- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
MethodsSample collection and DNA ex
Methods
Sample collection and DNA extraction
Samples of C. harmani were collected from the Nagqu
area in Tibet, China, and voucher specimen was deposited
in Institute of Zoology, Shaanxi Normal University;
C. mantchuricum and C. crossoptilon were collected
from the Beijing Zoo, and samples were obtained from
bird specimen collections of the National Zoological
Museum, Institute of Zoology, Chinese Academy of
Sciences. The collection was under the permit from
Forestry Department and conformed to the National
Wildlife Conservation Law in China. No living animal
experiments were conducted in the current research.
All the samples were preserved in 100% ethanol and
stored at −20°C. The total genomic DNA was extracted
from the liver/muscle tissue using the standard phenol/
chloroform method [16].
PCR amplification and sequencing
The PCRs were performed under the following conditions,
2 min initial denaturation at 93°C, 40 cycles of:
10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 58–53°C,
10 min elongation at 68°C in the preliminary 20 cycles,
and 10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 53°C,
and 10 min elongation at 68°C with 20 s per cycle added
to the elongation step in the succeeding 20 cycles, and
finally an extension for 7 min at 68°C. The amplifications
were performed in 15 μL reactions containing
2.4 μL of 2.5 mM dNTPs, 2.1 μL of each primer at 10
μΜ, 1.5 μl of 10× LA PCR Buffer I (Mg2+-free), 1.5 μL
of 25 mM MgCl2, 1 μL of DNA template, 0.18 μL of 5
U/μl LA Taq polymerase (Takara, Dalian, China) and
4.22 μL ddH2O.
The sequences of the primers used for PCR amplification
and sequencing of the mitochondrial genes were
obtained from Sorenson (2003) [17] with minor changes
(Additional file 1). The mitogenome of C. harmani was
amplified in seven parts and the gaps were bridged using
other adjacent primers. The PCR products were purified
using the DNA Agarose Gel Extraction Kit (Bioteke,
Beijing, China) after separation by electrophoresis on a
0.8% agarose gel. After separation and purification, the
PCR products were sequenced by Sangon Biotech
(Shanghai) Co., LTD. using the Primer-Walking method.
The C. mantchuricum and C. crossoptilon mitogenomes
were amplified in 12 or 13 fragments, and sequencing was
performed using the Illumina Hiseq2000 high-throughput
sequencing system of Shenzhen Huada Gene Technology
Co., LTD. The gaps in the assembly after high-throughput
sequencing were filled in by direct sequencing using the
ABI 3730 DNA sequencer by Sangon Biotech (Shanghai)
Co., LTD., using adjacent PCR primers.
Gene identification and genome analyses
The Staden sequence analysis package [18] was used
for sequence assembly and annotation of C. harmani
mitogenome. The complete genome assemblies for the
mitogenomes of C. mantchuricum and C. crossoptilon
were performed using the SOAP de novo software.
Most tRNA genes were identified using tRNAscan-SE
1.21 [19] under the ‘tRNAscan only’ search mode, with
the vertebrate mitochondrial genetic code and ‘mito/
chloroplast’ source. The protein-coding genes (PCGs),
rRNA genes and the remaining putative tRNA genes
that were not identified by tRNAscan-SE were identified
by sequence comparison with other Galliformes
species. The rrnS secondary structure of Crossoptilon
was predicted based on the structure of Gallus gallus
and Anas platyrhynchos obtained from the Comparative
RNA Web (CRW) [20], and Pseudopodoces humilis
(now as Parus humilis) structure [16]. The rrnL secondary
structure was predicted based on the structure
of Xenopus laevis obtained from the CRW database,
Bos taurus [21] and P. humilis structures [16]. The
RNAstructure software was used to identify and draw
potential secondary structures in the single-stranded
control region. The nucleotide compositions of the
mitogenomes and amino acid information were analysed
using MEGA 4.1 [22].Sequence alignments
Along with the entire mitogenomes obtained in this
study, 42 Galliformes sequences were used in the phylogenetic
analysis, including two outgroups (Numida
meleagris and Alectura lathami). The DNA sequences of
the other species used in the phylogenetic analyses were
downloaded from GenBank (the accession numbers and
key information are shown in Additional file 2). The
tRNA and rRNA genes and the CR were individually
aligned using ClustalX 1.83 [23] with the default settings.
All 13 protein-coding genes were translated into
amino acids, and then aligned using MEGA 4.1 [22] with
default parameters for each gene, and finally retranslated
into nucleotide sequences.
Phylogenetic analyses of Phasianidae
Datasets containing 13 protein-coding genes (PCG) and
all 37 genes plus the control region (mitogenome) were
used to study the phylogenetic relationships within
Phasianidae. Phylogenetic analysis based on nucleotide
sequences was performed using PAUP*4.0b10 for the
Maximum parsimony (MP) method [24], RAxML-7.0.3
for maximum likelihood (ML) [25] and MrBayes 3.1.2
for Bayesian inference (BI) [26]. For ML and BI analyses,
models of the concatenated nucleotide sequences datasets
were assessed independently using AICc in MrModeltest2.2
[27]. The best fit model GTR + I + G was
chosen for the likelihood and Bayesian analyses. A consensus
tree was generated for MP analysis under the majority
rule. The reliability of the clades in the phylogenetic trees
was assessed by bootstrap probabilities (BSP) computed
using 1000 replicates, with random addition for each bootstrap
replicate. The 1000 replicates bootstrap support was
also performed in the ML analysis. Bayesian analysis with
Markov Chain Monte Carlo sampling was run for
1000000 generations saving a tree every 100 generations,
with one cold and three heated chains, and the burn-in
time was determined by the time to convergence of the
likelihood scores. The Bayesian posterior probabilities
(BPP) were estimated on a 50% majority rule consensus
tree of the remaining trees.
