2. Materials and methods2.1. Isolat

2. Materials and methods
2.1. Isolation of endophytic fungi
For isolation of endophytic fungi four districts of Assam,
North East India were selected. Isolation was done from
healthy and mature leaves of C. sinensis. The samples were
processed within 24 h of collection and isolation was done
according to Petrini and Dreyfuss [27,28]. The leaves were
cut into small pieces (1 cm2
), washed in running tap water followed
by 96% alcohol treatment for 30 s, washed with sterile
distilled water for 30 s followed by sodium hypochloride
NaOCl (15%)–distilled water (1:3) treatment for 5 min, treated
with 96% alcohol for 30 s and finally washed with sterile water
for 1–2 min followed by drying. Surface sterilization was followed
as per the protocol described by Petrini and Dreyfuss
[27,28]. It was then kept in Petriplates containing PDA media
and kept in incubator at 28 C at inverted position for 5–
6 days. As the hyphal growth appeared, it was finally transferred
to PDA slant for further processing and PDA slant is
prepared in test tube which helps to store the fungi for a long
period.
2.2. Morphological and cultural characteristics of endophytic
fungi
The isolates were inoculated on PDA (media) containing plates
and allowed to grow in an incubator at 28 C for 6–8 days.
Morphological studies were carried out when the mycelium
of each isolate occupied the whole Petri plate. Morphological
characteristics included macroscopic and microscopic characteristics.
Macroscopic characteristics included the colony
morphology and growth rate of the fungal isolates and microscopic
characteristics included the conidial shape and size and
rate of sporulation. Sporulation rate was studied by preparing
spore suspension. Spores were counted by taking 9 ll cell
suspensions in hemocytometer which was placed under a
microscope.
2.3. Amplification of ITS-rDNA for molecular identification
Genomic DNA of all the isolates of endophytic fungi was
extracted using Nucleopore gDNA Fungal Bacterial Mini
Kit (Genetix, India) as per the manufacturer’s instructions.
For extraction of genomic DNA, each fungal isolate was
grown on Potato Dextrose Broth which is a liquid medium
and genomic DNA was isolated from the harvested mycelium.
For amplification of ITS-rDNA, the whole genomic DNA was
amplified in a thermocycler (Gen Amp 9700, Applied Biosystem,
US) using primer pair ITS1 (TCCGTAGGTGAACCT
GCGG) and ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) [53]
which allow to amplify the ITS region of the fungal species.
The conditions for Polymerase Chain Reaction for ITSrDNA
amplification was 95 C for 5 min, 35 cycles of 94 C
for 45 s, 60 C for 30 s, 72 C for 45 s and final 72 C for
5 min. The product size was approximately 575 bp which was
visible in 1.2% agarose gel under UV light. The PCR product
of each isolate was purified using PCR purification kit (Fermentas,
Lithuania) as per the provided protocol. Sequencing
of the PCR product was done by a Sanger’s Dideoxy method
on applied Biosystem 3730XL (Bioloink, New Delhi, India).
The sequence of each isolate was subjected to BLAST search
(http://wwwncbinlmgov/BLAST) with NCBI database [1].
All the sequences were aligned with representative sequences
in the NCBI database using CLUSTAL W [48] and employing
MEGA 52 software, the phylogenetic analysis of the alignment
was performed with Maximum Likelihood Method.
