viroids are infectious, unencapsida

viroids are infectious, unencapsidated, single-stranded, and highly structured noncoding circular RNAs of 250 to 400 nu- cleotides (nt). Despite their simplicity, viroids interact with cell factors, which redirect them to replicate and traffic throughout the plant while avoiding the RNA silencing machinery they trigger
in their hosts (1).
Indexing tests have shown that viroids are widespread in com- mercial citrus orchards, wherein trees may be coinfected with other graft-transmissible pathogens. Data regarding virus-viroid interactions are very scarce, but the information available indi- cates that such interactions may alter symptom expression (2, 3). Since coinfection of citrus species with Citrus tristeza virus (CTV) and viroids is not rare, assays were conducted to establish whether interactions between these two types of pathogens actually exist.
The assays were performed by comparing single and double infections of the two pathogens in etrog citron (Citrus medica L.) (viroid bioindicator) and Mexican lime (Citrus aurantifolia [Christm.] Swingle) (CTV bioindicator). Citrus dwarfing viroid (CDVd) (GenBank accession number EU934004), inducing mod- erate but specific symptoms in etrog citron (4), and CTV (T-305 strain), inducing symptoms in Mexican lime (5), were chosen for this study. To synchronize infection, Volkamer lemon (Citrus vol- kameriana Ten. & Pasq.) seedlings were graft inoculated with CDVd and/or CTV before being used as rootstocks. Etrog citron and Mexican lime were graft propagated to produce groups of five plants for each of the following treatments: (i) plants singly in- fected with CDVd, (ii) plants singly infected with CTV, (iii) plants coinfected with CTV and CDVd, and (iv) noninfected controls. CTV and CDVd infection was assessed by immunoprinting en- zyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (6) and dot blot hy- bridization (7), respectively.
After an incubation period of 4 months at 25°C, plant height was measured (Fig. 1) and data were subjected to multifactor anal- ysis of variance (ANOVA). The results indicated that etrog citron singly infected with CTV (P value, 0.00001) or CDVd (P value,
0.05) was stunted, as was Mexican lime singly infected with CTV (P value, 0.0013) but not that with CDVd (P value, 0.98). Height reduction in coinfected plants resulted from the added effect of each pathogen, indicating no interaction between CDVd and CTV in either host (interaction P value for etrog citron, 0.29; interac- tion P value for Mexican lime, 0.44). Similarly, symptom expres-

sion in stems and leaves resulted from the added effect of each pathogen, revealing again a lack of interactions between the two pathogens (Fig. 2).
To elucidate if coinfected plants presented any deviation of CDVd and/or CTV accumulation from their singly infected coun- terparts, the titer of each pathogen was analyzed. For viroid quan- tification, equalized preparations of total nucleic acids were sub- jected to PAGE in 5% gels containing 1 Tris-borate-EDTA (TBE) and 8 M urea, electrotransferred to positively charged nylon membranes (Roche Diagnostics), fixed by UV cross-link- ing, and hybridized with a digoxigenin (DIG)-labeled full-length CDVd DNA probe. Northern blot results showed that CDVd titers in etrog citron were not affected by CTV coinfection (Fig. 3A), whereas Mexican lime plants coinfected with CTV and CDVd had considerably higher viroid titers than plants singly infected with CDVd (Fig. 3B). In addition, nucleic acid preparations of Mexican lime were subjected to reverse transcription-PCR (RT-PCR) using a CDVd-specific primer pair (8). Amplicon sequencing revealed that the CDVd progeny of plants singly infected or coinfected with CTV were identical to the parental CDVd used as the inoculum, thus eliminating the possibility that the observed changes in CDVd titer were due to changes in the composition of the viroid population.
