For each mutant, a colony that gene

For each mutant, a colony that generated both flanking-PCR products was selected and plated on MRS with and without 30 μg·ml−1 erythromycin. A single colony for each mutant displaying the anticipated erythromycin-sensitive phenotype was selected and designated NZ3410CM (ΔctsR::cat) and NZ3425CM (ΔhrcA::cat), the latter resulting from the use of plasmid pNZ3425. The L. plantarum WCFS1 ctsR-hrcA mutant was constructed in the NZ3410CM (ΔctsR::cat) background in two steps. First, strain NZ3410 (ΔctsR) was constructed by excision of the lox66-P32-cat-lox71 cassette by expression of the Cre resolvase enzyme from pNZ5348 according to methods described by Lambert et al. (34). Introduction of pNZ3423 and colony confirmation by PCR resulted in strain NZ3423CM (ΔctsR ΔhrcA::cat) (see Table S1 in the supplemental material).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับแต่ละ mutant อาณานิคมที่สร้างผลิตภัณฑ์ PCR ขนาบทั้งสองถูกเลือก และชุบบน MRS มี และไม่ มีร่าง μg·ml−1 30 อาณานิคมเดียวสำหรับมนุษย์กลายพันธุ์แต่ละแสดงกนิร่างสำคัญคาดว่าจะถูกเลือก และกำหนด NZ3410CM (ΔctsR::cat) และ NZ3425CM (ΔhrcA::cat), เป็นผลหลังจากการใช้ plasmid pNZ3425 การกลายพันธุ์ L. บาซิลลัส WCFS1 ctsR-hrcA สร้าง NZ3410CM พื้นหลัง (ΔctsR::cat) ในขั้นตอนที่สอง ครั้งแรก สายพันธุ์ NZ3410 (ΔctsR) ก่อตั้งขึ้น โดยการผ่าตัดเล็กของกลักกระดาษ lox66 P32 แมว lox71 โดยการแสดงออกของเอนไซม์ resolvase Cre จาก pNZ5348 ตามวิธีที่อธิบายไว้โดยแลมเบิร์ต et al. (34) แนะนำของ pNZ3423 และอาณานิคมยืนยันโดย PCR ผลในสายพันธุ์ NZ3423CM (ΔctsR ΔhrcA::cat) (ดูตาราง S1 ในวัสดุเสริม)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับแต่ละกลายพันธุ์อาณานิคมที่สร้างทั้งขนาบ-PCR ผลิตภัณฑ์ได้รับการคัดเลือกและชุบบน MRS ที่มีและไม่มี 30 ไมโครกรัม· ML-1 erythromycin อาณานิคมเดียวสำหรับแต่ละกลายพันธุ์แสดงฟีโนไทป์ erythromycin ที่มีความอ่อนไหวที่คาดว่าจะได้รับการคัดเลือกและได้รับมอบหมาย NZ3410CM (ΔctsR :: แมว) และ NZ3425CM (ΔhrcA :: แมว) หลังเกิดจากการใช้พลาสมิด pNZ3425 กลายพันธุ์ L. plantarum WCFS1 ctsR-hrcA ถูกสร้างขึ้นใน NZ3410CM (ΔctsR :: แมว) พื้นหลังในขั้นตอนที่สอง ครั้งแรกของสายพันธุ์ NZ3410 (ΔctsR) ถูกสร้างขึ้นโดยการตัดออกจากเทป lox66-P32-แมว lox71 โดยแสดงออกของเอนไซม์ resolvase Cre จาก pNZ5348 ตามวิธีการอธิบายโดยแลมเบิร์ตอัล (34) บทนำของ pNZ3423 และการยืนยันอาณานิคมโดยวิธี PCR ผลในสายพันธุ์ NZ3423CM (ΔctsRΔhrcA :: แมว) (ดูตาราง S1 ในวัสดุเสริม)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับแต่ละสายพันธุ์ เป็นอาณานิคมที่สร้างขึ้นทั้งโดยเลือกจและผลิตภัณฑ์ชุบบนคุณมี 30 μ G ด้วย− 1 + ซิน อาณานิคมเดียวสำหรับแต่ละการแสดงฟีโนไทป์กลายพันธุ์คาดซินอ่อนไหวและเลือกเขต nz3410cm ( Δ ctsr : : แมว ) และ nz3425cm ( Δ hrca : : แมว ) , หลังซึ่งเกิดจากการใช้พลาสมิด pnz3425 . ส่วน L . plantarum wcfs1 ctsr hrca กลายพันธุ์ที่ถูกสร้างขึ้นใน nz3410cm ( Δ ctsr : : แมว ) พื้นหลังในขั้นตอนที่สอง แรก nz3410 สายพันธุ์ ( Δ ctsr ) ถูกสร้างขึ้นโดยการตัดออกจาก lox66-p32-cat-lox71 เทป โดยการแสดงออกของเอนไซม์ CRE resolvase จาก pnz5348 ตามวิธีการที่อธิบายโดย Lambert et al . ( 34 ) แนะนำ pnz3423 อาณานิคมด้วยวิธี PCR และการยืนยันผลใน nz3423cm สายพันธุ์ ( Δ ctsr Δ hrca : : แมว ) ( ตาราง S1 ในวัสดุเสริม )