Example 1The โพลีเปปไทด์ of SEQ ID

Example 1
The โพลีเปปไทด์ of SEQ ID NO:1 is obtained essentially as described in US2012/0149,636. The โพลีเปปไทด์ of SEQ ID NO:1 is formulated to 4mg/mL in 20mM Tris pH 4.0; 2 M urea; and 50 mM เมไธโอนีน. To this formulated โพลีเปปไทด์, 30K
5 PEG (a-Methyl-w-amimooxyethylcarbamyl, โพลีออกซีเอธิลีน, Sunbright ME-300CA,
NOF, Japan) is added tat a 10:1 PEG to โพลีเปปไทด์ molar ratio. The โพลีเปปไทด์ and PEG are mixed gently and conjugation is allowed to proceed for 48-72 hours at 28°C. The PEGylated โพลีเปปไทด์ is then purified by routine cation exchange chromatography
and formulated to lmg/ML in PBS (phosphate buffered saline) 7.4 with 4% trehalose. 10 This process results in a mixture which contains between 1-2% of SEQ ID NO: 1,
โดยที่ the first เมไธโอนีน is cleaved off.




In vitro Biological data
15 HEK 293 cells are stably transfected with both the luciferase reporter gene under
control of a STAT3 response element and the OB-Rb (เลปติน receptor), which is expressed on the cell surface. เลปติน binds to the เลปติน receptor and activates STAT3 homodimers and STAT3/STAT1 heterodimers, which interact and bind with the STAT3 sequence
response element. This interaction drives expression of the luciferase gene and stimulates
20 cells to produce luminescence. The amount of luminescence is proportional to the activity of
the สารประกอบ. The biological activity is based on the EC50 of a 4-PL sigmoidal curve.


DAY ONE
Cells are seeded into a 96-well plate at 20,000 cells/well and placed in a 37°C, 5%
25 CO2 incubator for 24-30 hours.


DAY TWO
The starting concentration for wild type (WT) canine เลปติน and the PEGylated โพลีเปปไทด์ of Example lis 1200 ng/mL. From that, 400 uL volume is taken from each sample and 4x serial dilutions are made across the rows of the dilution block. First, 300 uL/well of assay medium is added to Col 2-11. Then 100 uL is transferred from Col 1 to
Col 2, mixed carefully and slowly (without bubbling) 8-10 times, and then continued
transferring 100 uL from Col 2 to Col 3 and repeating until reaching Col 11. Leave Col
12 as un-stimulated control well. Cells are then stimulated with the serial dilutions of the wild type (WT) canine เลปติน and the PEGylated โพลีเปปไทด์ of Example 1. The cells are taken out of the incubator and the medium is carefully aspirated from each well. Then 100IAL/well of the serially diluted WT and PEGylated โพลีเปปไทด์ is transferred from the deep-well dilution block to the cells in the 96-well assay plates. Duplicate samples are then created for WT and PEGylated โพลีเปปไทด์ tested horizontally across the next
available row. Plates are incubated in a 37°C, 5% CO2 incubator for 16-18 hours. The plate format with final concentrations in ng/mL is shown below.




[ng/mL] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
WT 1200 300 75 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
cเลปติน
WT 1200 300 75 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
cเลปติน
Example 1200 300 75 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
1
Example 1200 300 75 19 4.68 1,17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
1


DAY THREE
On day three, a substrate is prepared and added to the cells and they are then
measured by a Luminometer. Approximately 1-2 hours before the plate is read, one set of 5 Steady-Glo (Proinega) reagents is thawed ที่รวมถึง: one vial of Steady-Glo lyophilized
Luciferase Assay Substrate and one vial of Steady-Glo Luciverase Assay buffer per assay
plate at room temperature. The entire contents of the luciverase assay buffer (-10.5mL)
are pipetted into the lyophilized luciferase substrate. 100µL/well of the reconstituted
luciferase substrate is added to each well of the assay plate and the assay plate is covered 10 with aluminum foil and incubated at room temperature for 45-60 minutes on a plate
shaker set at 450 to 600 rpm. The plate is then read on a Tecan GENiosPRO plate reader with integration time set to 250 msec. The data is then entered into Excel and an EC50 determination on SigmaPlot Application is carried out and the fold loss activity relative to
the WT เลปติน and percent relative potency determinations are also carried out. Fold loss 15 activity relative to wild type canine เลปติน is determined to be the [EC50 of the sample]
divided by the [EC50 of wild type เลปติน]; the % relative potency of เลปติน proteins to
reference standard is calculated by dividing the EC50 of reference standard by the EC50 values of เลปติน proteins and multiplying by 100. For instance, the % Relative Potency is calculated as the [EC50 of referenced standard] divided by the [EC50 of the sample] x
5 100, The following table shows WT and PEGylated โพลีเปปไทด์ of Example 1 analyzed
using these methods.