182 A

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. การแยกเชื้อ endophyticสำหรับแยกเชื้อ endophytic สี่เขตรัฐอัสสัมอินเดียตะวันออกเฉียงเหนือได้เลือก ทำการแยกจากใบแข็ง และผู้ใหญ่ของ C. sinensis ตัวอย่างได้ดำเนินการภายใน 24 ชม.การเก็บรวบรวม และแยกเสร็จตาม Petrini และเดรย์ฟัส [27,28] มีใบตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ (1 cm2), ล้างทำความสะอาดในการทำน้ำประปาตามโดยการรักษาแอลกอฮอล์ 96% 30 s ล้างด้วยผ่านการฆ่าเชื้อกลั่นน้ำ 30 s ตาม ด้วยโซเดียม hypochlorideNaOCl (15%) – กลั่นบำบัดน้ำ (1:3) สำหรับ 5 นาที รักษามีเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ 96% 30 s และสุดท้าย ล้าง ด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ1-2 นาทีตาม ด้วยการอบแห้ง ฆ่าเชื้อพื้นผิวตามมาตามโพรโทคอลโดย Petrini และเดรย์ฟัส[27,28] . มันถูกเก็บไว้ใน Petriplates ที่ประกอบด้วย PDA สื่อแล้วและเก็บไว้ในตู้อบที่ 28 C ที่ตำแหน่งสลับ 5 –6 วัน เป็นการเจริญเติบโต hyphal ปรากฏ มันก็โอนย้ายการเอียง PDA และ PDA เอียงเพื่อ ให้เป็นในหลอดทดลองซึ่งช่วยให้เก็บเชื้อในระยะยาวรอบระยะเวลา2.2. สัณฐาน และวัฒนธรรมลักษณะของ endophyticเชื้อราการแยกมี inoculated บน PDA (สื่อ) ที่ประกอบด้วยแผ่นและได้รับอนุญาตให้เติบโตในตู้อบมีที่ 28 C สำหรับ 6-8 วันการศึกษาสัณฐานดำเนินการเมื่อการยังของแต่ละ isolate ครอบครองจานเพาะทั้งหมด สัณฐานลักษณะรวมลักษณะด้วยตาเปล่า และด้วยกล้องจุลทรรศน์ลักษณะด้วยตาเปล่ารวมอาณานิคมสัณฐานวิทยาและการเจริญเติบโตอัตรา การแยกเชื้อรา และกล้องจุลทรรศน์ลักษณะรวม conidial รูปร่างและขนาด และอัตราของ sporulation Sporulation ราคาถูกศึกษา โดยเตรียมระงับสปอร์ นับสปอร์โดย ll 9 เซลล์สารแขวนลอยใน hemocytometer ซึ่งอยู่ภายใต้การกล้องจุลทรรศน์2.3. การขยายของของ rDNA สำหรับรหัสโมเลกุลออกดีเอ็นเอของทั้งหมดแยกของเชื้อ endophytic ถูกสกัดโดยใช้ Nucleopore gDNA มินิแบคทีเรียเชื้อราชุด (Genetix อินเดีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับสกัด DNA ออก isolate แต่ละเชื้อราได้ปลูกบนน้ำซุปมันฝรั่งเดกซ์โทรสซึ่งเป็นเหลวและออกดีเอ็นเอแยกจากยังเก็บเกี่ยวสำหรับการขยายของของ rDNA ดีเอ็นเอทั้งหมดออกเป็นขยายในเครื่อง thermocycler (Gen แอมป์ 9700 ใช้ Biosystemสหรัฐ) โดยใช้ไพรเมอร์คู่ ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) และ ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) [53]ซึ่งช่วยให้สามารถขยายพื้นที่ของของสายพันธุ์เชื้อราเงื่อนไขสำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสสำหรับ ITSrDNAขยายเป็น 95 C 5 นาที 35 รอบที่ 94 Cสำหรับ 45 s, 60 C สำหรับ s, 72 C 30 45 วินาทีและสุดท้าย 72 C สำหรับ5 นาที สินค้าขนาดถูกประมาณ 575 bp ซึ่งมองเห็นได้ใน 1.2% agarose เจภายใต้แสงยูวี ผลิตภัณฑ์ PCRของแต่ละโปรตีนบริสุทธิ์โดยใช้ PCR kit ทำให้บริสุทธิ์ (Fermentasลิทัวเนีย) ตามโพรโทคอลให้ การจัดลำดับของ PCR ที่ ทำผลิตภัณฑ์ ด้วยวิธี Dideoxy Sanger เป็นบนใช้ Biosystem 3730XL (Bioloink นิวเดลี อินเดีย)ลำดับของโปรตีนแต่ละได้ภายใต้การค้นหาระเบิด(http://wwwncbinlmgov/BLAST) กับฐานข้อมูล NCBI [1]ลำดับที่สอดคล้องกับลำดับตัวแทนในฐานข้อมูล NCBI ใช้ W CLUSTAL [48] และจ้างเมกา 52 ซอฟต์แวร์ การวิเคราะห์ผลของการจัดตำแหน่งดำเนินการ ด้วยวิธีความเป็นไปได้สูงสุด182 A

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การแยกเชื้อราเอนโดไฟท์
สำหรับการแยกทางของเชื้อราเอนโดไฟท์สี่อำเภอของรัฐอัสสัม
ทางตะวันออกเฉียงเหนือของอินเดียได้รับการคัดเลือก การแยกที่ทำจาก
ใบมีสุขภาพดีและเป็นผู้ใหญ่ของซีเนซิส กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการ
ดำเนินการภายใน 24 ชั่วโมงของการเก็บรวบรวมและการแยกได้ทำ
ตาม Petrini และเดรย์ฟั [27,28] ใบที่ถูก
ตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ (1 cm2
) ล้างในใช้น้ำประปาใช้
การรักษาด้วยแอลกอฮอล์ 96% เป็นเวลา 30 วินาที, การล้างด้วยการฆ่าเชื้อ
น้ำกลั่นเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วยโซเดียมไฮโปคลอไร
NaOCl (15%) - น้ำกลั่น (1: 3) การรักษาเป็นเวลา 5 นาทีได้รับการรักษา
ด้วยแอลกอฮอล์ 96% เป็นเวลา 30 วินาทีและในที่สุดก็ล้างด้วยน้ำหมัน
1-2 นาทีตามด้วยการอบแห้ง การฆ่าเชื้อตามพื้นผิว
ตามโปรโตคอลอธิบายโดย Petrini และเดรย์ฟั
[27,28] แล้วก็เก็บไว้ใน Petriplates มีสื่อ PDA
และเก็บไว้ในศูนย์บ่มเพาะที่ 28 C ที่ตำแหน่ง Inverted สำหรับ 5-
6 วัน การเจริญเติบโตของเส้นใยที่ปรากฏในที่สุดก็โอน
ไปเอียง PDA สำหรับการประมวลผลต่อไปและ PDA เอียงจะ
จัดทำในหลอดทดลองซึ่งจะช่วยให้การจัดเก็บเชื้อราเป็นเวลานาน
ระยะเวลา.