For CTV quantification, total protein preparations were ana- lyzed by double-antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) using the CTV-specific monoclonal antibodies 3DF1 and 3CA5 (9), and equalized preparations of total nucleic acids were examined by spot-print quantitative RT-PCR (qRT-PCR) using CTV-specific primers and TaqMan (10, 11). Numerical data were subjected to one-way ANOVA. Results showed a statistically significant reduc- tion of CTV accumulation in coinfected Mexican limes compared to singly infected ones: by DAS-ELISA, the mean difference was
0.15 0.05 optical density units (405 nm) (P value, 0.02), and by

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไวรอยด์ที่มีการติดเชื้อ unencapsidated เดียวควั่นและโครงสร้างสูง RNAs วงกลมของ noncoding 250-400 cleotides nu- (เอ็นที) แม้จะมีความเรียบง่ายของพวกเขาไวรอยด์โต้ตอบกับปัจจัยเซลล์ซึ่งเปลี่ยนเส้นทางไปที่จะทำซ้ำและการจราจรตลอดพืชขณะที่หลีกเลี่ยงเครื่องจักรเงียบอาร์เอ็นเอที่พวกเขาเรียกในโฮสต์ของพวกเขา (1). การทดสอบการทำดัชนีแสดงให้เห็นว่าไวรอยด์เป็นที่แพร่หลายในสวนส้มพาณิชย์สั่ง, ต้นไม้นั้นอาจจะมีเชื้อโรค coinfected รับสินบน-ถ่ายทอดอื่น ๆ ข้อมูลเกี่ยวกับการปฏิสัมพันธ์ไวรัสไวรอยด์จะหายากมาก แต่ข้อมูลที่มีเคทส์บอกสิ่งนั่นปฏิสัมพันธ์ดังกล่าวอาจเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของอาการ (2, 3) ตั้งแต่ coinfection ของสายพันธุ์ส้มไวรัสส้ม tristeza (CTV) และไวรอยด์ไม่ได้หายากตรวจได้ดำเนินการในการสร้างว่ามีปฏิสัมพันธ์ระหว่างทั้งสองประเภทของเชื้อโรคที่มีอยู่จริง. ตรวจได้ดำเนินการโดยการเปรียบเทียบการติดเชื้อเดี่ยวและคู่ของทั้งสองเชื้อโรคใน etrog มะนาว (Citrus Medica ลิตร) (ไวรอยด์ดัชนีทางชีวภาพ) และมะนาวเม็กซิกัน (ส้มแป้น [Christm.] Swingle) (CTV ดัชนีทางชีวภาพ) ส้มสะโอดสะองไวรอยด์ (CDVD) (GenBank เข้าจำนวน EU934004) การกระตุ้นให้เกิด erate mod- แต่อาการเฉพาะใน etrog มะนาว (4) และ CTV (สายพันธุ์ T-305) การกระตุ้นให้เกิดอาการในมะนาวเม็กซิกัน (5) ได้รับการคัดเลือกในการศึกษานี้ . เพื่อประสานการติดเชื้อ Volkamer มะนาว (Citrus VOL- kameriana สิบ. & Pasq.) ได้รับการปลูกถ่ายอวัยวะต้นกล้าเชื้อด้วย CDVD และ / หรือ CTV ก่อนที่จะถูกนำมาใช้เป็นต้นตอ Etrog มะนาวและมะนาวเม็กซิกันถูกแพร่กระจายการรับสินบนในการผลิตของกลุ่มห้าพืชสำหรับแต่ละของการรักษาต่อไปนี้: (i) พืชเดี่ยวห fected กับ CDVD (ii) พืชที่ติดเชื้อโดยลำพัง CTV (iii) พืช coinfected กับ CTV และ CDVD และ (iv) การควบคุมเชื้อมาลาเรีย CTV และ CDVD การติดเชื้อได้รับการประเมินโดย immunoprinting en- ZYME เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (ELISA) (6) และจุดลบเชีย bridization (7) ตามลำดับ. หลังจากระยะฟักตัวประมาณ 4 เดือนที่ 25 ° C, ความสูงของพืชวัด ( รูปที่. 