Table 1

Molecule Exp. 1 Exp. 2 AVG
(EC50) (EC50) EC50
WT Canine 1504 1954 1729
เลปติน
(Ray Biotech)
WT Human 2052 3589 2820
เลปติน (Ambrx)
Example 1 2183
The results show that the PEGylated โพลีเปปไทด์ of Example lis active in vitro. 10
In vivo Biological data
The objective of this study is to evaluate the impact of the PEGylated โพลีเปปไทด์
of Example 1 upon bodyweight, body composition, and feeding behavior in obese male
and female dogs.The PEGylated โพลีเปปไทด์ of Example 1 formulated at 5.1 mg/ml in 15 phosphate buffered saline with a pH of 7.4 and 4% (w/v) trehalose.
Eighteen (18) dogs all over one (1) year old are used: nine (9) intact male and nine
(9) intact female beagles. The dogs are obese, weighing approximately 12 to 18 kg (26.4
to 39.6 lbs). During the first four weeks of the acclimation period, (or until the desired
starting weight is achieved), dogs are fed a laboratory a high fat (approx. 45%) dry food 20 that meets or exceeds the nutritional requirements for maintenance and health. All dogs
are fed ad libitum during this portion of the acclimation period to facilitate weight gain.
During the last two weeks of the acclimation period and for the remainder of the study, all
dogs are fed a commercial normal fat (approx. 12%) dry dog food, in order to reduce
endogenous เลปติน levels and restore เลปติน sensitivity. Dogs in treatment groups 1 and 2
continue to be provided with food ad libitum throughout the remainder of the study.
Animals in treatment group 3 are fed twice per day according to the label instructions for
the diet. Animals are allowed ad libitum access to water via bowls or an automatic
5 watering system contained in each cage. No other concomitant medications are
ถูกให้ during the course of the study.
This study is conducted as a randomized block design within each gender. Dogs
are randomly assigned to pens. Animals are blocked by baseline (Day -14) bodyweights
within each gender. There are three blocks with three males and three blocks with three 10 females_ Block one of males consist of the 3 males with lowest bodyweights and block
one of females will consist of the 3 females with lowest bodyweights. The second blocks
within each gender consist of the 3 males and 3 females with the next lowest
bodyweights. The final block within each gender contains the 3 males and 3 females with
the highest bodyweights.
15 The following table displays the treatments, dose regimens, and numbers of
animals employed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างที่ 1ได้รับโพลีเปปไทด์ของลำดับ ID ไม่: 1 หลักตามที่อธิบายไว้ใน US2012/0149, 636 โพลีเปปไทด์ของลำดับ ID ไม่: 1 จะทำ 4mg/mL ใน 20 มม.ทริสเรทติ้ง pH 4.0 ยูเรีย 2 M และเมไธโอนีน 50 มม. นี้สูตรโพลีเปปไทด์ 30K5 ตรึง (a-Methyl-w-amimooxyethylcarbamyl โพลีออกซีเอธิลีน Sunbright ME-300CAอีเดน ญี่ปุ่น) จะถูกเพิ่มตาด 10:1 ตรึงอัตราส่วนสบโพลีเปปไทด์ โพลีเปปไทด์และตรึงผสมเบา ๆ และ conjugation ได้รับอนุญาตให้ดำเนินต่อใน 48-72 ชั่วโมงที่ 28 องศาเซลเซียส PEGylated โพลีเปปไทด์แล้วบริสุทธิ์ โดยประจำ cation exchange chromatographyและส่วน lmg/ML ใน PBS (น้ำเกลือฟอสเฟต buffered) 7.4 ด้วย trehalose 4% 10 กระบวนการนี้ผลผสมซึ่งประกอบด้วยระหว่าง 1-2% ของเลขลำดับ ID: 1 