2. Materials and methods2.1. Obtent

2. Materials and methods
2.1. Obtention of the bacterial cell-free extract E under conditions of stress and evaluation of the cell viability
Brie
y, according to the method previously described [14], the B. thetaiotaomicron strain ATCC 29741 was grown onto Brucella agar medium containing no blood nor hemin nor bile (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France), only supplemented with 0.5 mg L
1 menadione. Plates were incubated at 35 C for 5 days in an anaerobic chamber (Don Withley chamber, AES, Combourg, France) containing a gas mixture without O2 (85% N2, 10% H2, CO2 5%). Bacteria were harvested from the surface of the agar plates and transferred into a sterile 7 mM CHAPS, 0.5 mM tris(hydroxymethyl)
aminomethane (Tris) hydrochloride (pH 6.8) solution (Serva, Heidelberg, Germany) aereted to create an oxidative stress,
kept at 2e4 C under slow mixing for 20 h (a sufcient time laps to allow the protein production, but short enough to avoid protein digestion by proteases). At the end of the extraction period in CHAPS medium, the bacterial suspension was centrifuged at 20,000 g for 1 h at 4 C (5417R centrifuge, Eppendorf, Hamburg, Germany). After evaluating the supernatant protein concentration, it was adjusted to 2.5 mg mL
1 with the extraction solution and named “E” [14]. The bacterial viability was compared before, after extraction in the presence of CHAPS and following a transfer into asurvival anaerobic quarter-strength Ringer diluent (Merck). This was performed using enumeration of the colony forming units (CFU) obtained after spread plating of 100 mL of ve suitable tenfold dilutions of the bacterial suspension in quarter-strength
anaerobic Ringer diluent with 0.3 g L
1 cysteine (Acros, New Jersey, USA) on surface of Brucella agar complemented with 5 mg L
1 hemin, 5% (vol/vol) debrinated horse blood (Eurobio, Les Ulis, France) and 0.5 mg L
1 menadione (Merck). After 48 h incubation under anaerobic conditions at 37 C, the CFU were counted and expressed per g of bacteria harvested (moist and after 15-day drying in an oven) weighed after centrifuging. For the statistical
analysis, seven paired series of CFU counts per g of bacteria were tested using the non parametric Wilcoxon’s test (p ¼ 0.05, Stat- View software, version 4.5, Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA) to
compare the bacterial viabilities before and after after the 20 h extraction in CHAPS and to compare viabilities of BT in the CHAPS solution and the survival diluent

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. Obtention ของแบคทีเรียปราศจากเซลล์สารสกัดจาก E ภายใต้เงื่อนไขของความเครียดและการประเมินผลของชีวิตเซลล์บรีฮาร์ดดิ้ง y ตามวิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [14], thetaiotaomicron เกิดสายพันธุ์ ATCC 29741 ถูกปลูกลงบนกลาง agar Brucella ประกอบด้วยไม่มีเลือด หรือ hemin หรือน้ำดี (Becton สัน เลอสะพานเดอ Claix ฝรั่งเศส), เฉพาะเสริม ด้วย 0.5 มิลลิกรัม menadione L 1 แผ่นก็ incubated ที่ 35 C 5 วันในห้องไม่ใช้ออกซิเจน (Withley ดอนหอการค้า AES, Combourg ฝรั่งเศส) ที่ประกอบด้วยส่วนผสมก๊าซ โดย O2 (85% N2, H2, 10% CO2 5%) แบคทีเรียเก็บเกี่ยวจากพื้นผิวของแผ่น agar และถูกโอนย้ายไปเป็น 7 มม.