1) และข้อมูลที่ถูกยัดเยียดให้ Multifactor anal- ysis ความแปรปรวน (ANOVA) ผลการวิจัยพบว่า etrog มะนาวติดเชื้อโดยลำพัง CTV (ค่า P, 0.00001) หรือ CDVD (ค่า P, 0.05) ถูกค่อมเช่นมะนาวเม็กซิกันการติดเชื้อโดยลำพังกับ CTV (ค่า P, 0.0013) แต่ไม่ว่าด้วยการ CDVD (ค่า P, 0.98) การลดความสูงในพืช coinfected เกิดจากผลกระทบที่เพิ่มขึ้นของเชื้อโรคแต่ละชนิดการแสดงปฏิสัมพันธ์ระหว่าง CDVD และ CTV ในการเป็นเจ้าภาพทั้ง (ปฏิสัมพันธ์ค่า P สำหรับ etrog มะนาว, 0.29; โต้ตอบการค่า P สำหรับมะนาวเม็กซิกัน, 0.44) ในทำนองเดียวกันอาการแสดงออกไซออนในลำต้นและใบเกิดจากผลกระทบเพิ่มของเชื้อโรคแต่ละชนิดเผยให้เห็นอีกครั้งขาดการปฏิสัมพันธ์ระหว่างคนทั้งสองเชื้อโรค (รูปที่. 2). เพื่ออธิบายถ้าพืช coinfected นำเสนอเบี่ยงเบนใด ๆ ของ CDVD และ / หรือการสะสม CTV จากประเทศต่างของพวกเขาติดเชื้อโดยลำพัง terparts, titer ของเชื้อโรคแต่ละวิเคราะห์ สำหรับ quan- ไวรอยด์ tification, เสมอภาคกันเตรียมของกรดนิวคลีอิกรวมถูกย่อย jected ไปหน้า 5% ที่มีเจล 1 Tris-borate-EDTA (TBE) และ 8 M ยูเรีย electrotransferred การประจุบวกเยื่อไนลอน (Roche Diagnostics) แก้ไขโดย UV ข้าม link- ไอเอ็นจีและไฮบริดที่มี digoxigenin (DIG) -labeled ยาวเต็มรูปแบบการสอบสวนดีเอ็นเอ CDVD ผลการ blot ภาคเหนือพบว่า titers CDVD ใน etrog มะนาวที่ไม่ได้รับผลกระทบจาก CTV coinfection (รูป. 3A) ในขณะที่พืชมะนาวเม็กซิกัน coinfected กับ CTV และ CDVD มีสูงมาก titers ไวรอยด์กว่าพืชที่ติดเชื้อโดยลำพังกับ CDVD (รูป. 3B) นอกจากนี้การเตรียมกรดนิวคลีอิกของมะนาวเม็กซิกันถูกยัดเยียดให้กลับถอดความ-PCR (RT-PCR) โดยใช้คู่ไพรเมอร์ CDVD เฉพาะ (8) ลำดับ amplicon เปิดเผยว่าลูกหลาน CDVD ของพืชที่ติดเชื้อหรือเดี่ยว coinfected กับ CTV เป็นเหมือนกับ CDVD ผู้ปกครองใช้เป็นหัวเชื้อที่ทำให้การขจัดความเป็นไปได้ว่าการเปลี่ยนแปลงที่สังเกตใน titer CDVD ได้เนื่องจากมีการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของประชากรไวรอยด์ที่. สำหรับ ปริมาณ CTV เตรียมโปรตีนรวมถูกแบบตั้ง lyzed โดยวิธี ELISA แซนวิชดับเบิลแอนติบอดี (DAS-ELISA) โดยใช้โคลนอลแอนติบอดี CTV เฉพาะ 3DF1 และ 3CA5 (9) และเสมอภาคกันเตรียมของกรดนิวคลีอิกรวมได้รับการตรวจสอบโดยจุดปริมาณการพิมพ์ RT -PCR (qRT-PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ CTV ที่เฉพาะเจาะจงและ TaqMan (10, 11) ข้อมูลตัวเลขถูกยัดเยียดให้ทางเดียว ANOVA แสดงให้เห็นว่าผลการ reduc- นัยสำคัญทางสถิติของการสะสม CTV ในมะนาว coinfected เม็กซิกันเมื่อเทียบกับคนที่ติดเชื้อโดยลำพังโดย DAS-ELISA ที่แตกต่างเฉลี่ย0.15 0.05 หน่วยความหนาแน่นของออปติคอล (405 นาโนเมตร) (ค่า P, 0.02) และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