We examined the performance of individual genes and
datasets based on nucleotides; PBS analyses were performed
in the program combining TreeRot.v3 [28] and
PAUP*4.0b10 [24]. The following datasets were used for
analysis: 13 protein-coding genes, rrnS, rrnL, CR partitions,
the first, second and third codons of PCG, the
three tRNA gene cluster (IQM, WANCY and HSL), ATP
(atp6 + atp8), COX (cox1 + cox2 + cox3) and NADH
(nad1 + nad2 + nad3 + nad4 + nad4L + nad5 + nad6).
The MEGA 4.1 [22] was used to calculate the pairwise
genetic distance for four Crossoptilon species with default
parameters. The mitogenome aligned data and four
single genes (nad2, CR, cytb and rrnS) obtained from
GenBank (Additional file 3) were used to calculate the
genetic distances. These genes were aligned singly, and
be adjusted to consistent sequence lengths manually.
Divergence time estimates focused on Crossoptilon
Along with the PCG dataset obtained in this study, 42
Galliformes sequences were used to estimate the divergence
time of the Crossoptilon species. The divergence
time of Crossoptilon species was calculated using the
Bayesian procedure implemented in BEAST v. 1.7.2
[29,30]. A relaxed clock was used with rates complying
with a log-normal distribution [31]. The GTR + I + G
model and a Yule prior were used in the analysis. The
calibration points were based on the fossil records showing
that stem Numididae-Phasianidae split at 50–54
Mya (million years ago) [32]; Arborophila rufipectus diverged
from the other lineages in the Galliformes around
39 Mya [33]; Coturnix-Gallus split at 35 Mya [34-36].
The results of runs of 10 million generations were used
after a burn-in of 100.
Ka and Ks analysis
To better understand the evolution at the DNA level
and the role of selection in the four Crossoptilon species,
we calculated the nonsynonymous and synonymous substitution
rates using Kaks_calculator 2.0 [37] for six
groups [C. harmani-C. mantchuricum (C.har-C.man),
C. mantchuricum-C. crossoptilon (C.man-C.cro), C. harmani-
C. crossoptilon (C.har-C.cro), C. harmani-C. auritum
(C.har-C.aur), C. mantchuricum-C. auritum (C.
man-C.aur), and C. crossoptilon-C. auritum (C.cro-C.
aur)]. The ratio of nonsynonymous substitution rate
(Ka) to synonymous substitution rate (Ks) is widely used
as an indicator of selective pressure at the sequence level
among different species. It is commonly accepted that
Ka > Ks, Ka = Ks, and Ka < Ks generally indicate positive
selection, neutral mutation, and negative selection, respectively
[38,39]. To calculate Ka, Ks and Ka/Ks, a
model averaging method was selected. This method includes
14 different models for calculation and derived
the average values for Ka, Ks, and Ka/Ks [37]. The genetic
code selected was the ‘vertebrate mitochondrial
code’. To further study the selective pressure acted on
each protein-coding gene in the genus Crossoptilon,
CodeML in PAMLX software [40] was used to find sites
under strong selective pressure. The secondary structure
analysis of amino acid was performed by using an online
software TOPCONS [4
Sample collection and DNA extraction
Samples of C. harmani were collected from the Nagqu
area in Tibet, China, and voucher specimen was deposited
in Institute of Zoology, Shaanxi Normal University;
C. mantchuricum and C. crossoptilon were collected
from the Beijing Zoo, and samples were obtained from
bird specimen collections of the National Zoological
Museum, Institute of Zoology, Chinese Academy of
Sciences. The collection was under the permit from
Forestry Department and conformed to the National
Wildlife Conservation Law in China. No living animal
experiments were conducted in the current research.
All the samples were preserved in 100% ethanol and
stored at −20°C. The total genomic DNA was extracted
from the liver/muscle tissue using the standard phenol/
chloroform method [16].
PCR amplification and sequencing
The PCRs were performed under the following conditions,
2 min initial denaturation at 93°C, 40 cycles of:
10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 58–53°C,
10 min elongation at 68°C in the preliminary 20 cycles,
and 10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 53°C,
and 10 min elongation at 68°C with 20 s per cycle added
to the elongation step in the succeeding 20 cycles, and
finally an extension for 7 min at 68°C. The amplifications
were performed in 15 μL reactions containing
2.4 μL of 2.5 mM dNTPs, 2.1 μL of each primer at 10
μΜ, 1.5 μl of 10× LA PCR Buffer I (Mg2+-free), 1.5 μL
of 25 mM MgCl2, 1 μL of DNA template, 0.18 μL of 5
U/μl LA Taq polymerase (Takara, Dalian, China) and
4.22 μL ddH2O.
The sequences of the primers used for PCR amplification
and sequencing of the mitochondrial genes were
obtained from Sorenson (2003) [17] with minor changes
(Additional file 1). The mitogenome of C. harmani was
amplified in seven parts and the gaps were bridged using
other adjacent primers. The PCR products were purified
using the DNA Agarose Gel Extraction Kit (Bioteke,
Beijing, China) after separation by electrophoresis on a
0.8% agarose gel. After separation and purification, the
PCR products were sequenced by Sangon Biotech
(Shanghai) Co., LTD. using the Primer-Walking method.