ใส่ CHAPS, tris(hydroxymethyl) 0.5 มม.aereted โซลูชั่น (Serva ไฮเดลเบิร์ก เยอรมนี) ไฮโดรคลอไรด์ (pH 6.8) aminomethane (ตรี) การสร้างความเครียดการ oxidativeเก็บไว้ที่ C 2e4 ภายใต้การผสมช้าสำหรับ h 20 (เป็น suf cient เวลารอบ เพื่อให้ผลิตโปรตีน สั้นพอที่จะหลีกเลี่ยงการย่อยโปรตีนทำ โดย proteases) เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการสกัดใน CHAPS ระงับแบคทีเรียถูก centrifuged ที่ g 20000 สำหรับ h 1 ที่ 4 C (5417R เครื่องหมุนเหวี่ยง Eppendorf ฮัมบูร์ก เยอรมนี) หลังจากประเมินความเข้มข้นโปรตีน supernatant มันถูกปรับปรุงให้ 2.5 mg mL 1 สกัดโซลูชันและชื่อ "E" [14] ชีวิตแบคทีเรียถูกเมื่อเทียบกับก่อน หลังจากการสกัดในต่อหน้า ของ CHAPS และ ต่อการโอนย้ายไป asurvival ไม่ใช้แรงไตรมาส Ringer diluent (เมอร์ค) นี้ทำโดยใช้การแจงนับของอาณานิคมขึ้นหน่วย (CFU) ได้รับหลังจากกระจายชุบของ 100 mL ของ ve เหมาะได้ dilutions tenfold ของการระงับแบคทีเรียในความแข็งแกร่งไตรมาสไม่ใช้ diluent Ringer กับ 0.3 g L 1 cysteine (Acros นิวเจอร์ซีย์ สหรัฐอเมริกา) บนผิวของ Brucella agar ครบครัน ด้วย 5 มิลลิกรัม L 1 hemin, 5% (vol/vol) เด brinated ม้าเลือด (Eurobio, Les Ulis ฝรั่งเศส) และ 0.5 มิลลิกรัม L 1 menadione (เมอร์ค) หลังจากฟักตัว 48 h ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจนที่ 37 C, CFU ที่นับได้ และแสดงต่อกรัมของแบคทีเรียที่เก็บเกี่ยว (ชุ่มชื่น และหลัง จาก 15 วันให้แห้งในเตาอบ) น้ำหนักหลัง centrifuging สำหรับในทางสถิติทดสอบวิเคราะห์ ชุดจัดเป็นคู่ 7 ของจำนวน CFU ต่อกรัมของแบคทีเรียที่ใช้ทดสอบของ Wilcoxon ไม่ใช่พาราเมตริก (p 0.05 ¼ ดูสถิติซอฟต์แวร์ รุ่น 4.5 แนวคิดอบาคัส เบิร์กลีย์ CA, USA) ไปเปรียบเทียบ viabilities แบคทีเรียก่อน และหลังหลังการแยก 20 h CHAPS และ การเปรียบเทียบ viabilities ของ BT ในโซลูชัน CHAPS และอยู่รอด diluent

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 Obtention ของสารสกัดจากเซลล์ฟรี E แบคทีเรียภายใต้เงื่อนไขของความเครียดและการประเมินผลของการมีชีวิตเซลล์
Brie? y ที่ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [14], ความเครียด thetaiotaomicron บี ATCC 29741 ปลูกลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Brucella ขนาดกลางที่มีเลือดหรือไม่ hemin หรือน้ำดี (Becton Dickinson, Le Pont de เคลซ์, ฝรั่งเศส) เสริมเพียง 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร 1 menadione แผ่นถูกบ่มที่ 35 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วันในห้องแบบไม่ใช้ออกซิเจน (ดอน Withley ห้อง AES, Combourg, ฝรั่งเศส) ที่มีส่วนผสมของก๊าซโดยไม่ต้อง O2 (85% N2, H2 10% CO2 5%) แบคทีเรียเก็บเกี่ยวจากพื้นผิวของแผ่นวุ้นและโอนเป็นหมัน 7 มิลลิ CHAPS, 0.5 มิลลิ tris (hydroxymethyl)
aminomethane (ทริส) ไฮโดรคลอไร (pH 6.8) การแก้ปัญหา (Serva ไฮเดลเบิร์ก, เยอรมนี) aereted เพื่อสร้างความเครียดออกซิเดชัน,
เก็บไว้ ที่ 2e4 องศาเซลเซียสภายใต้การผสมช้าเป็นเวลา 20 ชั่วโมง (พอเพียง? รอบเวลาเพียงพอที่จะช่วยให้การผลิตโปรตีน แต่สั้นพอที่จะหลีกเลี่ยงการย่อยโปรตีนโดยโปรตีเอส) เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการสกัดในสื่อ CHAPS, ระงับแบคทีเรียถูกหมุนเหวี่ยงที่ 20,000? ก. เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส (centrifuge 5417R, Eppendorf, ฮัมบูร์ก, เยอรมนี) หลังจากการประเมินความเข้มข้นของโปรตีนใสก็มีการปรับถึง 2.5 มิลลิกรัมมิลลิลิตร 1 ด้วยวิธีการสกัดและตั้งชื่อ "E" [14] มีชีวิตแบคทีเรียเปรียบเทียบก่อนหลังในการสกัดการปรากฏตัวของ CHAPS และต่อไปนี้การถ่ายโอนลงในแบบไม่ใช้ออกซิเจน asurvival ไตรมาสแรงเจือจาง Ringer (เมอร์) นี้ได้รับการดำเนินการโดยใช้การแจงนับของอาณานิคมสร้างหน่วย (CFU) ได้รับหลังจากการแพร่กระจายชุบ 100 มิลลิลิตร? ve เจือจางสิบเท่าที่เหมาะสมในการระงับแบคทีเรียในไตรมาสที่แรง
