Extended optimization studies were

Extended optimization studies were performed to maximize PCR
amplification efficiency of GC-rich 1087 bp fragments for both HBA1
and HBA2 genes, including Mg2+ and DMSO concentration, enzyme
units, primer concentration and PCR cycling parameters. In addition,
several parameters affecting the specificity and the yield of genotyping
reaction were optimized. These includeMg2+ concentration, annealing
temperature and time, concentration of primers and dNTPs, quantity of
DNA template, etc. The effect of each parameter was studied in a series
of PEXT reactions containing amplified target DNA from wild type
samples or samples carrying mutations and varying amounts of the parameter
under investigation. Some indicative results of the performed
optimization studies are presented in Fig. 2. The optimized parameters
selected for the multiplex PEXT reactions were as follows: Mg2+ concentration
4 mM, allele-specific primer concentration 1 pmol each,
annealing temperature 65 °C (60 °C for HBA2 gene), dNTPs concentration
10 μΜ and about 100 fmol (2 to 3 μL) of unpurified PCR product.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดำเนินการศึกษาปรับขยายเพื่อเพิ่ม PCRขยายประสิทธิภาพของชิ้นส่วน bp 1087 GC ริชสำหรับทั้ง HBA1และ HBA2 ยีน รวม Mg2 + และความเข้มข้นของ DMSO เอนไซม์หน่วย ความเข้มข้นของสีรองพื้น และพารามิเตอร์ขี่ PCR นอกจากนี้พารามิเตอร์หลายอย่างที่ส่งผลกระทบต่อการ specificity และผลผลิตของ genotypingปฏิกิริยาถูกปรับให้เหมาะสม เหล่านี้ includeMg2 + สมาธิ การอบเหนียวอุณหภูมิและเวลา ความเข้มข้นของ dNTPs และไพรเมอร์ จำนวนดีเอ็นเอต้นแบบ ฯลฯ ได้ศึกษาผลของพารามิเตอร์แต่ละชุดของปฏิกิริยา PEXT ประกอบด้วยดีเอ็นเอเป้าหมายเอาต์จากชนิดของป่าตัวอย่างหรือกลุ่มตัวอย่างดำเนินการกลายพันธุ์ และจำนวนของพารามิเตอร์ที่แตกต่างกันภายใต้การตรวจสอบ บางตัวชี้ให้เห็นผลการดำเนินเพิ่มประสิทธิภาพการศึกษาจะนำเสนอใน Fig. 2 พารามิเตอร์ให้เหมาะเลือกสำหรับปฏิกิริยา PEXT multiplex มีดังนี้: Mg2 + ความเข้มข้น4 mM รองพื้น allele เฉพาะความเข้มข้น 1 pmol ละการอบเหนียวอุณหภูมิ 65 ° C (60 ° C สำหรับยีน HBA2), ความเข้มข้นของ dNTPs10 μΜและ 100 fmol (2-3 μL) ของผลิตภัณฑ์ PCR unpurified

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยายการศึกษาการเพิ่มประสิทธิภาพได้ดำเนินการเพื่อเพิ่ม PCR
ประสิทธิภาพการขยายของชิ้นส่วนที่อุดมไปด้วย GC-1087 bp ทั้ง HBA1
และยีน HBA2 รวมทั้ง Mg2 + และความเข้มข้น DMSO
เอนไซม์หน่วยความเข้มข้นของไพรเมอร์และPCR พารามิเตอร์การขี่จักรยาน นอกจากนี้หลายพารามิเตอร์ที่มีผลต่อความจำเพาะและผลผลิตของ genotyping ปฏิกิริยาถูกปรับให้เหมาะสม เหล่านี้ includeMg2 + ความเข้มข้นของการหลอมอุณหภูมิและเวลา, ความเข้มข้นของไพรเมอร์และ dNTPs ปริมาณดีเอ็นเอแม่แบบฯลฯ ผลของแต่ละพารามิเตอร์ศึกษาในชุดของปฏิกิริยาPEXT ที่มีดีเอ็นเอเป้าหมายขยายจากป่าประเภทตัวอย่างหรือตัวอย่างการดำเนินการกลายพันธุ์และจำนวนเงินที่แตกต่างกันของพารามิเตอร์ภายใต้การสอบสวน บางคนแสดงให้เห็นถึงผลการดำเนินการศึกษาการเพิ่มประสิทธิภาพถูกนำเสนอในรูป 2. ตัวแปรที่ดีที่สุดเลือกสำหรับปฏิกิริยาPEXT multiplex มีดังนี้ Mg2 + ความเข้มข้น4 มิลลิความเข้มข้นของไพรเมอร์อัลลีลที่เฉพาะเจาะจง 1 pmol แต่ละอุณหภูมิการอบ65 ° C (60 ° C เป็นยีน HBA2) ความเข้มข้น dNTPs 10 μΜและประมาณ 100 fmol (2-3 ไมโครลิตร) ของผลิตภัณฑ์ PCR unpurified

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การศึกษาการเพิ่มประสิทธิภาพการเพิ่มประสิทธิภาพของ GC )
( รวยและ BP เศษทั้ง hba1
hba2 และยีน รวมทั้ง mg2 DMSO และความเข้มข้นของเอนไซม์หน่วย
, ความเข้มข้นและค่าสีโดยจักรยาน นอกจากนี้
หลายพารามิเตอร์มีผลต่อความจำเพาะและผลผลิตของปฏิกิริยาที่เหมาะสมส่งเสริม
. เหล่านี้ includemg2 ความเข้มข้นอุณหภูมิและเวลาในการอบ
, ไพรเมอร์ dntps ความเข้มข้นและปริมาณ
แม่แบบดีเอ็นเอ ฯลฯ ผลของแต่ละพารามิเตอร์ที่ศึกษา ในชุดของปฏิกิริยาที่มีเป้าหมาย pext

ของดีเอ็นเอจากตัวอย่างชนิดป่าหรือตัวอย่างและแบกการกลายพันธุ์แตกต่างจำนวนพารามิเตอร์
ภายใต้การสอบสวน ผลลัพธ์บางอย่างแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มประสิทธิภาพของการศึกษาจะถูกนำเสนอในรูป
2 . การปรับค่าพารามิเตอร์
เลือกปฏิกิริยา multiplex pext ดังนี้ mg2 สมาธิ
4 มม. เฉพาะความเข้มข้น 1 pmol แต่ละอัลลีลไพรเมอร์ , การหลอมอุณหภูมิ 65 องศา C
( 60 ° C ) hba2 ) dntps สมาธิ
10 μΜประมาณ 100 fmol ( 2 μ L ) ของผลิตภัณฑ์ PCR unpurified .