The C. mantchuricum and C. crossoptilon mitogenomes
were amplified in 12 or 13 fragments, and sequencing was
performed using the Illumina Hiseq2000 high-throughput
sequencing system of Shenzhen Huada Gene Technology
Co., LTD. The gaps in the assembly after high-throughput
sequencing were filled in by direct sequencing using the
ABI 3730 DNA sequencer by Sangon Biotech (Shanghai)
Co., LTD., using adjacent PCR primers.
Gene identification and genome analyses
The Staden sequence analysis package [18] was used
for sequence assembly and annotation of C. harmani
mitogenome. The complete genome assemblies for the
mitogenomes of C. mantchuricum and C. crossoptilon
were performed using the SOAP de novo software.
Most tRNA genes were identified using tRNAscan-SE
1.21 [19] under the ‘tRNAscan only’ search mode, with
the vertebrate mitochondrial genetic code and ‘mito/
chloroplast’ source. The protein-coding genes (PCGs),
rRNA genes and the remaining putative tRNA genes
that were not identified by tRNAscan-SE were identified
by sequence comparison with other Galliformes
species. The rrnS secondary structure of Crossoptilon
was predicted based on the structure of Gallus gallus
and Anas platyrhynchos obtained from the Comparative
RNA Web (CRW) [20], and Pseudopodoces humilis
(now as Parus humilis) structure [16]. The rrnL secondary
structure was predicted based on the structure
of Xenopus laevis obtained from the CRW database,
Bos taurus [21] and P. humilis structures [16]. The
RNAstructure software was used to identify and draw
potential secondary structures in the single-stranded
control region. The nucleotide compositions of the
mitogenomes and amino acid information were analysed
using MEGA 4.1 [22].Sequence alignments
Along with the entire mitogenomes obtained in this
study, 42 Galliformes sequences were used in the phylogenetic
analysis, including two outgroups (Numida
meleagris and Alectura lathami). The DNA sequences of
the other species used in the phylogenetic analyses were
downloaded from GenBank (the accession numbers and
key information are shown in Additional file 2). The
tRNA and rRNA genes and the CR were individually
aligned using ClustalX 1.83 [23] with the default settings.
All 13 protein-coding genes were translated into
amino acids, and then aligned using MEGA 4.1 [22] with
default parameters for each gene, and finally retranslated
into nucleotide sequences.
Phylogenetic analyses of Phasianidae
Datasets containing 13 protein-coding genes (PCG) and
all 37 genes plus the control region (mitogenome) were
used to study the phylogenetic relationships within
Phasianidae. Phylogenetic analysis based on nucleotide
sequences was performed using PAUP*4.0b10 for the
Maximum parsimony (MP) method [24], RAxML-7.0.3
for maximum likelihood (ML) [25] and MrBayes 3.1.2
for Bayesian inference (BI) [26]. For ML and BI analyses,
models of the concatenated nucleotide sequences datasets
were assessed independently using AICc in MrModeltest2.2
[27]. The best fit model GTR + I + G was
chosen for the likelihood and Bayesian analyses. A consensus
tree was generated for MP analysis under the majority
rule. The reliability of the clades in the phylogenetic trees
was assessed by bootstrap probabilities (BSP) computed
using 1000 replicates, with random addition for each bootstrap
replicate. The 1000 replicates bootstrap support was
also performed in the ML analysis. Bayesian analysis with
Markov Chain Monte Carlo sampling was run for
1000000 generations saving a tree every 100 generations,
with one cold and three heated chains, and the burn-in
time was determined by the time to convergence of the
likelihood scores. The Bayesian posterior probabilities
(BPP) were estimated on a 50% majority rule consensus
tree of the remaining trees.
We examined the performance of individual genes and
datasets based on nucleotides; PBS analyses were performed
in the program combining TreeRot.v3 [28] and
PAUP*4.0b10 [24]. The following datasets were used for
analysis: 13 protein-coding genes, rrnS, rrnL, CR partitions,
the first, second and third codons of PCG, the
three tRNA gene cluster (IQM, WANCY and HSL), ATP
(atp6 + atp8), COX (cox1 + cox2 + cox3) and NADH
(nad1 + nad2 + nad3 + nad4 + nad4L + nad5 + nad6).
The MEGA 4.1 [22] was used to calculate the pairwise
genetic distance for four Crossoptilon species with default
parameters. The mitogenome aligned data and four
single genes (nad2, CR, cytb and rrnS) obtained from
GenBank (Additional file 3) were used to calculate the
genetic distances. These genes were aligned singly, and
be adjusted to consistent sequence lengths manually.
Divergence time estimates focused on Crossoptilon
Along with the PCG dataset obtained in this study, 42
Galliformes sequences were used to estimate the divergence
time of the Crossoptilon species. The divergence
time of Crossoptilon species was calculated using the
Bayesian procedure implemented in BEAST v. 1.7.2
[29,30]. A relaxed clock was used with rates complying
with a log-normal distribution [31]. The GTR + I + G
model and a Yule prior were used in the analysis. The
calibration points were based on the fossil records showing
that stem Numididae-Phasianidae split at 50–54
Mya (million years ago) [32]; Arborophila rufipectus diverged
from the other lineages in the Galliformes around
39 Mya [33]; Coturnix-Gallus split at 35 Mya [34-36].
The results of runs of 10 million generations were used
after a burn-in of 100.