แบบไม่ใช้ออกซิเจนเจือจาง Ringer 0.3 กรัม L 1 cysteine ​​(Acros, New Jersey, สหรัฐอเมริกา) บนพื้นผิวของอาหารเลี้ยงเชื้อ Brucella ครบครันด้วย 5 มิลลิกรัม L 1 hemin, 5% (ฉบับ / ปริมาตร) เด? เลือดม้า brinated (Eurobio, Les Ulis ฝรั่งเศส) และ 0.5 มก. L 1 menadione (เมอร์) หลังจากบ่ม 48 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขการใช้ออกซิเจนที่ 37? C, CFU นับและแสดงต่อกรัมของแบคทีเรียเก็บเกี่ยว (ชื้นและหลังจากการอบแห้ง 15 วันในเตาอบ) ชั่งน้ำหนักหลังจากเหวี่ยง สำหรับสถิติ
การวิเคราะห์เจ็ดชุดจับคู่ของโคโลนีต่อกรัมนับของเชื้อแบคทีเรียที่ได้รับการทดสอบโดยใช้การทดสอบ Wilcoxon ไม่ใช่ตัวแปรของ (พี¼ 0.05, Stat- ดูซอฟแวร์รุ่น 4.5 แนวคิด Abacus ลี, CA, USA) เพื่อ
เปรียบเทียบ viabilities แบคทีเรีย ก่อนและหลังการหลังจากการสกัด 20 ชั่วโมงใน CHAPS และเปรียบเทียบ viabilities ของบีทีในการแก้ปัญหา CHAPS และเจือจางความอยู่รอด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . obtention ของแบคทีเรียการสังเคราะห์สารสกัดและภายใต้เงื่อนไขของความเครียดและการประเมินผลของเซลล์
บรี
Y ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [ 14 ] , B thetaiotaomicron สายพันธุ์ ATCC 29741 ปลูกลงบนอาหารวุ้นที่มีเลือดและบรูเซลลา ไม่พบหรือน้ำดี ( เบคตอนดิกคินสัน , เลอปง เดอ claix , ฝรั่งเศส ) เท่านั้น เสริมด้วย 05 mg L
1 menadione . จานถูกบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วันใน  ห้องแอโรบิค ( ไม่ withley ห้อง , AES , combourg ฝรั่งเศส ) ที่ประกอบด้วยแก๊สผสมไม่มี O2 ( 85 % N2 , 10 % H2 , คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ ) แบคทีเรียถูกเก็บเกี่ยวจากพื้นผิวของวุ้นแผ่น และโอนเป็นหมัน 7 มม. Chaps , 0.5 มิลลิเมตรโดยการใช้เสียงระดับต่ำ ( ซี )
( บริษัท ) ไฮโดรคลอไรด์ ( พีเอช 6.8 ) สารละลาย ( serva Heidelberg ,เยอรมนี ) aereted สร้างความเครียดออกซิเดชัน
เก็บไว้ที่ 2e4  C ภายใต้การผสม 20 H ช้า ( ซุฟ  cient เวลารอบเพื่อให้โปรตีนในการผลิต แต่ในระยะสั้นพอที่จะหลีกเลี่ยงโปรตีนการย่อยอาหารโดย proteases ) ที่สิ้นสุดของระยะเวลาในการสกัดพวกกลาง , bacterial suspension คือระดับที่ 20 , 000  กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ใน 4  C ( 5417r centrifuge , เพนดอร์ฟ , ฮัมบูร์ก , เยอรมนี )หลังจากประเมินระดับความเข้มข้นโปรตีนสูง มันปรับได้ 2.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
1 กับการสกัดสารละลายและชื่อ " E " [ 14 ] ความมีชีวิตของเทียบก่อน หลังจากการสกัดในการแสดงตนของ Chaps และต่อไปนี้การ asurvival ไร้แรงสั่นสำหรับเจือจาง ( Merck )นี้ถูกวิเคราะห์โดยใช้การแจกแจงของอาณานิคมสร้างหน่วย ( CFU ) หลังจากได้รับกระจายชุบ 100 มิลลิลิตรของ  ได้เหมาะเป็นสิบเท่าวิธีการระงับเชื้อแบคทีเรียในไตรมาสแรงสั่น
ไร้เจือจางกับ 0.3 กรัมผม
1 ซิสเทอีน ( USA acros , New Jersey , ) บนพื้นผิวของบรูเซลลา วุ้นครบครันด้วย 5 mg L
1 จาก 5 เปอร์เซ็นต์ ( ปริมาตร / ปริมาตร ) เดอ  brinated เลือดม้า eurobio เลซูว์ลิส ( , ,ฝรั่งเศส ) และ 0.5 mg ผม
1 menadione ( Merck ) หลังจาก 48 ชั่วโมงบ่มที่ 37 องศาเซลเซียส ภายใต้สภาวะไร้อากาศ  , เซลล์ถูกนับและแสดงต่อ G ของแบคทีเรียเก็บเกี่ยว ( ชื้นและหลังจาก 15 วันให้แห้งในเตาอบ ) หนักหลังจากสาร . สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ
7 คู่ชุดเซลล์นับต่อ G ของแบคทีเรียที่ใช้ในการทดสอบการทดสอบที่ไม่ใช้พารามิเตอร์สถิติ ( P ¼ 0.05 ,ดู stat - ซอฟต์แวร์ , รุ่น 4.5 , แนวคิด , ลูกคิด Berkeley , CA , USA )
เปรียบเทียบ viabilities แบคทีเรียก่อนและหลัง 20 H การสกัด Chaps และเปรียบเทียบ viabilities ของ BT ในสารละลายเจือจาง Chaps และความอยู่รอด