โดยที่เมไธโอนีนแรกถูกแหวกออกข้อมูลชีวภาพการเพาะเลี้ยงเซลล์ HEK 293 15 stably จะ transfected กับทั้ง luciferase โปรแกรมรายงานยีนภายใต้ควบคุม OB-Rb (ตัวรับเลปติน), ซึ่งแสดงบนพื้นผิวเซลล์และองค์ประกอบตอบสนอง STAT3 เลปติน binds กับตัวรับเลปติน และเรียกใช้ STAT3 homodimers และ STAT3/STAT1 heterodimers การโต้ตอบ และผูกกับลำดับ STAT3องค์ประกอบที่ตอบสนองการ โต้ตอบนี้ไดรฟ์ของยีน luciferase และกระตุ้นเซลล์ 20 ผลิต luminescence จำนวน luminescence เป็นสัดส่วนกับการสารประกอบ กิจกรรมชีวภาพจะขึ้นอยู่กับ EC50 ของ 4 PL sigmoidalวันหนึ่งเซลล์ seeded เป็นจานดี 96 ที่เซลล์ดี 20000 และวางใน 37° C, 5%Incubator CO2 25 24-30 ชั่วโมงวันที่สองความเข้มข้นเริ่มต้นเลปตินสุนัขป่าชนิด (WT) และ PEGylated โพลีเปปไทด์อย่าง lis 1200 ng/mL จาก uL 400 เสียงจะมาจากแต่ละอย่าง และ 4 x dilutions ประจำจะผ่านแถวของบล็อกเจือจาง ครั้งแรก uL 300 ดีของตัวกลางทดสอบเพิ่มคอลัมน์ 2-11 แล้ว 100 uL จะถูกโอนย้ายจาก 1 คอลัมน์คอลัมน์ 2 ผสมอย่างระมัดระวัง และช้า (โดยพัทยา) 8 - 10 ครั้ง และจากนั้นโอน 100 uL จากคอลัมน์ 2 คอลัมน์ 3 และทำซ้ำจนถึงคอลัมน์ 11 ออกจากคอลัมน์12 เป็นตัวควบคุมขาวกระตุ้นไม่ดี เซลล์จะถูกกระตุ้น ด้วย dilutions ประจำเลปตินสุนัขป่าชนิด (WT) และ PEGylated แล้วโพลีเปปไทด์ตัวอย่าง 1 เซลล์จะถูกนำออกจากการบ่มเพาะวิสาหกิจ และสื่อเป็น aspirated จากดีแต่ละอย่าง แล้ว 100IAL/ดี แตกออก serially WT และ PEGylated โพลีเปปไทด์จะโอนจากบล็อกบาดาลเจือจางเซลล์ในแผ่นวิเคราะห์อย่างดี 96 ตัวอย่างที่ซ้ำนั้นสำหรับโพลีเปปไทด์ WT และ PEGylated ทดสอบแนวข้ามต่อไปแถวว่าง แผ่นที่ incubated ใน 37° C, 5% CO2 incubator 16-18 ชั่วโมง รูปแบบแผ่นที่ มีความเข้มข้นสุดท้ายใน ng/mL แสดงด้านล่าง[ng/mL] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12WT 1200 300 75 19 ภาษาอังกฤษ 4.68 ความ 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0cเลปตินWT 1200 300 75 19 ภาษาอังกฤษ 4.68 ความ 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0cเลปตินตัวอย่าง 1200 300 75 19 ภาษาอังกฤษ 4.68 ความ 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 01ตัวอย่าง 1200 300 75 19 ภาษาอังกฤษ 4.68 1,17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 01วันที่สามในวันที่สาม พื้นผิวเตรียมไว้ และเพิ่มเซลล์ และพวกเขาแล้ววัด โดยการ Luminometer ประมาณ 1-2 ชั่วโมงก่อนอ่านแผ่น 5 reagents Steady-ว่า (Proinega) หนึ่งชุดเป็นราคา thawed ที่รวมถึง: คอนแทคหนึ่งของ Steady Glo lyophilized Luciferase วิเคราะห์พื้นผิวและคอนแทคหนึ่งบัฟเฟอร์ Steady Glo Luciverase Assay ต่อทดสอบ จานที่อุณหภูมิห้อง เนื้อหาทั้งหมดของบัฟเฟอร์การทดสอบ luciverase (-10.5 mL) มี pipetted เป็นพื้นผิว lyophilized luciferase 100µL/ดี ของ reconstituted ที่ เพิ่มพื้นผิว luciferase ดีให้แต่ละแผ่นทดสอบและแผ่นทดสอบเป็น 10 ครอบคลุม ด้วยอลูมิเนียมฟอยล์ และ incubated สำหรับจาน 45-60 นาทีที่อุณหภูมิห้องเชคเกอร์ที่ 450-600 รอบต่อนาที แล้วมีอ่านจานบนเครื่อง Tecan GENiosPRO แผ่นอ่าน ด้วยรวมเวลาตั้งค่าเป็น 250 มิลลิวินาที แล้วมีป้อนข้อมูลลงใน Excel และ EC50 ตัวดำเนินการกำหนดในแอพลิเคชัน SigmaPlot และกิจกรรมขาดทุนเท่ากับที่ WT เลปตินและเปอร์เซ็นต์รู้จักญาติ determinations ยังทำ พับขาดทุน 15 กิจกรรมสัมพันธ์เลปตินสุนัขป่าชนิดที่กำหนด [EC50 ของตัวอย่าง] โดย [EC50 ของชนิดป่าเลปติน]; รู้จักญาติ%ของวิลเลียมเลปตินอ้างอิงมาตรฐานจะถูกคำนวณ โดยการหาร EC50 ของมาตรฐานอ้างอิงตามค่า EC50 ของโปรตีนเลปติน และคูณ ด้วย 100 ตัวอย่าง คำนวณ%รู้จักญาติเป็น [EC50 ของมาตรฐานอ้างอิง] โดย [EC50 ของตัวอย่าง] x5 100 