Ka and Ks analysis
To better understand the evolution at the DNA level
and the role of selection in the four Crossoptilon species,
we calculated the nonsynonymous and synonymous substitution
rates using Kaks_calculator 2.0 [37] for six
groups [C. harmani-C. mantchuricum (C.har-C.man),
C. mantchuricum-C. crossoptilon (C.man-C.cro), C. harmani-
C. crossoptilon (C.har-C.cro), C. harmani-C. auritum
(C.har-C.aur), C. mantchuricum-C. auritum (C.
man-C.aur), and C. crossoptilon-C. auritum (C.cro-C.
aur)]. The ratio of nonsynonymous substitution rate
(Ka) to synonymous substitution rate (Ks) is widely used
as an indicator of selective pressure at the sequence level
among different species. It is commonly accepted that
Ka > Ks, Ka = Ks, and Ka < Ks generally indicate positive
selection, neutral mutation, and negative selection, respectively
[38,39]. To calculate Ka, Ks and Ka/Ks, a
model averaging method was selected. This method includes
14 different models for calculation and derived
the average values for Ka, Ks, and Ka/Ks [37]. The genetic
code selected was the ‘vertebrate mitochondrial
code’. To further study the selective pressure acted on
each protein-coding gene in the genus Crossoptilon,
CodeML in PAMLX software [40] was used to find sites
under strong selective pressure. The secondary structure
analysis of amino acid was performed by using an online
software TOPCONS [4
0/5000
MethodsSample collection and DNA extractionSamples of C. harmani were collected from the Nagquarea in Tibet, China, and voucher specimen was depositedin Institute of Zoology, Shaanxi Normal University;C. mantchuricum and C. crossoptilon were collectedfrom the Beijing Zoo, and samples were obtained frombird specimen collections of the National ZoologicalMuseum, Institute of Zoology, Chinese Academy ofSciences. The collection was under the permit fromForestry Department and conformed to the NationalWildlife Conservation Law in China. No living animalexperiments were conducted in the current research.All the samples were preserved in 100% ethanol andstored at −20°C. The total genomic DNA was extractedfrom the liver/muscle tissue using the standard phenol/chloroform method [16].PCR amplification and sequencingThe PCRs were performed under the following conditions,2 min initial denaturation at 93°C, 40 cycles of:10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 58–53°C,10 min elongation at 68°C in the preliminary 20 cycles,and 10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 53°C,and 10 min elongation at 68°C with 20 s per cycle addedto the elongation step in the succeeding 20 cycles, andfinally an extension for 7 min at 68°C. The amplificationswere performed in 15 μL reactions containing2.4 μL of 2.5 mM dNTPs, 2.1 μL of each primer at 10μΜ, 1.5 μl of 10× LA PCR Buffer I (Mg2+-free), 1.5 μLof 25 mM MgCl2, 1 μL of DNA template, 0.18 μL of 5U/μl LA Taq polymerase (Takara, Dalian, China) and4.22 μL ddH2O.The sequences of the primers used for PCR amplificationand sequencing of the mitochondrial genes wereobtained from Sorenson (2003) [17] with minor changes(Additional file 1). The mitogenome of C. harmani wasamplified in seven parts and the gaps were bridged usingother adjacent primers. The PCR products were purifiedusing the DNA Agarose Gel Extraction Kit (Bioteke,Beijing, China) after separation by electrophoresis on a0.8% agarose gel. After separation and purification, thePCR products were sequenced by Sangon Biotech(Shanghai) Co., LTD. using the Primer-Walking method.The C. mantchuricum and C. crossoptilon mitogenomeswere amplified in 12 or 13 fragments, and sequencing wasperformed using the Illumina Hiseq2000 high-throughputsequencing system of Shenzhen Huada Gene TechnologyCo., LTD. The gaps in the assembly after high-throughputsequencing were filled in by direct sequencing using theABI 3730 DNA sequencer by Sangon Biotech (Shanghai)Co., LTD., using adjacent PCR primers.Gene identification and genome analysesThe Staden sequence analysis package [18] was usedfor sequence assembly and annotation of C. harmanimitogenome. The complete genome assemblies for themitogenomes of C. mantchuricum and C. crossoptilonwere performed using the SOAP de novo software.Most tRNA genes were identified using tRNAscan-SE1.21 [19] under the ‘tRNAscan only’ search mode, withthe vertebrate mitochondrial genetic code and ‘mito/chloroplast’ source. The protein-coding genes (PCGs),rRNA genes and the remaining putative tRNA genesthat were not identified by tRNAscan-SE were identifiedby sequence comparison with other Galliformesspecies. The rrnS secondary structure of Crossoptilonwas predicted based on the structure of Gallus gallusand Anas platyrhynchos obtained from the ComparativeRNA Web (CRW) [20], and Pseudopodoces humilis(now as Parus humilis) structure [16]. The rrnL secondarystructure was predicted based on the structureof Xenopus laevis obtained from the CRW database,Bos taurus [21] and P. humilis structures [16]. TheRNAstructure software was used to identify and drawpotential secondary structures in the single-strandedcontrol region. The nucleotide compositions of themitogenomes and amino acid information were analysedusing MEGA 4.1 [22].Sequence alignmentsAlong with the entire mitogenomes obtained in thisstudy, 42 Galliformes sequences were used in the phylogeneticanalysis, including two outgroups (Numidameleagris and Alectura lathami). The DNA sequences ofthe other species used in the phylogenetic analyses weredownloaded from GenBank (the accession numbers andkey information are shown in Additional file 2). ThetRNA and rRNA genes and the CR were individuallyaligned using ClustalX 1.83 [23] with the default settings.All 13 protein-coding genes were translated intoamino acids, and then aligned using MEGA 4.1 [22] withdefault parameters for each gene, and finally retranslatedinto nucleotide sequences.Phylogenetic analyses of PhasianidaeDatasets containing 13 protein-coding genes (PCG) andall 