Based on SDS–PAGE analysis, rSBgl3H

Based on SDS–PAGE analysis, rSBgl3His was purified to apparent
homogeneity using three chromatography steps including
DEAE-cellulose, IMAC (Ni2+sepharose) and Sephacryl S-200 column
chromatography. This purification protocol increased the specific
activity of rSBgl3His by 323-fold with a 16.4% yield (Table 1).
The purified enzyme gave a broad band and a very thin band with
apparent molecular weights (Mr) of 140 kDa, on an SDS–PAGE
stained with Coomassie blue R-250 (Fig. 3, lanes (1). After digestion
with Endo H, a single sharp band of enzyme was obtained with Mr
of 70 kDa (Fig. 2, lane (2), together with the Endo H band. Gel filtration
of the recombinant enzyme on Superdex S-200 gave a
molecular weight of approximately 169.5 kDa (data not shown);
therefore, the recombinant enzyme appeared to be a monomer.
Like other glycosidases, the appearance of a broad band, rather
than a sharp band, for the purified enzyme in SDS–PAGE resulted
from multiple glycosylation states of the recombinant protein, as
previously published (Toonkool et al., 2006; Suthangkornkul
et al., 2015). Additionally, obvious hypermannosylation has been
reported for some extracellular proteins expressed by P. pastoris,
with lengths of up to 50–150 mannose residues (Cereghino and
Cregg, 2000). The subunit Mr of rSBgl3His at 140 kDa was higher
than that of natural SBgl3 at 80.7 kDa and its theoretical molecular
weight of 68 kDa, indicating that rSBgl3His was hyperglycosylated.
To test whether rSBgl3His was glycosylated, rSBgl3His was cleaved
with endoglycosidase H (EndoH) and then analyzed by SDS–PAGE.
After treatment of purified rSBlg3His with EndoH, the protein band
of rSBlg3His was shifted from 140 to 70 kDa (Fig. 3), indicating that
rSBgl3His was a glycoprotein. A single band at approximately
70 kDa (Fig. 3, lane 2) was further analyzed by LC–MS/MS to obtain
the mass per charge ratios of the peptides (Supplementary Table 1),
which were then analyzed using the Mascot software against the
NCBInr database. The results showed that five tryptic peptide
sequences were identical to the corresponding peptides translated
from the cDNA encoding the SBgl3 gene (this study), as shown in
Fig. 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จากการวิเคราะห์สารเคมี – หน้า rSBgl3His บริสุทธิ์ให้ชัดเจนเนื้อเดียวกันใช้ chromatography สามขั้นตอนรวมถึงDEAE-เซลลูโลส IMAC (Ni2 + sepharose) และคอลัมน์ Sephacryl S-200chromatography โพรโทคอลนี้ทำให้บริสุทธิ์เพิ่มขึ้นเฉพาะกิจกรรมของ rSBgl3His โดย 323-fold กับผลผลิต 16.4% (ตารางที่ 1)ทำให้เอนไซม์บริสุทธิ์วงกว้างและวงดนตรีบางมากด้วยน้ำหนักโมเลกุลชัดเจน (Mr) ของ 140 kDa, SDS – หน้าย้อม ด้วย Coomassie blue R-250 (รูป 3 เลน (1) หลังจากย่อยอาหารกับเอนโด H คมวงเดียวของเอนไซม์มากับนายของ 70 kDa (รูป 2 เลน (2), ร่วมกับวงโด H กรองเจลของเอนไซม์ recombinant บน Superdex