qPCRGene expression mRNA was analys

qPCR
Gene expression mRNA was analysed by quantitative real-time PCR (qPCR) performed in Dynamic Array Integrated Fluidic Circuits (Fluidigm) following the protocol described previously (Skovgaard et al., 2013). The following cycle parameter was used: 2 min at 50 °C, 10 min at 95 °C, followed by 35 cycles with denaturing for 15 s at 95 °C and annealing/elongation for 1 min at 60 °C. Melting curves were generated after each run to confirm a single PCR product (from 60 °C to 95 °C, increasing 1 °C/3 s). Reactions were performed in duplicates (cDNA replicates). Non-template controls (NTC) were included to indicate potential problems with non-specific amplification or sample contaminations. Non-reverse transcriptase controls were included to assess potential DNA contamination.

Expression data (Cq values) were acquired using the Fluidigm Real-Time PCR Analysis software 3.0.2 (Fluidigm) and exported to GenEx (MultiD) for data pre-processing including interplate correction, correction for PCR efficiency for each primer assay individually, normalising to six highly stable reference genes, and averaging of cDNA technical repeats. Using GeNorm (17) and NormFinder (18), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), β2 microglobulin (B2M), peptidylprolyl isomerase A (PPIA), hypoxanthine phosphoribisyl transferase I (HRPT1), TATA-box binding protein (TBP), and tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide (YWHAE) were identified as the most stably expressed reference genes out of eight candidates. For each primer assay, the mean relative expression level of the control group was scaled to one during data transformation log2 (Cq) to linear scale. Gene expression data were log2-transformed before testing for normal distribution, Student's t-test was used to analyse normally distributed data, while the non-parametric test (Wilcoxon–Mann–Whitney test) was used when data was non-normal distributed. Gene expression was considered significantly different if the P value was less than 0.05 and the relative expression was greater than 2.0. Experimental practice and reporting have been performed according to the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) guidelines ( Bustin et al., 2009).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

qPCRยีน mRNA ถูก analysed โดยเชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qPCR) ทำในแบบอาร์เรย์รวม Fluidic วงจร (Fluidigm) โพรโทคอลอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Skovgaard et al., 2013) ต่อไปนี้ พารามิเตอร์วงจรต่อไปนี้ใช้: 2 นาทีที่ 50 ° C, 10 นาทีที่ 95 ° C ตามรอบ 35 กับ denaturing 15 s 95 ° C และการอบ เหนียว/elongation ใน 1 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส มีสร้างเส้นโค้งที่ละลายหลังจากแต่ละรันเพื่อยืนยันผลิตภัณฑ์ PCR เดียว (จาก 60 ° C ถึง 95 ° C เพิ่มขึ้น 1 ° C/3 s) ปฏิกิริยาที่ทำในซ้ำ (cDNA เหมือนกับ) ไม่ใช่แบบควบคุม (NTC) รวมเพื่อบ่งชี้ปัญหาเจาะจงขยายหรือปนตัวอย่างได้ Transcriptase กลับไม่ควบคุมรวมอยู่ในการประเมินการปนเปื้อนของ DNA อาจเกิดขึ้นได้ข้อมูลนิพจน์ (ค่าซี) ได้รับมาใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ Fluidigm Real-Time PCR บินตกแต่ง 3.0.2 (Fluidigm) และส่งออกไป (MultiD) สำหรับข้อมูลที่ประมวลผลเบื้องต้นรวมถึงการแก้ไข interplate, GenEx แก้ไขสำหรับ PCR ประสิทธิภาพสำหรับการวิเคราะห์แต่ละพื้นที normalising การอ้างอิงที่มีเสถียรภาพสูง 6 ยีน และหาค่าเฉลี่ยของ cDNA เทคนิคซ้ำ ใช้ GeNorm (17) และ NormFinder (18), dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH), β2 microglobulin (B2M) ไอโซเมอเรส peptidylprolyl A (PPIA), hypoxanthine phosphoribisyl transferase ฉัน (HRPT1), เดินกล่องผูกโปรตีน (TBP), และ โปรตีน tyrosine 3-monooxygenase/ทริ ปโตเฟน 5-monooxygenase เปิด polypeptide แคเธอรีนซีตา (YWHAE) ที่ระบุมากสุด stably แสดงยีนอ้างอิงจากผู้สมัคร 8 สำหรับการวิเคราะห์แต่ละพื้น ระดับนิพจน์สัมพัทธ์เฉลี่ยของกลุ่มควบคุมถูกปรับให้ในระหว่างข้อมูลแปลง log2 (ซี) ขนาดเส้น ข้อมูลนิพจน์ยีนถูกแปร log2 ก่อนทดสอบการแจกแจงปกติ t-ทดสอบของนักเรียนใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลแบบกระจายปกติ ในขณะที่ใช้ทดสอบไม่ใช่พาราเมตริก (การทดสอบ Wilcoxon – มานน์ – วิทนีย์) เมื่อข้อมูล ไม่ปกติกระจาย ยีนไม่ถือว่าแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญถ้ามีค่า P น้อยกว่า 0.05 และนิพจน์แบบย่อมีมากกว่า 2.0 ปฏิบัติทดลองและการรายงานมีการปฏิบัติตามข้อมูลต่ำสุดสำหรับแนวทางการเผยแพร่ของเชิงปริมาณ Real-Time PCR ทดลอง (MIQE) (Bustin et al., 2009)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