viroids จะติดเชื้อ unencapsidated เดียวติด และโครงสร้างสูง noncoding วงกลม RNAs 250 ถึง 400 Nu - cleotides ( NT ) แม้จะมีความเรียบง่ายของพวกเขา viroids โต้ตอบกับองค์ประกอบของเซลล์ซึ่งนำพวกเขาที่จะทำซ้ำและการจราจรตลอดพืชในขณะที่หลีกเลี่ยงยีน silencing เครื่องจักรในโฮสต์ของพวกเขาเรียก

( 1 )การทดสอบดัชนีได้แสดงให้เห็นว่า viroids อย่างกว้างขวางใน com - mercial สวนส้ม ซึ่งต้นไม้อาจจะอื่น ๆจากกราฟการส่งผ่านเชื้อโรค ข้อมูลเกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างไวรัสไวรอยด์ขาดแคลนมาก แต่ข้อมูลที่มีอยู่นดี - เคสที่ปฏิสัมพันธ์ดังกล่าวอาจเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของอาการ ( 2 , 3 )เนื่องจากมีเชื้อไวรัสชนิด ส้มกับมะนาวทริสเทซ่าไวรัส ( CTV ) และ viroids ไม่ยาก หรือ มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างว่า ปฏิสัมพันธ์ระหว่างทั้งสองประเภทของเชื้อโรคมีอยู่จริง
หรือได้เปรียบของเชื้อเดี่ยวและคู่สองเชื้อโรคใน etrog มะนาว ( Citrus medica L . ) ( viroid bioindicator ) และปูนขาว เม็กซิกัน ( Citrus aurantifolia [ christm .] สวิงเกิล ) ( CTV bioindicator ) ส้ม dwarfing ไวรอยด์ ( cdvd ) ( ขนาดหนังสือเลขที่ eu934004 ) โดย mod - erate แต่อาการที่เฉพาะเจาะจงใน etrog ส้ม ( 4 ) , และ CTV ( t-305 เมื่อย ) กระตุ้นให้เกิดอาการมะนาวเม็กซิกัน ( 5 ) ถูกเลือกสำหรับการศึกษานี้ เช่น การติดเชื้อ volkamer มะนาว ( Citrus Vol - kameriana 10 & pasq .) เป็นเชื้อที่มีการปลูก cdvd และ / หรือ CTV ก่อนที่จะถูกใช้เป็นต้นตอ . ส้มและมะนาวตอนกิ่งขยายพันธุ์ etrog เม็กซิกันถูกผลิตกลุ่มของห้าพืชสำหรับแต่ละการรักษาต่อไปนี้ : ( i ) พืชเดี่ยว - fected กับ cdvd ( 2 ) พืชเดี่ยวติดเชื้อ CTV , ( 3 ) พืชจาก CTV และ cdvd และ ( iv ) เม็ดเลือดแดงควบคุมcdvd CTV และการติดเชื้อได้รับการประเมินโดย immunoprinting en - ไซม์ ลิงค์ immunosorbent assay ( ELISA ) ( 6 ) และ dot blot HY - bridization ( 7 ) ตามลำดับ
ผ่านระยะฟักตัว 4 เดือนที่ 25 ° C , ความสูงที่วัดได้ ( รูปที่ 1 ) และข้อมูลที่ถูกต้อง multifactor ทวารหนัก - ysis ของความแปรปรวน ( 4 ) ผลการวิจัยพบว่า etrog มะนาวเดี่ยวติดเชื้อ CTV ( ค่า P , 0 .00001 ) หรือ cdvd ( P ค่า
0.05 ) คือแคระ , เป็นเม็กซิกันมะนาวเดี่ยวติดเชื้อ CTV ( P ค่า 0.0001 ) แต่ไม่ใช่กับ cdvd ( ค่า P , 0.98 ) ลดความสูงใน coinfected พืชเป็นผลมาจากผลเพิ่มของแต่ละเชื้อ แสดงว่าไม่มีปฏิสัมพันธ์ระหว่าง cdvd และ CTV ในโฮสต์ ( ปฏิสัมพันธ์ค่า P สำหรับ etrog มะนาว , 0.29 ค่า P ; interac , มะนาว , เม็กซิกัน 0.44 ) ในทํานองเดียวกันอาการ expres -

ไซออนในลำต้นและใบ เป็นผลจากการเพิ่มผลกระทบของแต่ละเชื้อ เปิดเผยอีกครั้ง ขาดปฏิสัมพันธ์ระหว่างเชื้อโรค ( รูปที่ 2 ) .
