SSH Library Construction Suppressio

SSH Library Construction Suppression subtractive hybridization
(SSH) was used to generate a cDNA library
(Diatchenko et al., 1996). Briefly, 30-d-old M. micrantha
plants grown at 350 ppm CO2 were exposed to 750 ppm
CO2 for 6 d, or left at 350 ppm CO2. Total RNA then was
isolated from the 5th and 6th leaves (counted basipetally
from the apex) using the standard guanidine thiocyanate
method (Chomczynski and Sacchi, 2006). Double strand
cDNA was synthesized using the SMART™ cDNA
amplification Kit (Clontech). A subtracted cDNA library
was constructed using the PCR-Select cDNA Subtraction
Kit (Clontech). PCR products were purified using the
QIAquick PCR purification kit (Qiagen) and ligated into
the pGEM-T easy vector (Promega). The constructs were
transformed into E. coli Top10 (Invitrogen). Positive clones
were verified by PCR using T7 and SP6 primers and
sequenced with an ABI 3730 sequencer (Applied Biosystems,
Inc.). All obtained sequences were compared with
DNA databases using the BLASTX sequence comparison
software (Altschul et al., 1997) at the NCBI website (http://
www.ncbi.nlm.nih.-gov/BLAST). An identified expressed
sequence tag (EST) named WGJ87 (658 bp) showed high
level of sequence similarity (e−35) to a characterized β-
caryophyllene synthase gene from Artemisia annua (accession
number AAL79181) (Cai et al., 2002), and this
inspired us to do further analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

SSH hybridization subtractive ปราบปรามก่อสร้างไลบรารี(SSH) ถูกใช้เพื่อสร้างห้องสมุด cDNA(Diatchenko et al., 1996) สั้น ๆ micrantha เมตรอายุ 30 dพืชที่ปลูกที่ 350 ppm CO2 ได้สัมผัสถึง 750 ppmCO2 สำหรับ 6 d ซ้าย 350 ppm CO2 อาร์เอ็นเอรวมแล้วมีแยกต่างหากจากใบไม้ 5 และ 6 (นับ basipetallyจาก apex) ใช้ thiocyanate guanidine มาตรฐานวิธีการ (Chomczynski และ Sacchi, 2006) สแตรนด์คู่มีสังเคราะห์ cDNA ใช้ cDNA ™สมาร์ทขยายชุด (Clontech) ห้องสมุด cDNA ที่ลบถูกสร้างขึ้นโดยใช้ cDNA PCR เลือกลบชุด (Clontech) ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์โดยใช้การฟอก QIAquick PCR kit (Qiagen) และควบเข้าpGEM T ง่ายเวกเตอร์ (Promega) ของโครงสร้างได้เปลี่ยนเป็น Top10 E. coli (Invitrogen) โคลนเป็นบวกถูกตรวจสอบ โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ T7 และ SP6 และเรียงลำดับกับ sequencer ที่ ABI 3730 (Biosystems ใช้Inc.) ลำดับที่ได้รับทั้งหมดถูกเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลดีเอ็นเอโดยใช้ BLASTX ลำดับเปรียบเทียบซอฟแวร์ (Altschul และ al., 1997) ที่เว็บไซต์ NCBI (ของ http://www.ncbi.nlm.nih.-gov/BLAST) การระบุแสดงลำดับแท็ก (EST) ชื่อ WGJ87 (658 bp) พบสูงระดับของลำดับมิใช่น้อย (e−35) ไปเป็น characterized β-caryophyllene synthase ยีนจาก Artemisia annua (ภาคยานุวัติหมายเลข AAL79181) (ไกและ al., 2002), และเราต้องวิเคราะห์เพิ่มเติม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