qPCR
mRNA การแสดงออกของยีนที่ถูกวิเคราะห์โดยเชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qPCR) ดำเนินการในอาร์เรย์แบบไดนามิกวงจรรวม Fluidic (Fluidigm) ตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Skovgaard et al., 2013) พารามิเตอร์รอบต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: 2 นาทีที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 ° C ตามด้วย 35 รอบกับ denaturing สำหรับ 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและการอบ / การยืดตัวเป็นเวลา 1 นาทีที่ 60 ° C เส้นโค้งละลายถูกสร้างขึ้นหลังจากการทำงานในแต่ละที่จะยืนยันสินค้า PCR เดียว (จาก 60 ° C ถึง 95 ° C เพิ่มขึ้น 1 ° C / 3 s) ปฏิกิริยาได้ดำเนินการในที่ซ้ำกัน (cDNA ซ้ำ) การควบคุมที่ไม่ได้แม่แบบ (กทช) ถูกรวมอยู่ในการบ่งบอกถึงปัญหาที่อาจเกิดขึ้นกับการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงหรือการปนเปื้อนของตัวอย่าง ควบคุม transcriptase ไม่กลับถูกรวมอยู่ในการประเมินการปนเปื้อนดีเอ็นเอที่มีศักยภาพ. ข้อมูลการแสดงออก (ค่า Cq) ได้มาโดยใช้การวิเคราะห์ Fluidigm PCR แบบ Real-Time ซอฟแวร์ 3.0.2 (Fluidigm) และส่งออกไป Genex (MultiD) สำหรับข้อมูลก่อนการประมวลผลรวมทั้ง Interplate การแก้ไขการแก้ไขอย่างมีประสิทธิภาพ PCR สำหรับแต่ละการทดสอบไพรที normalizing ถึงหกยีนอ้างอิงมีความเสถียรสูงและค่าเฉลี่ยของซ้ำเทคนิค cDNA ใช้ GeNorm (17) และ NormFinder (18), dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH) β2 microglobulin (B2M) peptidylprolyl isomerase (PPIA) hypoxanthine phosphoribisyl transferase ฉัน (HRPT1), ทาทากล่องโปรตีน (TBP) และซายน์ 3 monooxygenase / โพรไบโอ 5- monooxygenase โปรตีนการเปิดใช้งาน polypeptide ซีตา (YWHAE) ถูกระบุว่าเป็นส่วนใหญ่แสดงความเสถียรยีนอ้างอิงจากผู้สมัครที่แปด สำหรับแต่ละการทดสอบรองพื้นหมายความว่าระดับการแสดงออกของญาติของกลุ่มควบคุมเป็นสัดส่วนถึงหนึ่งในระหว่างการแปลงข้อมูล log2 (Cq) ขนาดเชิงเส้น ข้อมูลการแสดงออกของยีนที่ถูก log2-เปลี่ยนก่อนการทดสอบสำหรับการกระจายปกติ t-test ของนักเรียนถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลการกระจายตามปกติในขณะที่การทดสอบที่ไม่ใช่พารามิเตอร์ (Wilcoxon-Mann-Whitney ทดสอบ) ถูกนำมาใช้เมื่อข้อมูลที่เป็นไม่ปกติกระจาย การแสดงออกของยีนได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญที่แตกต่างกันถ้าค่า P น้อยกว่า 0.05 และการแสดงออกญาติมากกว่า 2.0 การปฏิบัติการทดลองและการรายงานได้รับการดำเนินการตามข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการตีพิมพ์เชิงปริมาณแบบ Real-Time PCR ทดลอง (MIQE) แนวทาง (Bustin et al., 2009)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

