3.1. Purification of Z. ophiocephal

3.1. Purification of Z. ophiocephalus trypsin
Trypsin from the viscera of Z. ophiocephalus was extracted and purified by the two-step procedure described in Section 2. In the first step, the crude enzyme extract was fractionated with ammonium sulphate. The precipitate formed at 20–60% (w/v) saturation showed higher specific activity (0.07 U/mg protein) than precipitates formed at 0–20% (0.007 U/mg protein) and 60–80% (0.017 U/mg protein). No activity was detected in the final supernatant. The 20–60% fraction, with the greatest specific activity for trypsin, was then subjected to Sephadex G-100 gel filtration. This procedure yielded three peaks of protease activity using casein as a substrate, and a single peak of trypsin activity using BAPNA as a
substrate (results not shown). The specific activity in the initial enzyme extract was 0.05 U/mg protein. After the final purification step, the trypsin was purified 16-fold, with a recovery of 20% and a specific activity of 0.8 U/mg protein, using BAPNA as a substrate (Table 1). Purified trypsin from goby migrated as a single band in SDS-PAGE (Fig. 1a) and native PAGE (Fig. 1b), indicating the homogeneity of the enzyme and confirming that the purified trypsin had only one isoform. The molecular weight of trypsin was estimated to be 23.2 kDa based on SDS-PAGE (Fig. 1a), corresponding to that determined by gel filtration. Most of fish trypsins have been reported to have molecular weights in the range of 23–28 kDa
. The molecular weight of Z. ophiocephalus trypsin was similar to those from other fish species, such as walleye pollock (Theragra chalcogramma) , true sardine (Sardinops melanostictus) and arabesque greenling (Pleuroprammus azonus) , Amazonian fish tambaqui (C. macropomum) , grey triggerfish (B. capriscus) , and cuttlefish (S. officinalis) [7], and lower than those of trypsins from zebra blenny (S. basilisca) [13], and silver mojarra (D. rhombeus) . Casein-zymogram staining, a very sensitive and rapid assay method that detects nanograms of protein, revealed a unique clear
zone of proteolytic activity against the blue background of the gel, indicating the purity of the trypsin (Fig. 1b).
Z. ophiocephalus trypsin was identical to that of Japanese anchovy (Engraulis japonica) . The sequence of
Z. ophiocephalus trypsin showed high homology with those from smooth hound [9], grey triggerfish and arabesque greenling . There is only one amino acid residue in the 9-terminal sequence that differs in these sequences. However, there are two amino acid residues in the 9- terminal sequence that differ with trypsins from Amazonian fish tambaqui , silver mojarra , walleye pollok , true sardine (TR-S) , antarctic fish (Paranotothenia magellanica) ,mandarin fish (Siniperca chuasti) and common Carp (Cyprinuscarpio) (trypsin A) . The sequence of Z. ophiocephalus trypsin showed also high homology with rat , dog , bovine ,porcine and human trypsins; they differ by three amino acids at positions 6, 8 and 9.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.1 การทำให้บริสุทธิ์ของซี ophiocephalus trypsin