ตารางต่อไปนี้แสดงราคา WT และ PEGylated โพลีเปปไทด์ 1 ตัวอย่างวิเคราะห์ใช้วิธีการเหล่านี้ตารางที่ 1Exp. exp. 1 โมเลกุล 2 AVG(EC50) (EC50) EC50สุนัข WT 1504 1954 1729เลปติน(เรย์ไบโอเทค)มนุษย์ WT 2052 3589 2820เลปติน (Ambrx)ตัวอย่าง 1 2183ผลลัพธ์แสดงว่า PEGylated การโพลีเปปไทด์ของการใช้งาน lis ของตัวอย่างในการ 10ข้อมูลชีวภาพในสัตว์ทดลองวัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการ ประเมินผลกระทบของการ PEGylated โพลีเปปไทด์ ตัวอย่าง 1 bodyweight องค์ประกอบร่างกาย และอาหารลักษณะในเพศชายอ้วน และสุนัขเพศหญิง PEGylated โพลีเปปไทด์ 1 ตัวอย่างสูตรที่ 5.1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตรในน้ำเกลือฟอสเฟต 15 buffered ด้วย pH 7.4 และ trehalose 4% (w/v) ใช้สิบแปด (18) สุนัขทั่ว (1) ขวบ: เก้า (9) เหมือนเดิมชายและเก้า(9) ถูกผู้หญิงเหมือนเดิม สุนัขจะอ้วน น้ำหนัก ประมาณ 12-18 กิโลกรัม (26.4 การ 39.6 ปอนด์) ในระหว่างสัปดาห์สี่แรกของ acclimation, (หรือจน กว่าที่ต้อง เริ่มต้นน้ำหนักทำ), สุนัขจะเลี้ยงอาหาร 20 ที่ตรง หรือเกินความต้องการทางโภชนาการสำหรับการบำรุงรักษาและสุขภาพ แห้งไขมันสูง (ประมาณ 45%) ห้องปฏิบัติการ สุนัขทั้งหมด จะเลี้ยง ad libitum ระหว่างส่วนนี้ของ acclimation เพื่อน้ำหนัก ช่วงสองสัปดาห์ของ acclimation และส่วน ที่เหลือของการศึกษา ทั้งหมด สุนัขจะเลี้ยงอาหารสุนัขแห้งไขมันทางการค้าปกติ (ประมาณ 12%) การลดระดับ endogenous เลปตินและคืนค่าความไวเลปติน สุนัขในกลุ่มรักษา 1 และ 2 ยังมีอาหาร ad libitum ทั่วส่วนเหลือของการศึกษา มีเลี้ยงสัตว์ในกลุ่มรักษา 3 สองครั้งต่อวันตามคำแนะนำของป้ายชื่อสำหรับ อาหาร สัตว์จะได้ ad libitum น้ำชามหรือโดยอัตโนมัติ 5 น้ำอยู่ในกรงแต่ละระบบ จะไม่ยามั่นใจ ถูกให้ระหว่างหลักสูตรของการศึกษาการศึกษานี้จะดำเนินเป็นแบบ randomized บล็อกภายในแต่ละเพศ สุนัข ได้ถูกกำหนดให้กับปากกา สัตว์จะถูกบล็อก โดยพื้นฐาน (-14 วัน) bodyweights ภายในแต่ละเพศ มีบล็อกที่สามกับสามชาย และบล็อกสามกับ females_ 10 สามบล็อกหนึ่งของเพศชายประกอบด้วยชาย 3 bodyweights ต่ำและบล็อก หญิงหนึ่งจะประกอบด้วยของฉัน 3 ด้วยราคา bodyweights บล็อกสอง ภายในแต่ละเพศประกอบด้วยเพศชาย 3 หญิง 3 ที่ มีต่อราคา bodyweights บล็อกสุดท้ายภายในแต่ละเพศประกอบด้วยชาย 3 หญิง 3 ที่มี bodyweights สูงสุด15 ตัวอย่างแสดงการรักษา ยา regimens และจำนวนสัตว์ที่ว่าจ้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างที่ 1
โพลีเปปไทด์ของ SEQ ID NO: 1 จะได้รับเป็นหลักที่อธิบายไว้ใน US2012 / 0149.636 โพลีเปปไทด์ของ SEQ ID NO: 1 เป็นสูตรที่จะ 4mg / มิลลิลิตรใน 20mm ทริสพีเอช 4.0; 2 เอ็มยูเรีย; และ 50 มิลลิเมไธโอนีน นี้สูตรโพลีเปปไทด์, 30K
5 PEG (a-Methyl-W-amimooxyethylcarbamyl, โพลีออกซีเอธิลีน, Sunbright ME-300CA,
นอฟ, ญี่ปุ่น) จะมีการเพิ่มการท่องเที่ยวแห่งประเทศไทย 10: 1 PEG ที่จะโพ ลีเปปไทด์อัตราส่วนโดยโมล โพลีเปปไทด์และ PEG ผสมเบา ๆ และผันได้รับอนุญาตให้ดำเนินการต่อไปสำหรับ 48-72 ชั่วโมงวันที่ 28 ° C PEGylated
โพลีเปปไทด์บริสุทธิ์แล้วโดยโคประจำการแลกเปลี่ยนประจุบวกและสูตรที่จะLMG / ML ในพีบีเอส (น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์) 7.4 4% ทรีฮาโล 10 ผลการดำเนินการนี้ในส่วนผสมที่มีอยู่ระหว่าง 1-2% ของ SEQ ID ไม่มี: 1