SSH ห้องสมุดปราบปรามก่อสร้างลดการผสมพันธุ์
(SSH) ถูกนำมาใช้ในการสร้างห้องสมุด cDNA
(Diatchenko et al., 1996) สั้น ๆ , 30-d เก่าเอ็ม micrantha
พืชที่ปลูกใน CO2 350 ppm ได้สัมผัสกับ 750 ppm
CO2 6 d หรือทิ้งไว้ที่ 350 ppm CO2 รวม RNA
นั้นถูกแยกได้จากใบที่5 และ 6 (นับ basipetally
จากปลาย) โดยใช้ thiocyanate guanidine
มาตรฐานวิธีการ(Chomczynski และ Sacchi 2006) สาระคู่ยีนสังเคราะห์โดยใช้สมาร์ท™ cDNA ขยาย Kit (Clontech) หักห้องสมุด cDNA ที่สร้างขึ้นโดยใช้ยีน PCR-เลือกลบKit (Clontech) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดฟอกPCR QIAquick (Qiagen) และ ligated เข้าpGEM-T ง่ายเวกเตอร์ (Promega) เป็นผู้ก่อสร้างถูกเปลี่ยนเป็นเชื้อ E. coli Top10 (Invitrogen) โคลนบวกได้รับการตรวจสอบโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์และ T7 SP6 และติดใจกับABI 3730 ซีเควน (Applied Biosystems, Inc) ลำดับที่ได้รับทั้งหมดถูกเมื่อเทียบกับฐานข้อมูลดีเอ็นเอโดยใช้การเปรียบเทียบลำดับ BLASTX ซอฟแวร์ได้ที่เว็บไซต์ของ NCBI (http: // (Altschul et al, 1997). www.ncbi.nlm.nih. -gov / ระเบิด) ระบุแสดงแท็กลำดับ (EST) ชื่อ WGJ87 (658 bp) พบสูงระดับของความคล้ายคลึงกันตามลำดับ(E-35) เพื่อβ-ลักษณะยีนเทสcaryophyllene Artemisia annua จาก (เข้าจำนวนAAL79181) (Cai et al., 2002) และสิ่งนี้เป็นแรงบันดาลใจให้เราทำวิเคราะห์ต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสร้างห้องสมุดแบบลบ (
( SSH ) ถูกใช้เพื่อสร้างห้องสมุด cDNA
( diatchenko et al . , 1996 ) สั้น , พืช 30-d-old ม. มิกันท่า
โตที่ 350 ppm CO2 ได้รับ 750 ppm CO2
6 D หรือซ้ายที่ 350 ppm CO2 ทั้งหมดนี้แล้วก็
แยกจาก 5 และ 6 ใบ ( นับจากปลาย basipetally

กัวนิดีนไธโอไซยาเนต ) โดยใช้มาตรฐานวิธี chomczynski และ sacchi , 2006 ) สองเส้นดีเอ็นเอสังเคราะห์โดยใช้สมาร์ท

™ cDNA amplification Kit ( clontech ) เป็นการหักออก cDNA ห้องสมุด
ถูกสร้างโดยใช้วิธี PCR เลือกการลบ
Kit ( clontech ) ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นบริสุทธิ์ใช้
qiaquick PCR ฟอก Kit ( เพิ่ม ) และผูกเป็น
pgem-t ง่ายเวกเตอร์ ( promega ) การสร้างถูก
เปลี่ยนเป็น Eโคไล TOP10 ( Invitrogen ) บวกโคลน
ถูกตรวจสอบโดยวิธี PCR โดยใช้ primers และ
* * 3 sp6 และลำดับกับ ABI 940 ซีเควน ( Applied Biosystems
, Inc . ) โดยลำดับ โดยเปรียบเทียบกับดีเอ็นเอฐานข้อมูลโดยใช้ blastx

ลำดับการเปรียบเทียบซอฟต์แวร์ ( แอลเชิล et al . , 1997 ) ในเว็บไซต์ ncbi ( http : / /
www.ncbi . nlm . NIH / gov / ระเบิด ) ระบุแสดง
แท็กลำดับ ( EST ) ชื่อ wgj87 ( 658 BP ) มีระดับ
ความเหมือนลำดับ ( E − 3 ) เป็นลักษณะยีนบีตา -
caryophyllene และอาร์ annua ( หมายเลขภาคยานุวัติ
aal79181 ) CAI et al . , 2002 ) , และนี้
จากเราทำวิเคราะห์เพิ่มเติม