าสุดโมเลกุลวิธีได้ถูกใช้เพื่อระบุและแยกความแตกต่างหลากหลาย phytoplasmas . การวิเคราะห์ชนิดของยีน 16S rDNA และ / หรือการวิเคราะห์ RFLP ของยีน 16S rDNA ลำดับเบสเพื่อใช้แยกความแตกต่าง phytoplasmas ต่างๆ ( ลี et al . , 1993 และ seemuller et al . , 1998 ) จากการวิเคราะห์ชนิดของ 16S rDNA ยีน ลำดับ20 กลุ่มไฟโตพลาสมาที่แตกต่างกันระบุ ( seemuller et al . , 1998 ) .

พริกไทยดำแห้งผลเบอร์รี่ของไพเพอร์ ซึ่งพบว่า L . เป็นเครื่องเทศที่สำคัญของการค้าระหว่างประเทศหลายประเทศในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ อินเดียเป็นผู้ผลิตชั้นนำของพริกไทยดำในโลกและพืชผลที่ปลูกในพื้นที่ของ 1,89804 ฮากับการผลิต 71160 ตัน ( ที่มา : ประชาคมพริกไทยระหว่างประเทศจาการ์ตา , อินโดนีเซีย ) phyllody โรคในพริกไทยดำเป็นรายงานแรกใน 1986 จาก wyanad อำเภอของเกรละ อินเดีย ( ซาร์มา et al . , 1988 ) โรคนี้มีลักษณะผิดปกติของเข็มทั้งหมดและผลกระทบ เถา พบเด่นกระจุกสาขาผิดแบบน่ะซี่ให้ไม้กวาดแม่มดกับสีเหลืองปรากฏอาการที่ถูกดีที่มองเห็นจากระยะไกล ( ซาร์มา et al . ,1988 ) ในการสำรวจล่าสุด ของการเกิดโรคก็รายงานจากพริกไทยดำอื่นในภูมิภาคที่เติบโตของรัฐ Kerala , อินเดีย อุบัติการณ์ของโรคที่รุนแรงในพื้นที่ที่อยู่ติดกับสมาคมป่าไม้และสองชนิดของกรวยพืชที่เห็นกับเถาป่วย ( นิรนาม , 2002 ) ตามอาการวิทยา ความเกี่ยวข้องของเชื้อไฟโตพลาสมา ถูกสงสัยในโรคบทความนี้รายงานการจัดลำดับและ 1.2 กิโลเบสของ 16S rDNA ของเชื้อไฟโตพลาสมาที่ได้รับผลกระทบจากโรค phyllody พริกไทยดำและประชาชน .

2 วัสดุและวิธีการ
2.1 . phyllody ไอโซเลทและการสกัดกรดนิวคลีอิก

10 phyllody โรคได้รับผลกระทบจำนวนพริกไทยดำจาก Kozhikode District ของ Kerala รัฐอินเดีย กลุ่มตัวอย่างที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้แหลมที่รวบรวมจากพืชพริกไทยหรือจากนูร์ตำบล Kerala รัฐอินเดียที่ใช้ควบคุมสุขภาพ จำเพาะทั้งหมดสกัดจากสุขภาพและ spikes พริกไทยดำผิดแบบน่ะซี่โดยใช้ชุดพืช DNA ( macherey นาเกล ดูเรน , เยอรมนี ) แถบรวมสารสกัดจากรู้จักไฟโตพลาสมา ( แพงพวยใบเล็ก ) ใช้เป็นตัวควบคุมบวกควบคุมน้ำ ( ไม่มีดีเอ็นเอแม่แบบ ) ก็รวมอยู่ในทั้งหมดเพื่อตรวจหาเพื่อตรวจสอบการปนเปื้อนใด ๆ .

. . ที่ซ้อนกัน )

ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดอยู่ภายใต้วิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาเพื่อกันถ้วนหน้า โดยเฉพาะภายในลำดับ 16S rDNA ของ phytoplasmas ( กันเดอร์เซน และ ลี , 1996 ) ไพรเมอร์ ( 5 ’’ cggtagggatcacttgttacgactta P6 3 ) ( เติ้ง hiruki และ ,1991 ) และ sn910601 ( 5 ’’ cgaaaaaaccttaccaggtctttg 3 ) ( นัมบะ et al . , 1993 ) ถูกใช้เพื่อเพิ่มจำนวนรอบแรกของ 16S rdnas . สำหรับรอบสอง จะขยายเป็นส่วนภายในของ 16S rDNA , ไพรเมอร์ r16f2n ( 5 ’’ gaaacgactgctaagactgg 3 ) สอดคล้องกับฐาน 144 –แล้ว r16r2 ( 5 ’’ tgacgggcggtgtgtacaaaccccg 3 ) สอดคล้องกับฐาน 1365 – 1386 ( ลี et al . , 1993 ) สถิติที่ใช้การตรวจปฏิกิริยา ( 100 μ L ) ที่มีอยู่ 200 นาโนแต่ละของไพรเมอร์ 2.5 หน่วยได้ดีโดย 1 × PCR buffer , 1.25 มม. MgCl2 และ 10 μ M ของแต่ละ dntps . เชื้อผสม ( 27 μ L ) ที่มีส่วนประกอบข้างต้นถูกเพิ่มลงในหลอดที่มีแม่แบบดีเอ็นเอ ( 73 μ L ) ส่งผลให้ปริมาณปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 μ Lในการปฏิบัติแบบอัตโนมัติ ( Thermal cycler เพนดอร์ฟต้นแบบวงจรไล่ระดับ ) โปรแกรมสำหรับหนึ่งรอบ 94 ° C เป็นเวลา 3 นาที ตามด้วย 35 รอบโปรไฟล์ของปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับ 30 ( ที่ 94 ° C 60 วินาที annealing ที่ 53 ° C และ 90 ของส่วนขยายที่ 72 ° C และเดี่ยวรอบสุดท้ายของนามสกุล 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที ( สำหรับรอบแรกผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา ( 1 μ L ) ( รอบแรกที่ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบที่สอง ( กับโปรไฟล์ปฏิกิริยาคล้ายคลึงกันยกเว้นขั้นตอน annealing ซึ่งดำเนินการที่ 56 ° C ( แทนที่จะ 53 ° C )

2.3 การจัดลำดับและ

ต่อไปนี้ผลิตภัณฑ์ PCR PCR ,ปฏิกิริยาของผลิตภัณฑ์วิเคราะห์โดย % 1 ( gel electrophoresis ) ในบริษัทเตท EDTA ( แท ) บัฟเฟอร์ที่มีทิเดียมโบรไมด์ ( 0.4 μ g / ml ) ดีเอ็นเอมองเห็นและถ่ายภาพโดยใช้ยูวีเจล transilluminator และเอกสารเครื่องมือ ( อัลฟ่าอินโนเทค คอร์ปอเรชั่น , CA , USA ) 500 BP บันไดที่ใช้เป็นขนาดมาตรฐานผลิตภัณฑ์ PCR คือบริสุทธิ์ใช้ 1 ชุด ( stratagene เตรียมเชื้อบริสุทธิ์ lajolla , CA , USA ) ตามด้วยขัดบริสุทธิ์ดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์โดยใช้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ( stratagene lajolla พีเอฟยู , CA , USA ) และ dntp ผสม ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวถูกโคลนเข้า ppcr สคริปต์แอมป์ SK ( ) การใช้สคริปต์ ppcr เวกเตอร์แอมป์ SK ( ) การโคลนนิ่งชุดเวกเตอร์ ( stratagene lajolla , CA ,สหรัฐอเมริกา ) และความสามารถ ( สายพันธุ์เชื้อ Escherichia coli DH5 α ) ถูกเปลี่ยนตามขั้นตอนมาตรฐานในการศึกษาชีววิทยาระดับโมเลกุล ( sambrook และ Russell , 2001 ) โคลนยีนที่ถูกระบุโดยตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะการย่อย และคัดเลือกโคลนยีนอัตโนมัติกับการประยุกต์ Biosystems ( ABI ปริซึม ) ต่อไปนี้ dideoxy โซ่ ( เพอร์กินเอลเมอร์ Terminator ลำดับโปรโตคอล )

2.4 .การวิเคราะห์ลำดับข้อมูลเป็นลำดับ

รวบรวมโดยใช้ seqaid เวอร์ชั่น 3.6 ( โรดส์ และ roufa , 1985 ) การทำโดยใช้ลำดับหลาย clustal W ( Thompson et al . , 1994 ) phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้นโดยชุมชนร่วมกับวิธีบูตสแตรป ( บูการวิเคราะห์กับ 1000 ซ้ำ ) ใน clustal X ( เมีย ) และรากต้นไม้ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์เพลง ( ชนะ 32 ) ( หน้า , 1996 )การลำดับเบส 16S rDNA ของเชื้อไฟโตพลาสมาอื่น ๆสามารถใช้สำหรับการเปรียบเทียบ ( ตารางที่ 1 ) ได้จากขนาด ( เบนสัน et al . , 1999 ) ระเบิดรายการ ( แอลเชิล et al . , 1997 ) ถูกใช้เพื่อระบุลำดับของจากที่เกี่ยวข้องกับขนาดของฐานข้อมูล