Trypsin จากอวัยวะภายในของซี ophiocephalus ถูกสกัดและทำให้บริสุทธิ์โดยขั้นตอนที่สองขั้นตอนที่อธิบายไว้ในมาตรา 2 ในขั้นตอนแรกสารสกัดเอนไซม์ถูก fractionated กับแอมโมเนียมซัลเฟต ตะกอนที่เกิดขึ้นที่ 20-60% (w / v) แสดงให้เห็นถึงความอิ่มตัวของกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงสูงกว่า (0.07 U / มิลลิกรัมโปรตีน) กว่าตกตะกอนเกิดขึ้นที่ 0-20% (0.007 U / mg protein) และ 60-80% (0.017 U / mg โปรตีน) ไม่มีกิจกรรมใดถูกตรวจพบในสารละลายสุดท้าย ส่วน 20-60% โดยมีกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงยิ่งใหญ่ที่สุดสำหรับ trypsin ถูกยัดเยียดแล้ว Sephadex G-100 กรองเจล ขั้นตอนนี้จะให้ผลสามยอดของกิจกรรมโปรติเอสโดยใช้เคซีนเป็นสารตั้งต้นและจุดสูงสุดของกิจกรรมเดียว trypsin BAPNA ใช้เป็น
สารตั้งต้น (ผลไม่แสดง) กิจกรรมที่ระบุในสารสกัดเอนไซม์เริ่มต้น 0.05 U / มก. โปรตีน หลังจากขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์สุดท้าย trypsin บริสุทธิ์ 16 เท่าที่มีการกู้คืน 20% และกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงของ 0.8 U / มก. โปรตีนโดยใช้เป็นสารตั้งต้น BAPNA (ตารางที่ 1) trypsin บริสุทธิ์จากปลาบู่อพยพเป็นวงเดียวใน SDS-PAGE (รูป. 1a) และหน้าพื้นเมือง (รูป. 1 ข) แสดงให้เห็นความเป็นเนื้อเดียวกันของเอนไซม์และยืนยันว่า trypsin บริสุทธิ์มีเพียงหนึ่งไอโซฟอร์ม น้ำหนักโมเลกุลของ trypsin ก็จะประมาณ 23.2 กิโลดาลตันขึ้นอยู่กับระบบ SDS-PAGE (รูป. 1a) สอดคล้องกับที่กำหนดโดยการกรองเจล ส่วนใหญ่ trypsins ปลาได้รับรายงานว่าจะมีน้ำหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 23-28
กิโลดาลตัน น้ำหนักโมเลกุลของซี ophiocephalus trypsin ก็คล้ายคลึงกับผู้ที่มาจากปลาชนิดอื่น ๆ เช่นตาล Pollock (Theragra chalcogramma) ปลาซาร์ดีนที่แท้จริง (Sardinops melanostictus) และอาหรับ greenling (Pleuroprammus azonus) ปลาคู้ดำปลาอเมซอน (ค macropomum), สีเทา กวาง (บี capriscus) และปลาหมึก (เอส officinalis) [7] และต่ำกว่า trypsins จากม้าลายตีน (เอส basilisca) [13] และเงินกระโดง (d rhombeus) การย้อมสีเคซีน zymogram, วิธีการทดสอบที่มีความสำคัญมากและอย่างรวดเร็วที่ตรวจพบนาโนกรัมของโปรตีนเปิดเผยที่ชัดเจนที่ไม่ซ้ำกัน
ของกิจกรรมโซนโปรตีนกับพื้นหลังสีฟ้าของเจลแสดงให้เห็นความบริสุทธิ์ของ trypsin (รูป. 1 ข.)
ซี ophiocephalus trypsin ก็เหมือนกับของแอนโชวี่ญี่ปุ่น (Engraulis japonica) ลำดับของ
ซี ophiocephalus trypsin แสดงให้เห็นคล้ายคลึงกันสูงที่มีผู้ที่มาจากหมาเรียบ [9], กวางสีเทาและอาหรับ greenling มีเพียงคนเดียวที่เหลือกรดอะมิโนในลำดับที่ 9 ขั้วที่แตกต่างกันในลำดับเหล่านี้ แต่มีสองกรดอะมิโนในลำดับที่ 9 ขั้วที่แตกต่างกับ trypsins จากปลาคู้ดำปลาอเมซอน, กระโดงเงิน POLLOK ตาล, ปลาซาร์ดีนที่แท้จริง (TR-S) ปลาแอนตาร์กติก (Paranotothenia magellanica) ปลาแมนดาริน (Siniperca chuasti) และปลาคาร์พทั่วไป (Cyprinuscarpio) (trypsin) ลำดับของซี ophiocephalus trypsin แสดงให้เห็นว่ายังคล้ายคลึงกันสูงที่มีหนู, สุนัข, วัว, หมูและ trypsins มนุษย์ พวกเขาแตกต่างจากสามกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 6, 8 และ 9

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.1 . การ ophiocephalus ซินซิน Z .