37 genes plus the control region (mitogenome) wereused to study the phylogenetic relationships withinPhasianidae. Phylogenetic analysis based on nucleotidesequences was performed using PAUP*4.0b10 for theMaximum parsimony (MP) method [24], RAxML-7.0.3for maximum likelihood (ML) [25] and MrBayes 3.1.2for Bayesian inference (BI) [26]. For ML and BI analyses,models of the concatenated nucleotide sequences datasetswere assessed independently using AICc in MrModeltest2.2[27]. The best fit model GTR + I + G waschosen for the likelihood and Bayesian analyses. A consensustree was generated for MP analysis under the majorityrule. The reliability of the clades in the phylogenetic treeswas assessed by bootstrap probabilities (BSP) computedusing 1000 replicates, with random addition for each bootstrapreplicate. The 1000 replicates bootstrap support wasalso performed in the ML analysis. Bayesian analysis withMarkov Chain Monte Carlo sampling was run for1000000 generations saving a tree every 100 generations,with one cold and three heated chains, and the burn-intime was determined by the time to convergence of thelikelihood scores. The Bayesian posterior probabilities(BPP) were estimated on a 50% majority rule consensustree of the remaining trees.We examined the performance of individual genes anddatasets based on nucleotides; PBS analyses were performedin the program combining TreeRot.v3 [28] andPAUP*4.0b10 [24]. The following datasets were used foranalysis: 13 protein-coding genes, rrnS, rrnL, CR partitions,the first, second and third codons of PCG, thethree tRNA gene cluster (IQM, WANCY and HSL), ATP(atp6 + atp8), COX (cox1 + cox2 + cox3) and NADH(nad1 + nad2 + nad3 + nad4 + nad4L + nad5 + nad6).The MEGA 4.1 [22] was used to calculate the pairwisegenetic distance for four Crossoptilon species with defaultparameters. The mitogenome aligned data and foursingle genes (nad2, CR, cytb and rrnS) obtained fromGenBank (Additional file 3) were used to calculate thegenetic distances. These genes were aligned singly, andbe adjusted to consistent sequence lengths manually.Divergence time estimates focused on CrossoptilonAlong with the PCG dataset obtained in this study, 42Galliformes sequences were used to estimate the divergencetime of the Crossoptilon species. The divergencetime of Crossoptilon species was calculated using theBayesian procedure implemented in BEAST v. 1.7.2[29,30]. A relaxed clock was used with rates complyingwith a log-normal distribution [31]. The GTR + I + Gmodel and a Yule prior were used in the analysis. Thecalibration points were based on the fossil records showingthat stem Numididae-Phasianidae split at 50–54
Mya (million years ago) [32]; Arborophila rufipectus diverged
from the other lineages in the Galliformes around
39 Mya [33]; Coturnix-Gallus split at 35 Mya [34-36].
The results of runs of 10 million generations were used
after a burn-in of 100.
Ka and Ks analysis
To better understand the evolution at the DNA level
and the role of selection in the four Crossoptilon species,
we calculated the nonsynonymous and synonymous substitution
rates using Kaks_calculator 2.0 [37] for six
groups [C. harmani-C. mantchuricum (C.har-C.man),
C. mantchuricum-C. crossoptilon (C.man-C.cro), C. harmani-
C. crossoptilon (C.har-C.cro), C. harmani-C. auritum
(C.har-C.aur), C. mantchuricum-C. auritum (C.
man-C.aur), and C. crossoptilon-C. auritum (C.cro-C.
aur)]. The ratio of nonsynonymous substitution rate
(Ka) to synonymous substitution rate (Ks) is widely used
as an indicator of selective pressure at the sequence level
among different species. It is commonly accepted that
Ka > Ks, Ka = Ks, and Ka < Ks generally indicate positive
selection, neutral mutation, and negative selection, respectively
[38,39]. To calculate Ka, Ks and Ka/Ks, a
model averaging method was selected. This method includes
14 different models for calculation and derived
the average values for Ka, Ks, and Ka/Ks [37]. The genetic
code selected was the ‘vertebrate mitochondrial
code’. To further study the selective pressure acted on
each protein-coding gene in the genus Crossoptilon,
CodeML in PAMLX software [40] was used to find sites
under strong selective pressure. The secondary structure
analysis of amino acid was performed by using an online
software TOPCONS [4
Mya (million years ago) [32]; Arborophila rufipectus diverged
from the other lineages in the Galliformes around
39 Mya [33]; Coturnix-Gallus split at 35 Mya [34-36].
The results of runs of 10 million generations were used
after a burn-in of 100.
Ka and Ks analysis
To better understand the evolution at the DNA level
and the role of selection in the four Crossoptilon species,
we calculated the nonsynonymous and synonymous substitution
rates using Kaks_calculator 2.0 [37] for six
groups [C. harmani-C. mantchuricum (C.har-C.man),
C. mantchuricum-C. crossoptilon (C.man-C.cro), C. harmani-
C. crossoptilon (C.har-C.cro), C. harmani-C. auritum
(C.har-C.aur), C. mantchuricum-C. auritum (C.
man-C.aur), and C. crossoptilon-C. auritum (C.cro-C.
aur)]. The ratio of nonsynonymous substitution rate
(Ka) to synonymous substitution rate (Ks) is widely used
as an indicator of selective pressure at the sequence level
among different species. It is commonly accepted that
Ka > Ks, Ka = Ks, and Ka < Ks generally indicate positive
selection, neutral mutation, and negative selection, respectively
[38,39]. To calculate Ka, Ks and Ka/Ks, a
model averaging method was selected. This method includes
14 different models for calculation and derived
the average values for Ka, Ks, and Ka/Ks [37]. The genetic
code selected was the ‘vertebrate mitochondrial
code’. To further study the selective pressure acted on
each protein-coding gene in the genus Crossoptilon,
CodeML in PAMLX software [40] was used to find sites
under strong selective pressure. The secondary structure
analysis of amino acid was performed by using an online
software TOPCONS [4
การแปล กรุณารอสักครู่..