S-200 ให้เป็นน้ำหนักโมเลกุลของ kDa 169.5 ประมาณ (ข้อมูลไม่แสดง);ดังนั้น เอนไซม์ recombinant ที่ดูเหมือนจะ เป็นน้ำยาเช่น glycosidases อื่น ๆ ลักษณะที่ปรากฏของแบบคร่าว ๆ วง ค่อนข้างกว่าวงดนตรีคม สำหรับเอนไซม์บริสุทธิ์ใน SDS – หน้าผลจากอเมริกา glycosylation หลายของ recombinant โปรตีน เป็นก่อนหน้านี้เผยแพร่ (Toonkool et al. 2006 Suthangkornkulet al. 2015) นอกจากนี้ hypermannosylation ที่ชัดเจนได้รายงานสำหรับโปรตีนสารบางอย่างที่แสดง โดย P. pastorisมีความยาวถึง 50-150 mannose ตก (Cereghino และCregg, 2000) ย่อยของ rSBgl3His ที่ 140 kDa นายได้สูงขึ้นกว่าของ SBgl3 ธรรมชาติที่ 80.7 kDa และทฤษฎีของโมเลกุลน้ำหนัก 68 kDa ระบุ rSBgl3His ที่ถูก hyperglycosylatedเพื่อทดสอบว่า rSBgl3His ถูก glycosylated แหวก rSBgl3Hisกับ endoglycosidase H (EndoH) และวิเคราะห์ โดย SDS – หน้าแล้วหลังการรักษาของ rSBlg3His บริสุทธิ์กับ EndoH แถบโปรตีนของ rSBlg3His ถูกเลื่อนจาก 140 ไป 70 kDa (3 รูป), เพื่อระบุว่าrSBgl3His แก้ไขเป็นไกลโคโปรตีน เดียวที่วงประมาณ70 kDa (รูป 3 เลน 2) ที่มีวิเคราะห์เพิ่มเติม โดย LC – MS/MS เพื่อขอรับมวลต่ออัตราค่าธรรมเนียมของเปปไทด์ (1 ตารางเสริม),ที่แล้วถูกวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรมมิ่งขวัญกับการฐานข้อมูล NCBInr ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าห้า tryptic เปปไทด์ลำดับเหมือนกันกับเปปไทด์ที่สอดคล้องกันแปลจาก cDNA เข้ารหัสยีน SBgl3 (การศึกษานี้), ดังที่แสดงในรูปที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จากการวิเคราะห์ระบบ SDS-หน้า rSBgl3His บริสุทธิ์ที่จะเห็นได้ชัด
เป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้ขั้นตอนที่สามโครมาโตรวมทั้ง
DEAE-เซลลูโลส IMAC (Ni2 + Sepharose) และคอลัมน์ Sephacryl S-200
โครมาโต โปรโตคอลบริสุทธิ์นี้เพิ่มขึ้นโดยเฉพาะ
การทำงานของ rSBgl3His โดย 323 เท่าที่มีอัตราผลตอบแทน 16.4% (ตารางที่ 1).
เอนไซม์บริสุทธิ์ให้เป็นวงกว้างและวงดนตรีที่บางมากที่มี
น้ำหนักโมเลกุล (นาย) 140 กิโลดาลตันบน SDS- หน้า
ย้อมด้วย Coomassie สีฟ้า R-250 (รูปที่. 3 เลน (1). หลังจากการย่อยอาหาร
กับ Endo H, วงคมเดียวของเอนไซม์ที่ได้รับกับนาย
70 กิโลดาลตัน (รูป. 2 เลน (2) ร่วมกับ . Endo H วงกรองเจล
ของเอนไซม์ใน Superdex S-200 ให้
น้ำหนักโมเลกุลประมาณ 169.5 กิโลดาลตัน (ไม่ได้แสดงข้อมูล);
ดังนั้นเอนไซม์ recombinant ดูเหมือนจะเป็นโมโนเมอร์.
เช่นเดียวกับลูโคซิเดอื่น ๆ ลักษณะของวงดนตรีในวงกว้าง ค่อนข้าง
มากกว่าวงดนตรีที่คมชัดสำหรับเอนไซม์ในระบบ SDS-PAGE ผล
จากรัฐ glycosylation หลายของโปรตีนเป็น
เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Toonkool et al, 2006;. Suthangkornkul
. et al, 2015). นอกจากนี้ hypermannosylation ที่ชัดเจนได้
รายงานคุณสมบัติโปรตีนบางคนแสดงโดยพี pastoris,
ที่มีความยาวได้ถึง 50-150 ตกค้างแมนโนส (Cereghino และ
Cregg, 2000) subunit นายของ rSBgl3His ที่ 140 กิโลดาลตันสูง
กว่าที่ SBgl3 ธรรมชาติที่ 80.7 กิโลดาลตันและโมเลกุลทฤษฎี
น้ำหนัก 68 กิโลดาลตันแสดงให้เห็นว่า rSBgl3His ถูก hyperglycosylated.
ต้องการทดสอบว่า rSBgl3His ถูก glycosylated, rSBgl3His ถูกตัด
ด้วย endoglycosidase H (Endoh) และ แล้ววิเคราะห์โดยวิธี SDS-PAGE.