จากอวัยวะภายในของ Z ophiocephalus สกัดบริสุทธิ์โดยสองขั้นตอนขั้นตอนที่อธิบายไว้ในส่วนที่ 2 ในขั้นตอนแรกของเอนไซม์สกัดเป็นลำดับด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต ที่ก่อตั้งขึ้นที่ 20 – 60 % ( w / v ) ความเข้มสูงกว่ากิจกรรมจำเพาะ ( 0.07 U / mg protein ) กว่าตะกอนขึ้น 20% ( 0 – 0007 U / mg protein ) และ 60 – 80 % ( 0.017 U / mg protein ) ไม่มีกิจกรรมที่ตรวจพบในนำสุดท้าย 20 - 60 % ส่วนที่มีมากที่สุดเฉพาะกิจกรรมเอนไซม์ , Sephadex G-100 เจลแล้วต้องกรอง ขั้นตอนนี้คือยอดของกิจกรรมเอนไซม์โปรติเอสสามโดยใช้เคซีน เป็นสารตั้งต้น และเป็นยอดเดียวของกิจกรรมเอนไซม์ที่ใช้เป็นฐานรอง bapna
( ผลลัพธ์ไม่แสดง )กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงในการแยกเอนไซม์เริ่มต้น 0.05 U / mg โปรตีน หลังจากขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์สุดท้าย ทริป 16 พับบริสุทธิ์ กับการกู้คืน 20% และกิจกรรมเฉพาะของ 0.8 U / mg protein โดยใช้ bapna เป็นสารตั้งต้น ( ตารางที่ 1 ) เอนไซม์บริสุทธิ์จากปลาบู่อพยพเป็นวงเดียวในการแก้ปัญหา ( รูปที่ 1A ) และพื้นเมืองหน้า ( รูปที่ 1A )แสดงความเป็นเอกพันธ์ของเอนไซม์บริสุทธิ์เอนไซม์ และยืนยันว่ามีเพียงหนึ่งไอโซฟอร์ม . น้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์ประมาณจะ 23.2 kDa จากการศึกษา ( รูปที่ 1 ) ซึ่งสอดคล้องกับที่กำหนดโดยการกรองเจล ที่สุดของ trypsins ปลาได้รับรายงานว่ามีน้ำหนักโมเลกุลในช่วง 23 – 28 กิโล

น้ำหนักโมเลกุลของ Zophiocephalus ซินก็คล้ายกับจากปลาอื่น ๆเช่น ตาลอ พอลล็อก ( theragra chalcogramma ) ปลาซาร์ดีน ( sardinops จริงน้อย ) และอาสาสมัคร greenling ( pleuroprammus azonus ) , อเมซอนปลาสาโท ( C . macropomum ) ปลาวัวสีเทา ( พ. capriscus ) และปลาหมึก ( S . officinalis ) [ 7 ] และสูงกว่าของ trypsins จากม้าลายตีน ( S . basilisca ) [ 13 ]วงศ์ปลาดอกหมากและเงิน ( D . rhombeus ) โดยทดลองการย้อมสีอ่อนไหวง่าย และวิธีวิเคราะห์อย่างรวดเร็วที่ตรวจจับนาโนกรัมของโปรตีน , เปิดเผยเอกลักษณ์ชัดเจน
โซนกิจกรรมระกับพื้นหลังสีฟ้าของเจล บ่งบอกถึงความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ ( รูปที่ 1A ) .
Z ophiocephalus ซินก็เหมือนกับที่ปลาญี่ปุ่น ( engraulis จาป ) ลำดับ
Zophiocephalus ซิน พบตัวสูงกับพวก Hound เรียบ [ 9 ] , วัวสีเทาและ Arabesque greenling . มีเพียงหนึ่งใน 9-terminal ลำดับกรดอะมิโนที่แตกต่างกันในลำดับเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม มีอยู่สองกรดอะมิโนตกค้างใน 9 - สถานีลำดับที่แตกต่างกับ trypsins จากอเมซอนปลา Walleye ปลาดอกหมาก pollok สาโท , เงิน , ,จริงปลาซาร์ดีน ( tr-s ) ปลาแอนตาร์กติก ( paranotothenia magellanica ) , ปลาแมนดาริน ( siniperca chuasti ) และปลาไน ( cyprinuscarpio ) ( ซิน ) ลำดับของ Z ophiocephalus ทริปซินพบลำดับสูงกับหนู , สุนัข , วัว , สุกรและมนุษย์ trypsins ; พวกเขาแตกต่างจากสามกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 6 , 8 และ 9