วิธีการเก็บตัวอย่างและการสกัดดีเอ็นเอตัวอย่างHarmani ซีที่ถูกเก็บรวบรวมจาก Nagqu พื้นที่ในทิเบตจีนและตัวอย่างบัตรกำนัลฝากในสถาบันสัตววิทยามณฑลส่านซีมหาวิทยาลัย; ซี mantchuricum และ C crossoptilon ถูกเก็บรวบรวมจากสวนสัตว์ปักกิ่งและกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับจากคอลเลกชันตัวอย่างนกของสวนสัตว์แห่งชาติพิพิธภัณฑ์สถาบันสัตววิทยาจีนAcademy of Sciences คอลเลกชันที่อยู่ภายใต้ใบอนุญาตจากกรมป่าไม้และสอดคล้องกับชาติกฎหมายอนุรักษ์สัตว์ป่าในประเทศจีน ไม่มีที่อยู่อาศัยของสัตว์ทดลองในการวิจัยในปัจจุบัน. ทั้งหมดตัวอย่างที่ถูกเก็บรักษาไว้ในเอทานอล 100% และเก็บไว้ที่-20 ° C ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่ถูกสกัดจากตับ / เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อโดยใช้มาตรฐานฟีนอล / วิธีคลอโรฟอร์ม [16]. ขยาย PCR และลำดับPCRs ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้2 นาที denaturation เริ่มต้นที่ 93 องศาเซลเซียส 40 รอบ: 10 denaturation s ที่ 92 ° C, 30 วินาทีหลอมที่ 58-53 องศาเซลเซียสการยืดตัว10 นาทีที่ 68 ° C ในเบื้องต้น 20 รอบและ10 วินาที denaturation ที่ 92 ° C, 30 วินาทีการอบที่ 53 องศาเซลเซียสและ10 นาที การยืดตัวที่ 68 ° C 20 วินาทีต่อรอบเพิ่มไปยังขั้นตอนการยืดตัวที่ประสบความสำเร็จในรอบ20 และในที่สุดก็ขยายเวลา7 นาทีที่ 68 ° C เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการใน 15 ปฏิกิริยาไมโครลิตรที่มี 2.4 ไมโครลิตร 2.5 มิลลิ dNTPs 2.1 ไมโครลิตรของไพรเมอร์แต่ละ 10 μΜ 1.5 ไมโครลิตร 10 × LA PCR บัฟเฟอร์ฉัน (Mg2 + ฟรี) 1.5 ไมโครลิตร25 มิลลิ MgCl2 1 ไมโครลิตรของ แม่แบบดีเอ็นเอ 0.18 ไมโครลิตร 5 U / ไมโครลิตร LA โพลิเมอร์ Taq (Takara ต้าเหลียนประเทศจีน) และ4.22 ไมโครลิตร ddH2O. ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยาย PCR และลำดับของยีนยลได้ที่ได้รับจากโซเรน (2003) [17] ที่มีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อย (แฟ้มเพิ่มเติม 1) mitogenome ซี Harmani ถูกขยายในเจ็ดส่วนและช่องว่างที่ถูกสะพานโดยใช้ไพรเมอร์ที่อยู่ใกล้เคียงอื่นๆ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เจลAgarose สกัดดีเอ็นเอ Kit (Bioteke, ปักกิ่ง, จีน) หลังจากที่แยกจากอิเล็กบน0.8% agarose เจล หลังจากการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR โดยมีลำดับขั้นตอน Sangon ไบโอเทค (Shanghai) Co. , LTD โดยใช้วิธีการรองพื้น-การเดิน. mantchuricum ซีและซี crossoptilon mitogenomes ถูกขยายใน 12 หรือ 13 ชิ้นและลำดับถูกดำเนินการโดยใช้Illumina Hiseq2000 สูงผ่านระบบการจัดลำดับของเซินเจิ้นHuada ยีนเทคโนโลยีจำกัด ช่องว่างในการชุมนุมหลังจากที่สูงผ่านลำดับที่เต็มไปด้วยลำดับโดยตรงโดยใช้ซีเควนดีเอ็นเอABI 3730 โดย Sangon ไบโอเทค (Shanghai) Co. , LTD. โดยใช้ไพรเมอร์ที่อยู่ติดกัน PCR. บัตรประจำตัวของยีนและการวิเคราะห์จีโนมแพคเกจการวิเคราะห์ลำดับ Staden [ 18] ถูกนำมาใช้สำหรับการชุมนุมลำดับและคำอธิบายประกอบซีHarmani mitogenome ประกอบจีโนมที่สมบูรณ์แบบสำหรับmitogenomes ซี mantchuricum และ C crossoptilon ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์เดอ SOAP โนโวได้. ยีน tRNA ส่วนใหญ่ระบุการใช้ tRNAscan-SE 1.21 [19] ภายใต้ 'tRNAscan เท่านั้น' โหมดการค้นหาด้วยยลเลี้ยงลูกด้วยนมรหัสพันธุกรรมและ 'โตะ / chloroplast' แหล่งที่มา ยีนโปรตีนเข้ารหัส (PCGS) ยีน rRNA และยีนสมมุติ tRNA ที่เหลือที่ไม่ได้ถูกระบุtRNAscan-SE ที่ถูกระบุโดยเปรียบเทียบกับคนอื่นๆ ตามลำดับรอมส์สปีชีส์ โครงสร้าง rrnS รองของ Crossoptilon เป็นที่คาดการณ์บนพื้นฐานของโครงสร้างของกางเกงกางเกงและ Anas platyrhynchos ที่ได้รับจากการเปรียบเทียบ RNA เว็บ (CRW) [20] และ Pseudopodoces humilis (ตอนนี้เป็น Parus humilis) โครงสร้าง [16] rrnL รองโครงสร้างเป็นที่คาดการณ์บนพื้นฐานของโครงสร้างของXenopus laevis ที่ได้รับจากฐานข้อมูล CRW, ราศีพฤษภ [21] และพี humilis โครงสร้าง [16] ซอฟต์แวร์ RNAstructure ถูกใช้ในการระบุและวาดโครงสร้างทุติยภูมิที่มีศักยภาพในเดียวควั่นภูมิภาคควบคุม องค์ประกอบเบื่อหน่ายของmitogenomes และข้อมูลกรดอะมิโนที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้MEGA 4.1 [22] .Sequence การจัดแนวพร้อมกับทั้งmitogenomes ได้รับในการศึกษา42 รอมส์ลำดับที่ถูกนำมาใช้ในสายวิวัฒนาการการวิเคราะห์รวมทั้งสองoutgroups (Numida meleagris และ Alectura lathami ) ลำดับดีเอ็นเอของสายพันธุ์อื่น ๆ ที่ใช้ในการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการที่ถูกดาวน์โหลดจากGenBank (ตัวเลขเข้าและข้อมูลที่สำคัญที่แสดงอยู่ในแฟ้มเพิ่มเติม2) ยีน tRNA และ rRNA และ CR ถูกเป็นรายบุคคลชิดโดยใช้ClustalX 1.83 [23] กับการตั้งค่าเริ่มต้น. ทั้งหมด 13 ยีนโปรตีนเข้ารหัสแปลเป็นกรดอะมิโนและสอดคล้องแล้วใช้MEGA 4.1 [22] กับพารามิเตอร์เริ่มต้นสำหรับยีนแต่ละและในที่สุดก็ retranslated ลงในลำดับเบส. การวิเคราะห์วิวัฒนาการของนกกระทาชุดข้อมูลที่มี 13 ยีนโปรตีนเข้ารหัส (PCG) และทั้งหมด37 ยีนบวกภูมิภาคควบคุม (mitogenome) ถูกนำมาใช้ในการศึกษาความสัมพันธ์ของสายวิวัฒนาการภายในนกกระทา การวิเคราะห์วิวัฒนาการขึ้นอยู่กับเบื่อหน่ายลำดับได้รับการดำเนินการโดยใช้ PAUP * 4.0b10 สำหรับความประหยัดสูงสุด(MP) วิธีการ [24], RAxML-7.0.3 สำหรับโอกาสสูงสุด (ML) [25] และ MrBayes 3.1.2 สำหรับการอนุมานแบบเบย์ (BI) [26] สำหรับ ML และวิเคราะห์ BI, รูปแบบของชุดข้อมูลลำดับเบสตัดแบ่งการประเมินเป็นอิสระในการใช้ AICC MrModeltest2.2 [27] พอดี GTR แบบที่ดีที่สุด + I + G ได้รับการแต่งตั้งให้โอกาสและการวิเคราะห์แบบเบย์ ฉันทามติต้นไม้ถูกสร้างขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ MP ภายใต้ส่วนใหญ่กฎ ความน่าเชื่อถือของ clades ในต้นไม้ได้รับการประเมินโดยน่าจะบูต(BSP) คำนวณโดยใช้1000 ซ้ำด้วยนอกเหนือสุ่มสำหรับแต่ละบูตซ้ำ 1000 ซ้ำสนับสนุนบูตได้ยังดำเนินการในการวิเคราะห์ML การวิเคราะห์แบบเบย์ที่มีห่วงโซ่มาร์คอฟสุ่มตัวอย่าง Monte Carlo ถูกใช้สำหรับ 1000000 รุ่นประหยัดต้นไม้ทุก ๆ 100 รุ่นหนึ่งที่หนาวเย็นและสามโซ่ร้อนและการเผาไหม้ในเวลาที่ถูกกำหนดโดยเวลาในการบรรจบกันของความน่าจะเป็นคะแนน ความน่าจะเป็นหลังแบบเบย์(BPP) อยู่ที่ประมาณในเสียงข้างมาก 50% ฉันทามติ. ต้นไม้ของต้นไม้ที่เหลือเราตรวจสอบประสิทธิภาพการทำงานของยีนของแต่ละบุคคลและชุดข้อมูลขึ้นอยู่กับนิวคลีโอ; วิเคราะห์พีบีเอสได้ดำเนินการในโปรแกรมรวม TreeRot.v3 [28] และ PAUP * 4.0b10 [24] ชุดข้อมูลต่อไปนี้ถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์: 13 ยีนโปรตีนเข้ารหัส rrnS, rrnL พาร์ทิชัน CR, ครั้งแรก codons สองและสามของ PCG ที่สามกลุ่มยีนtRNA (IQM, WANCY และ HSL) เอทีพี(atp6 + atp8) , COX (cox1 + + COX2 cox3) และ NADH (nad1 nad2 + + + nad3 nad4 nad4L + + + nad5 nad6). เมกะ 4.1 [22] ถูกนำมาใช้ในการคำนวณจากจำนวนระยะทางพันธุกรรมสี่Crossoptilon สายพันธุ์ที่มีค่าเริ่มต้นพารามิเตอร์ ข้อมูลที่สอดคล้อง mitogenome และสี่ยีนเดียว(nad2, CR, cytb และ rrnS) ที่ได้รับจากGenBank (แฟ้มเพิ่มเติม 3) ถูกนำมาใช้ในการคำนวณระยะทางพันธุกรรม ยีนเหล่านี้ถูกจัดชิดโดยลำพังและได้รับการปรับเปลี่ยนให้สอดคล้องลำดับความยาวด้วยตนเอง. ประมาณการเวลาที่แตกต่างมุ่งเน้นไปที่ Crossoptilon พร้อมกับชุด PCG ที่ได้รับในการศึกษาครั้งนี้ 42 รอมส์ลำดับที่ถูกนำมาใช้ในการประเมินความแตกต่างเวลาของสายพันธุ์ Crossoptilon ความแตกต่างเวลาของสายพันธุ์ Crossoptilon ที่คำนวณโดยใช้ขั้นตอนการดำเนินการในคชกรรมBEAST v. 1.7.2 [29,30] นาฬิกาผ่อนคลายถูกนำมาใช้ที่มีอัตราการปฏิบัติมีการกระจายเข้าสู่ระบบปกติ [31] วิ่ง + I + G รูปแบบและเทศกาลคริสต์มาสก่อนถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ จุดสอบเทียบอยู่บนพื้นฐานของบันทึกการแสดงฟอสซิลที่ลำต้น Numididae-แยกนกกระทาที่ 50-54 ม (ล้านปีก่อน) [32]; Arborophila rufipectus แยกจากlineages อื่น ๆ ในฟรอมรอบ39 ม [33]; นกคุ่ม-กางเกงแยกที่ 35 ม [34-36]. ผลของการทำงาน 10 ล้านคนรุ่นถูกนำมาใช้หลังจากที่มีการเผาไหม้ใน100 กา Ks และการวิเคราะห์เพื่อทำความเข้าใจวิวัฒนาการในระดับดีเอ็นเอและบทบาทของการเลือกในสี่สายพันธุ์ Crossoptilon, เราคำนวณการเปลี่ยนตัวผู้เล่น nonsynonymous ตรงกันและอัตราการใช้Kaks_calculator 2.0 [37] หกกลุ่ม[ซี Harmani-C mantchuricum (C.har-C.man) ซี mantchuricum-C crossoptilon (C.man-C.cro) harmani- ซีซี crossoptilon (C.har-C.cro) ซี Harmani-C auritum (C.har-C.aur) ซี mantchuricum-C auritum (คคนC.aur) และซี crossoptilon-C auritum (C.cro-C. aur)] อัตราส่วนของอัตราทดแทน nonsynonymous (กา) กับอัตราทดแทนความหมายเหมือนกัน (Ks) ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นตัวบ่งชี้ความดันเลือกในระดับลำดับที่ในหมู่ชนิดต่างๆ เป็นที่ยอมรับกันทั่วไปว่ากา> Ks, Ka = Ks และกา <Ks โดยทั่วไปแสดงให้เห็นในเชิงบวกเลือกการกลายพันธุ์ที่เป็นกลางและเลือกลบตามลำดับ[38,39] ในการคำนวณกา Ks และกา / Ks เป็นวิธีการเฉลี่ยแบบจำลองได้รับเลือก วิธีการนี้รวมถึง14 รูปแบบที่แตกต่างกันสำหรับการคำนวณและการได้มาค่าเฉลี่ยสำหรับกาKs และกา / Ks [37] พันธุกรรมรหัสที่เลือกเป็น'เลี้ยงลูกด้วยนมยลรหัส' เพื่อเป็นการศึกษาความดันเลือกทำหน้าที่ในแต่ละยีนโปรตีนเข้ารหัสในประเภท Crossoptilon, CodeML ซอฟต์แวร์ PAMLX [40] ถูกนำมาใช้ในการค้นหาเว็บไซต์ภายใต้ความดันเลือกที่แข็งแกร่ง โครงสร้างรองวิเคราะห์ของกรดอะมิโนที่ได้ดำเนินการโดยใช้ออนไลน์TOPCONS ซอฟแวร์ [4
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- ธนาคารตั้งอยู่ชั้นใต้ดินและสัญญาณไม่ดี
- As shown in Table 1, many studies are un
- มือถือเป็นส่วนสำคัญสำหรับชีวิตมากขึ้นทุก
- 2015 Pro Long Sleeve Cycling Jersey Men
- Tamarind
- ผู้หญิงและผู้ชายมีความสำคัญในการเลี้ยงดู
- To the present
- 確保
- The exact cause of this genetic disorder
- ไม่ควรตากแดดมากเกินไป
- our company have a purpose to permission
- ให้ฉันกอด
- Colosseum
- The new trains running along the elevate
- New sequences of Lenzitopsis along with
- stall
- classified
- Hi AriyanonI would like to know whether
- ย้ายพัดลมคอยน์ร้อน
- นั่งหาข้อมูลอยู่
- สถาบันการเงิน
- What's the other?
- ฉันติดขบวนเสด็จ
- ฟักทองไง