หลังจากการรักษาของ rSBlg3His บริสุทธิ์กับ Endoh วงโปรตีน
ของ rSBlg3His ขยับ 140-70 กิโลดาลตัน (รูปที่. 3) แสดงให้เห็นว่า
rSBgl3His เป็นไกลโคโปรตีน วงเดียวที่ประมาณ
70 กิโลดาลตัน (รูปที่. 3 เลน 2) ได้รับการวิเคราะห์ต่อไปโดย LC-MS / MS ที่จะได้รับ
มวลต่ออัตราส่วนค่าใช้จ่ายของเปปไทด์ (เสริมตารางที่ 1)
ซึ่งได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์มิ่งขวัญกับ
ฐานข้อมูล NCBInr ผลการศึกษาพบว่าห้าเปปไทด์ทริปซิ
ลำดับเหมือนกับเปปไทด์ที่เกี่ยวข้องแปล
จาก cDNA เข้ารหัสยีน SBgl3 (การศึกษานี้) ดังแสดงใน
รูปที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตาม SDS การวิเคราะห์หน้างาน rsbgl3his บริสุทธิ์ที่จะปรากฏใช้ 3 ขั้นตอน ได้แก่ ความสม่ำเสมอของโครมาโตกราฟีDEAE เซลลูโลส iMac ( ni2 + sephacryl s-200 เกี่ยวข้อง ) และคอลัมน์โครมาโตกราฟี นี้การเพิ่มเฉพาะโปรโตคอลกิจกรรมของ rsbgl3his โดย 323 พับกับ 16.4 เปอร์เซ็นต์ ( ตารางที่ 1 )เอนไซม์ให้ในวงกว้างและวงดนตรีที่บางมากด้วยน้ำหนักอณูชัดเจน ( MR ) 140 กิโล บน SDS - หน้าที่เต็มไปด้วยเหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้า r-250 ( ภาพที่ 3 เลน ( 1 ) หลังจากการย่อยกับเอ็นโด H , วงดนตรีคมเดียวของเอนไซม์ได้กับคุณ70 กิโลดาลตัน ( รูปที่ 2 เลน ( 2 ) ร่วมกันกับ Endo H วง แบบเจลของเอนไซม์ที่ใช้ใน superdex s-200 ให้น้ำหนักโมเลกุลประมาณ 169.5 ดาลตัน ( ข้อมูลไม่แสดง )ดังนั้นเอนไซม์ recombinant ที่ดูเหมือนจะเป็นโมโนเมอร์ชอบ glycosidases อื่น ลักษณะเป็นวงกว้าง ค่อนข้างกว่าวงดนตรีคม สำหรับเอนไซม์ใน SDS - หน้า ส่งผลให้จากหลายรัฐของ glycosylation โปรตีนรีคอมบิแนนท์ ,เผยแพร่ก่อนหน้านี้ ( toonkool et al . , 2006 ; suthangkornkulet al . , 2015 ) นอกจากนี้ hypermannosylation ได้ชัดเจนรายงานพบว่า โปรตีนที่แสดงออกโดยหน้า pastoris บาง ,ที่มีความยาวถึง 50 – 150 แมน ( cereghino ตกค้างและcregg , 2000 ) ที่ 1 นายของ rsbgl3his ที่ 140 กิโลสูงกว่าที่ธรรมชาติ sbgl3 ที่ 80.7 kDa และทฤษฎีโมเลกุลน้ำหนัก 68 กิโล ระบุว่า rsbgl3his คือ hyperglycosylated .เพื่อทดสอบว่า rsbgl3his เป็นอื่น rsbgl3his ถูกสังหาร ,กับ endoglycosidase H ( endoh ) แล้วนำข้อมูลมาวิเคราะห์โดย SDS - หน้าหลังจากรักษาด้วยโปรตีนบริสุทธิ์ rsblg3his endoh , วงดนตรีของ rsblg3his ถูกย้ายจาก 140 70 กิโลดาลตัน ( รูปที่ 3 ) , ระบุว่าrsbgl3his เป็นไกลโคโปรตีน . เป็นวงเดียวที่ประมาณ70 กิโลดาลตัน ( รูปที่ 3 ซอย 2 ) และวิเคราะห์โดย LC MS / MS ) เพื่อขอรับอัตราส่วนของมวลต่อประจุ ( ตารางประกอบ 1 ) , เปปไทด์ซึ่งวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์กับมาสคอตฐานข้อมูล ncbinr . ผลการศึกษาพบว่า อาหารห้าเปปไทด์ลำดับ ( เหมือนที่เปปแปลจาก cDNA ยีน sbgl3 การเข้ารหัส ( การศึกษา ) ดังแสดงในรูปที่ 1