qpcr
ยีน mRNA ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์ ( qpcr ) ดำเนินการในอาร์เรย์แบบไดนามิก fluidic วงจร ( fluidigm ) ตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( skovgaard et al . , 2013 ) พารามิเตอร์ต่อไปนี้รอบใช้ : 2 นาทีที่ 50 ° C 10 นาทีที่ 95 องศา C ตามด้วย 35 รอบด้วยี่ 15 s ที่ 95 องศา C และการอบ / ด 1 นาทีที่ 60 องศาละลายโค้งถูกสร้างขึ้นหลังจากเรียกใช้แต่ละยืนยันผลิตภัณฑ์ PCR เดียว ( จาก 60 ° C ถึง 95 องศา C เพิ่ม 1 ° C / s ) ปฏิกิริยาที่แสดงในรายการที่ซ้ำกัน ( cDNA ซ้ำ ) ไม่ใช่แม่แบบการควบคุม ( กทช ) รวมถึงปัญหาที่อาจเกิดขึ้นกับแบบไม่เฉพาะเจาะจง หรือมีสิ่งเจือปน ไม่แสดงอาการในการควบคุมการปนเปื้อนดีเอ็นเอ รวมถึงประเมินศักยภาพ .

ข้อมูลนิพจน์ ( CQ ค่า ) ได้มาใช้ fluidigm เวลาจริงและการวิเคราะห์ซอฟต์แวร์ดาวน์โหลด ( fluidigm ) และส่งออกไปยังเจนเน็กซ์ ( multid ) สำหรับการประมวลผลข้อมูลรวมทั้งแก้ไข interplate แก้ไขประสิทธิภาพซึ่งแต่ละแนวทางการทดสอบเป็นรายบุคคล normalising หกยีนอ้างอิงมีเสถียรภาพสูง และค่าเฉลี่ยของทำซ้ำเทคนิค cDNA . การใช้ genorm ( 17 ) และ normfinder ( 18 )glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( gapdh ) บีตา 2 microglobulin ( b2m ) peptidylprolyl ไอโซเมอเรส ( ppia ) , ไฮโปแซนทีน phosphoribisyl ทรานสเฟอเรส ( hrpt1 ทาทากล่อง ) โปรตีน ( tbp ) และไทโรซีน 3-monooxygenase / ทริป 5-monooxygenase กระตุ้นโปรตีนซีตาพอลิเพปไทด์ ( ywhae ) ที่ถูกระบุมากที่สุด เสถียรแสดงการอ้างอิงยีนจากแปดคนสำหรับแต่ละคู่โดยเฉลี่ยสัมพัทธ์ของยีนของกลุ่มควบคุม มีการปรับขนาดให้หนึ่งใน LOG การแปลงข้อมูล ( CQ ) ขนาดเส้น ข้อมูลการแสดงออกของยีนเป็น LOG เปลี่ยนก่อนการทดสอบการแจกแจงปกติ นักเรียนตอบถูกใช้เพื่อวิเคราะห์การกระจายปกติข้อมูลในขณะที่การทดสอบที่ไม่ใช้พารามิเตอร์ ( Wilcoxon Mann - Whitney ( ทดสอบ ) คือใช้เมื่อข้อมูลไม่มีการแจกแจงแบบปกติ . การแสดงออกของยีนก็ถือว่าแตกต่างกัน หากค่า P น้อยกว่า 0.05 และการแสดงออกของญาติมากกว่า 2.0การทดลองปฏิบัติและการรายงานได้ดำเนินการตามข้อมูลที่น้อยที่สุดสำหรับสิ่งพิมพ์ของปริมาณเวลาจริงจากการทดลอง ( miqe ) แนวทาง ( bustin et al . , 2009 )