โดยที่ครั้งแรกที่เมไธโอนีนจะถูกแยกออก. ในหลอดทดลองข้อมูลทางชีวภาพ15 HEK 293 เซลล์ transfected แน่นแฟ้นกับทั้งนักข่าว luciferase ยีนภายใต้การควบคุมขององค์ประกอบการตอบสนองSTAT3 และ OB-Rb (เลปตินรับ) ซึ่งจะแสดงบนผิวเซลล์ เลปตินผูกกับเลปตินตัวรับและเปิดใช้งาน homodimers STAT3 และ STAT3 / STAT1 heterodimers ซึ่งโต้ตอบและผูกกับลำดับ STAT3 องค์ประกอบการตอบสนอง ปฏิสัมพันธ์นี้ไดรฟ์การแสดงออกของยีน luciferase และกระตุ้น20 เซลล์เพื่อผลิตเรืองแสง ปริมาณของแสงเรืองเป็นสัดส่วนกับการทำงานของสารประกอบ กิจกรรมทางชีวภาพจะขึ้นอยู่กับ EC50 ของเส้นโค้ง sigmoidal 4-PL ได้. วันหนึ่งเซลล์จะเมล็ดลงในแผ่น 96 หลุม 20,000 เซลล์ / ดีและอยู่ในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% 25 ศูนย์บ่มเพาะ CO2 สำหรับ 24-30 ชั่วโมง . วันที่สองความเข้มข้นเริ่มต้นสำหรับประเภทป่า (น้ำหนัก) สุนัขเลปตินและ PEGylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่างเงียบ ๆ 1,200 นาโนกรัม / มิลลิลิตร จากที่ 400 ปริมาณ uL จะมาจากกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนและเจือจางอนุกรม 4x จะทำผ่านแถวของบล็อกที่เจือจาง ครั้งแรก 300 UL / ดีของสื่อการทดสอบจะถูกเพิ่มในเทือกเขา 2-11 แล้ว 100 uL จะถูกโอนจากเทือกเขา 1 ถึงเทือกเขา2 ผสมอย่างระมัดระวังและอย่างช้า ๆ (ไม่เดือด) 8-10 ครั้งแล้วยังคงถ่ายโอน100 uL จากเทือกเขาเทือกเขา 2 3 และการทำซ้ำจนกว่าจะถึงเทือกเขา 11. ออกจากเทือกเขา12 ยกเลิก กระตุ้นการควบคุมที่ดี เซลล์ถูกกระตุ้นแล้วกับเจือจางอนุกรมของประเภทป่า (น้ำหนัก) สุนัขเลปตินและ PEGylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่าง 1. เซลล์จะถูกนำออกมาจากศูนย์บ่มเพาะและขนาดกลางที่มีการสำลักอย่างระมัดระวังจากกันได้ดี จากนั้น 100IAL / ดีของการปรับลดลำดับ WT และ PEGylated โพลีเปปไทด์จะถูกโอนจากบล็อกเจือจางลึกดีเพื่อเซลล์ในแผ่นทดสอบ 96 หลุม ตัวอย่างที่ซ้ำกันจะถูกสร้างขึ้นแล้วสำหรับ WT และ PEGylated โพลีเปปไทด์ที่ผ่านการทดสอบแนวนอนต่อไปแถวที่มีอยู่ แผ่นได้รับการบ่มในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, ศูนย์บ่มเพาะ CO2 5% สำหรับ 16-18 ชั่วโมง รูปแบบแผ่นที่มีความเข้มข้นสุดท้ายใน ng / แสดงอยู่ด้านล่าง. [ng /] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 WT 1200 300 75 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0 คเลปตินWT 1200 75 300 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0 คเลปตินอย 1200 300 75 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0 1 ตัวอย่าง 75 300 1200 19 4.68 1.17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0 1 วันที่สามในวันที่สามซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่มีการเตรียมความพร้อมและเพิ่มเข้าไปในเซลล์และพวกเขาจะจากนั้นวัดจาก Luminometer ประมาณ 1-2 ชั่วโมงก่อนที่แผ่นจะอ่านหนึ่งชุดของ 5 Steady-Glo (Proinega) น้ำยาละลายที่รวมถึง: หนึ่งขวด Steady-Glo แห้งluciferase วิเคราะห์พื้นผิวและขวดหนึ่งของบัฟเฟอร์ Steady-Glo Luciverase Assay ต่อการทดสอบจานที่อุณหภูมิห้อง เนื้อหาทั้งหมดของบัฟเฟอร์ทดสอบ luciverase (-10.5mL) มีการปิเปตเข้าไปในพื้นผิว luciferase แห้ง 100μL / ดีของสร้างพื้นผิวluciferase จะถูกเพิ่มเข้าไปที่ดีของแต่ละแผ่นทดสอบและแผ่นทดสอบที่ปกคลุมไป 10 กับอลูมิเนียมและบ่มที่อุณหภูมิห้องนาน 45-60 นาทีบนจานปั่นตั้งไว้ที่450-600 รอบต่อนาที แผ่นจะถูกอ่านจากนั้นในการอ่านแผ่น GENiosPRO Tecan บูรณาการที่มีเวลาตั้งถึง 250 มิลลิวินาที ข้อมูลจะถูกป้อนเข้าไปใน Excel และความมุ่งมั่นในการ EC50 SigmaPlot ประยุกต์ใช้คือการดำเนินการและกิจกรรมสัมพันธ์สูญเสียเท่าเป็นรุ่นWT เลปตินและร้อยละหาความแรงญาตินอกจากนี้ยังดำเนินการ พับการสูญเสีย 15 กิจกรรมสัมพันธ์กับการป่าประเภทสุนัขเลปตินจะถูกกำหนดให้เป็น [EC50 ของกลุ่มตัวอย่าง] หารด้วย [EC50 ของป่าประเภทเลปติน]; โฟลเดอร์% เมื่อเทียบแรงของเลปตินโปรตีนอ้างอิงมาตรฐานที่มีการคำนวณโดยการหารEC50 ของการอ้างอิงมาตรฐานโดยค่า EC50 ของเลปตินโปรตีนและคูณด้วย 100 ตัวอย่างเช่น% เทียบศักยภาพคำนวณเป็น [EC50 ของอ้างอิง มาตรฐาน] หารด้วย [EC50 ของกลุ่มตัวอย่าง] x 5 100 ตารางต่อไปนี้แสดงให้เห็น WT และ PEGylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่างที่ 1 การวิเคราะห์โดยใช้วิธีการเหล่านี้. ตารางที่ 1 โมเลกุลประสบการณ์ 1 ประสบการณ์ 2 AVG (EC50) (EC50) EC50 WT สุนัข 1,504 1,954 1,729 เลปติน(เรย์ไบโอเทค) WT มนุษย์ 2052 3589 2820 เลปติน (Ambrx) ตัวอย่างที่ 1 2183 ผลการศึกษาพบว่า PEGylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่างเงียบ ๆ ที่ใช้งานในหลอดทดลอง 10 ในร่างกายข้อมูลทางชีวภาพวัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการประเมินผลกระทบของการ PEGylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่างที่1 เมื่อน้ำหนักของร่างกายและพฤติกรรมการกินอาหารในโรคอ้วนชายและเพศหญิงdogs.The PEGylated โพลีเปปไท ด์ของตัวอย่างที่ 1 สูตรที่ 5.1 mg / ml 15 ฟอสเฟตน้ำเกลือบัฟเฟอร์ที่มีค่า pH 7.4 และ 4% (w / v) ทรีฮาโล. สิบแปด (18) สุนัขทั่วทุกมุมหนึ่ง (1) ปีเก่ามีการใช้เก้า (9) เหมือนเดิมชายและเก้า(9) หญิงเหมือนเดิมล่าสัตว์ สุนัขเป็นโรคอ้วนมีน้ำหนักประมาณ 12-18 กิโลกรัม (26.4 ที่จะ£ 39.6) ในช่วงสี่สัปดาห์แรกของการปรับสภาพ (หรือจนกว่าที่ต้องการน้ำหนักเริ่มต้นจะประสบความสำเร็จ) สุนัขเลี้ยงในห้องปฏิบัติการที่มีไขมันสูง (ประมาณ. 45%) 20 อาหารแห้งที่ตรงหรือเกินกว่าความต้องการทางโภชนาการสำหรับการบำรุงรักษาและสุขภาพ สุนัขทั้งหมดถูกเลี้ยงโฆษณา libitum ระหว่างส่วนของระยะเวลาการปรับตัวนี้เพื่ออำนวยความสะดวกการเพิ่มน้ำหนัก. ในช่วงสองสัปดาห์สุดท้ายของระยะเวลาปรับตัวและสำหรับส่วนที่เหลือของการศึกษาทั้งหมดสุนัขเป็นอาหารไขมันปกติในเชิงพาณิชย์ (ประมาณ. 12%) แห้ง อาหารสุนัขเพื่อลดภายนอกเลปตินและเรียกคืนระดับเลปตินไว สุนัขในกลุ่มการรักษาที่ 1 และ 2 ยังคงที่จะให้มีอาหารที่โฆษณา libitum ตลอดของการศึกษา. สัตว์ในกลุ่มการรักษา 3 เป็นอาหารวันละสองครั้งตามคำแนะนำในฉลากสำหรับอาหาร สัตว์ที่ได้รับอนุญาตเข้าถึงโฆษณา libitum น้ำชามหรือผ่านทางอัตโนมัติระบบรดน้ำ5 ที่มีอยู่ในแต่ละกรง ไม่มียาด้วยกันอื่น ๆ จะถูกให้ในช่วงของการศึกษา. การศึกษาครั้งนี้จะดำเนินการในขณะที่การออกแบบบล็อกสุ่มภายในแต่ละเพศ สุนัขจะถูกสุ่มให้ปากกา สัตว์ที่ถูกบล็อกโดยพื้นฐาน (วัน -14) bodyweights ภายในแต่ละเพศ มีสามช่วงตึกสามเพศชายและสามช่วงตึกสาม 10 females_ บล็อกหนึ่งของเพศชายประกอบด้วย 3 เพศกับ bodyweights ต่ำสุดและป้องกันการเป็นหนึ่งในเพศหญิงจะประกอบด้วย3 หญิงต่ำสุด bodyweights บล็อกที่สองที่อยู่ในแต่ละเพศประกอบด้วย 3 เพศชายและเพศหญิงมี 3 ต่ำสุดถัดไป bodyweights บล็อกสุดท้ายที่อยู่ในแต่ละเพศมี 3 เพศชายและเพศหญิง 3 กับbodyweights สูงสุด. 15 ตารางต่อไปนี้แสดงการรักษา, ยายาและหมายเลขของสัตว์ลูกจ้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่างที่ 1
โพลีเปปไทด์ seq ของหมายเลข 1 จะได้รับเป็นหลักที่อธิบายไว้ใน us2012 / 0149636 . การโพลีเปปไทด์ seq ของหมายเลข 1 เป็นสูตรเพื่อ 4mg / ml ใน 20mm ซึ่ง pH 4.0 2 M ยูเรีย และเมไธโอนีน 50 มิลลิเมตร สูตรนี้โพลีเปปไทด์ 30k
5 , PEG ( a-methyl-w-amimooxyethylcarbamyl โพลีออกซีเอธิลีน , sunbright ของ me-300ca
, , ,ญี่ปุ่น ) จะถูกเพิ่มเป็น 10 : 1 ททท. หมุดโพลีเปปไทด์อัตราส่วนกราม และที่โพลีเปปไทด์ตรึงผสมเบา ๆ และการได้รับอนุญาตให้ดำเนินการใน 48-72 ชั่วโมง 28 ° C pegylated โพลีเปปไทด์แล้วทำให้บริสุทธิ์ โดยการแลกเปลี่ยนประจุบวกและโครมาโตกราฟีน
สูตร lmg / ml ใน PBS ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 4 ) 7.4 % การ .10 ขั้นตอนนี้ผลลัพธ์ในส่วนผสมซึ่งประกอบด้วย 1-2 % ของ seq id : 1
โดยที่เมไธโอนีนแรกที่แหวกออก