ทำให้ถ้า coinfected พืชที่นำเสนอการเบี่ยงเบนใด ๆของ cdvd และ / หรือ CTV ที่สะสมจากเดี่ยวติดเชื้อ coun - terparts , ระดับของแต่ละเชื้อ คือ วิเคราะห์ สำหรับ tification ไวรอยด์เฉวียน - ,ถึงการเตรียมการทั้งหมดของกรดนิวคลีอิก ถูกย่อย jected หน้า 5 % เจลประกอบด้วย 1 ทั้งนี้ บอเรท EDTA ( ทีบี ) 8 M ยูเรียต้องมีประจุบวก electrotransferred เยื่อไนลอน ( โรชวินิจฉัย ) , แก้ไขโดย UV ข้ามเชื่อมโยง - ing และ hybridized กับติด ( ขุด ) - ข้อความเต็ม cdvd DNA probe .ผลการตรวจสอบพบว่า cdvd ในภาคเหนือ โดย etrog มะนาวไม่ได้รับผลกระทบโดย CTV มีเชื้อไวรัส ( รูปที่ 3A ) ส่วนเม็กซิกันมะนาวพืชจาก CTV และ cdvd มีสูงมาก ไวรอยด์โดยเดี่ยวติดเชื้อกว่าพืช cdvd ( รูปที่ 3B ) นอกจากนี้กรดนิวคลีอิกการเตรียมปูนขาวเม็กซิกันถูกถอดความย้อนกลับ ( RT-PCR ) PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ cdvd เฉพาะ ( 8 ) และลำดับ พบว่า cdvd ลูกหลานของพืชเดี่ยวติดเชื้อ หรือจาก CTV ได้เหมือนกันกับผู้ปกครองใช้เป็นเชื้อ cdvd ,จึงขจัดความเป็นไปได้ที่สังเกตการเปลี่ยนแปลงในระดับ cdvd ) เนื่องจากมีการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของประชากร ไวรอยด์ .
สำหรับ CTV ปริมาณโปรตีนรวมเท่ากับการเตรียมสู่ lyzed โดยดับเบิ้ลแอนติบอดีแซนวิช ELISA ( das-elisa ) โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงและ CTV 3df1 3ca5 ( 9 )ถึงการเตรียมการทั้งหมดของกรดนิวคลีอิกทดสอบพิมพ์เชิงปริมาณ โดยจุดนี้ ( ข้าพเจ้า PCR ) โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะ CTV และ taqman ( 10 , 11 ) ข้อมูลตัวเลขที่ถูกภายใต้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว การทดลองอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ reduc - tion ของ CTV ที่สะสมใน coinfected มะนาวเม็กซิกันเมื่อเทียบกับคนที่ติดเชื้อ das-elisa เดี่ยวโดย ค่าเฉลี่ยของความแตกต่าง
) 005 หน่วยความหนาแน่นของแสง ( 405 นาโนเมตร ) ( ค่า P
0.02 ) และโดย