ในหลอดทดลองข้อมูลทางชีววิทยา
15 hek 293 เซลล์จะเสถียร transfected ทั้งลูซิเฟอเรส นักข่าวจีน ภายใต้การควบคุมขององค์ประกอบการ
stat3 และ OB RB ( เลปติน receptor ) ซึ่งจะแสดงบนพื้นผิวเซลล์เลปตินที่ผูกกับเลปตินตัวรับและกระตุ้นและ homodimers stat3 stat3 / stat1 heterodimers ซึ่งโต้ตอบ และผูกกับ stat3 ลำดับ
การตอบสนององค์ประกอบ นี้ปฏิสัมพันธ์ทำให้การแสดงออกของยีนและกระตุ้นเอนไซม์ลูซิเฟอเรส
20 เซลล์ผลิตเรืองแสง ปริมาณของการเป็นสัดส่วนกับกิจกรรม
สารประกอบ .กิจกรรมทางชีวภาพขึ้นอยู่กับ ec50 ของ 4-pl sigmoidal โค้ง .



วันหนึ่งเซลล์เมล็ดเป็น 96 ดีจานที่ 20 , 000 เซลล์และวางไว้ใน 37 ° C 5 %
25 CO2 Incubator สำหรับ 24 ชั่วโมง .



วันที่สองเริ่มเข้มข้นชนิด ( ป่าโดยน้ำหนัก ) เลปตินสุนัขและ pegylated โพลีเปปไทด์เช่น LIS 200 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร จากที่ปริมาณ 400 UL จะมาจากแต่ละตัวอย่างและวิธีการทำ 4x อนุกรมผ่านแถวของการ Block 1 , 300 UL / ดีของการทดสอบกลางเพิ่มคอลัมน์ 2-11 . แล้ว 100 UL จะถูกโอนจากคอลัมน์ 1 คอลัมน์ที่ 2

ผสมอย่างระมัดระวังและช้า ( ไม่มีฟอง ) 8-10 ครั้ง และก็ยังคง
โอน 100 UL จากคอลัมน์ 2 คอลัมน์ 3 คอลัมน์ และทำซ้ำจนกว่าจะถึง 11 จากคอลัมน์
12 และกระตุ้นการควบคุมดี เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย Serial แล้ววิธีการประเภทป่า ( WT ) เลปตินสุนัขและ pegylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่าง 1 เซลล์จะถูกเอาออกจากตู้อบ และสื่ออย่างลมจากแต่ละคนได้ดีแล้ว 100ial / ดีของอนุกรมเจือจาง WT และ pegylated โพลีเปปไทด์มาจากบ่อน้ำลึกในบล็อกของเซลล์ใน 96 ดี ( แผ่น ตัวอย่างที่ซ้ำกันจะสร้างและทดสอบน้ำหนัก pegylated โพลีเปปไทด์แนวนอนข้ามต่อไป
มีอยู่แถว แผ่น ) 37 ° C 5% CO2 สำหรับตู้ 16-18 ชั่วโมงจานสุดท้ายรูปแบบกับความเข้มข้นใน ng / ml แสดงอยู่ด้านล่าง




[ ng / ml ] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
WT 1200 300 75 19 4.68 เท่ากับ 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
C
เลปติน WT 1200 300 75 19 4.68 เท่ากับ 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
C เลปติน
ตัวอย่าง 1 , 200 300 75 19 4.68 เท่ากับ 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
1
ตัวอย่าง 1 , 200 300 75 19 4.68 1,17 0.29 0.073 0.018 0.0046 0.0011 0
1


วันที่สาม
ในวันที่สาม พื้นผิวที่เตรียมไว้และเพิ่มไปยังเซลล์และพวกเขาจากนั้น
วัดโดยลูมิโนมิเตอร์ . ประมาณ 1-2 ชั่วโมงก่อนแผ่นจะอ่าน หนึ่งชุด 5 ฯมั่นคง ( proinega ) สารเคมีละลายที่รวมถึง : หนึ่งขวดของมั่นคงฯแห้ง
ลูซิเฟอเรส ( ต่อหนึ่งขวด ( บัฟเฟอร์ ) luciverase มั่นคงฯต่อ
จานที่อุณหภูมิห้องเนื้อหาทั้งหมดของ luciverase ในบัฟเฟอร์ ( - 10.5ml )
เป็น pipetted เป็นโปรตีนลูซิเฟอเรสที่ทนทาน 100 µ L / ดีของธรรมชาติ
ลูซิเฟอเรส ( เพิ่ม กันของแบคทีเรียและแผ่น ( แผ่นปกคลุมด้วยอลูมิเนียม 10 บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 45-60 นาทีบนจาน
Shaker ตั้งไว้ที่ 450 ถึง 600 รอบต่อนาทีป้ายแล้วอ่านบน TECAN geniospro จานอ่านรวมเวลาตั้ง 250 มิลลิวินาที . ข้อมูล แล้วใส่ลงใน Excel และมุ่งมั่นในการ ec50 sigmaplot จะดําเนินการและกิจกรรมพับการสูญเสียญาติ
WT เลปตินและร้อยละ รวมทั้งความแรงสัมพัทธ์จะยังดำเนินการพับกิจกรรมการสูญเสีย 15 เทียบกับป่าประเภทสุนัขเลปตินมุ่งมั่นที่จะเป็น ec50 ของ [ ตัวอย่าง ]
[ ec50 แบ่งตามประเภทของป่าเลปติน ] ; ความแรงสัมพัทธ์ของเลปติน

% โปรตีนมาตรฐานอ้างอิงที่คำนวณโดยการหาร ec50 อ้างอิงมาตรฐาน โดย ec50 คุณค่าของโปรตีนเลปตินและคูณด้วย 100 . สำหรับอินสแตนซ์% เทียบความแรงคำนวณเป็น [ อ้างอิง ] ec50 ของมาตรฐาน โดยแบ่งออก ec50 ของตัวอย่าง ] [ x
5 100 ตารางต่อไปนี้แสดง pegylated WT และโพลีเปปไทด์ของตัวอย่างที่ 1 วิเคราะห์
โดยใช้วิธีการเหล่านี้




1 ตารางที่ 1 โมเลกุล EXP EXP 2 AVG
( ec50 ) ( ec50 ) ec50
WT สุนัข 1504 1954 1729

( เลปตินเรย์ Biotech )

เลปติน WT มนุษย์ 2052 3589 1965 ( ambrx )

ตัวอย่าง 1 2183ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่า pegylated โพลีเปปไทด์เช่น LIS ใช้งานหลอด 10

ข้อมูลทางชีววิทยาในร่างกาย การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลกระทบของ pegylated โพลีเปปไทด์
ของตัวอย่างที่ 1 เมื่อชั่งน้ำหนัก , องค์ประกอบของร่างกายและพฤติกรรมการกินอาหารในอ้วนชาย
สุนัขเพศเมีย . pegylated โพลีเปปไทด์ของตัวอย่าง 1 สูตรที่ 51 มก. / มล. เกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ใน 15 มี pH 7.4 และ 4 % ( w / v ) การ .
สิบแปด ( 18 ) สุนัขมากกว่าหนึ่ง ( 1 ) ปีเก่าที่ใช้ : เก้า ( 9 ) เหมือนเดิม ชายเก้า
( 9 ) beagles หญิงเหมือนเดิม สุนัขอ้วน หนักประมาณ 12 ถึง 18 กิโลกรัม ( 26.4
ถึง 65 ปอนด์ ) ในช่วง 4 สัปดาห์แรกของระยะเวลา acclimation , ( หรือจนกว่าที่ต้องการ
เริ่มน้ำหนักได้ )สุนัขที่เลี้ยงในห้องปฏิบัติการที่มีไขมันสูง ( ประมาณ 35% ) บริการอาหาร 20 ที่ตรงกับ หรือเกินกว่าความต้องการทางโภชนาการและการบำรุงรักษาสุขภาพ ทั้งหมดสุนัข
fed อย่างเต็มที่ในส่วนของระยะเวลา acclimation เพื่อความสะดวกในการเพิ่มน้ำหนัก
ช่วงสองสัปดาห์สุดท้ายของระยะเวลา acclimation และส่วนที่เหลือของการศึกษา , สุนัข
เป็นอาหารเชิงพาณิชย์ปกติไขมัน ( ประมาณ12 % ) อาหารสุนัขแห้ง เพื่อลดระดับเลปติน
ภายนอกและเรียกคืนเลปตินไว สุนัขในกลุ่มที่ 1 และ 2
ยังคงได้รับอาหารหยาบโฆษณาตลอดส่วนที่เหลือของการศึกษา สัตว์ในกลุ่มทดลองที่ 3
เป็นอาหารวันละสองครั้งตามฉลากคำแนะนำสำหรับ
อาหารสัตว์ที่ได้รับอนุญาตอย่างเต็มที่ใช้น้ำผ่านชามหรือระบบรดน้ำต้นไม้อัตโนมัติ
5 ที่มีอยู่ในแต่ละกรง ไม่เกิดโรคอื่น ๆ
ถูกให้ในระหว่างหลักสูตรของการศึกษา .
ศึกษาเป็น randomized block design ในแต่ละเพศ สุนัข
มีวัตถุประสงค์เพื่อปากกา สัตว์ที่ถูกบล็อกโดยพื้นฐาน ( วันที่ 14 ) bodyweights
ภายในแต่ละเพศมี 3 บล็อก กับชายสามคนและสามบล็อกที่มีสาม 10 females_ บล็อกหนึ่งคน ประกอบด้วยชาย 3 คน กับ bodyweights ต่ำสุดและบล็อก
หนึ่งของผู้หญิงจะประกอบด้วย 3 เมียสุด bodyweights . สองบล็อก
ภายในแต่ละเพศ ประกอบด้วยชาย 3 คน หญิง 3 กับอีกค่า
bodyweights .สุดท้ายบล็อกในแต่ละเพศมีชาย 3 คน หญิง 3 bodyweights สูงสุดด้วย
.
15 ตารางต่อไปนี้แสดงการรักษา ปริมาณยา และตัวเลขของ

ใช้สัตว์