2.2 ลักษณะทางสัณฐานวิทยาและวัฒนธรรมของเอนโดไฟท์
เชื้อรา
ไอโซเลทถูกเชื้อบน PDA (Media) ที่มีแผ่น
และได้รับอนุญาตที่จะเติบโตในศูนย์บ่มเพาะที่ 28 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6-8 วัน.
การศึกษาทางสัณฐานวิทยาได้ดำเนินการเมื่อเส้นใย
ของแต่ละแยกครอบครองจาน Petri ทั้งหมด . ทางสัณฐานวิทยา
ลักษณะรวมลักษณะเปล่าและกล้องจุลทรรศน์.
ลักษณะเปล่ารวมอาณานิคม
สัณฐานวิทยาและอัตราการเจริญเติบโตของเชื้อราไอโซเลทและกล้องจุลทรรศน์
ลักษณะรูปร่างรวมถึงเชื้อราและขนาดและ
อัตราการสร้างสปอร์ อัตราการสร้างสปอร์ได้รับการศึกษาโดยการเตรียมความพร้อม
สปอร์แขวนลอย สปอร์นับโดยการใช้เซลล์ 9 LL
แขวนลอยใน hemocytometer ซึ่งถูกวางไว้ภายใต้
กล้องจุลทรรศน์.
2.3 การขยายตัวของมัน-rDNA สำหรับประชาชนในระดับโมเลกุล
DNA ของยีนของเชื้อทั้งหมดของเชื้อราเอนโดไฟท์ถูก
สกัดโดยใช้ Nucleopore gDNA เชื้อราแบคทีเรีย Mini
Kit (Genetix, อินเดีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต.
สำหรับการสกัดดีเอ็นเอแต่ละแยกเชื้อราได้รับการ
ปลูกในมันฝรั่ง น้ำซุป dextrose ซึ่งเป็นอาหารเหลว
และดีเอ็นเอที่แยกได้จากเส้นใยเก็บเกี่ยว.
สำหรับการขยายตัวของมัน-rDNA ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดถูก
ขยายใน thermocycler A (Gen Amp 9700 ประยุกต์ Biosystem,
สหรัฐอเมริกา) โดยใช้ไพรเมอร์คู่ ITS1 (TCCGTAGGTGAACCT
GCGG ) และ ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) [53]
ซึ่งอนุญาตให้มีการขยายพื้นที่ของเชื้อรา.
เงื่อนไขสำหรับ Polymerase Chain Reaction สำหรับ ITSrDNA
ขยายเป็น 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 35 รอบ 94 C
เป็นเวลา 45 วินาที, 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 s, 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาทีและครั้งสุดท้าย 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
5 นาที ขนาดสินค้าประมาณ 575 bp ซึ่ง
มองเห็นได้ในเจล agarose 1.2% ภายใต้แสงยูวี ผลิตภัณฑ์ PCR
ของแต่ละแยกบริสุทธิ์โดยใช้วิธี PCR บริสุทธิ์ Kit (Fermentas,
ลิทัวเนีย) ตามโปรโตคอลให้ การเรียงลำดับ
ของผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้กระทำโดยวิธี dideoxy ของแซงเจอร์
. ประยุกต์ Biosystem 3730XL (Bioloink นิวเดลีอินเดีย)
ลำดับของแต่ละแยกได้ภายใต้การค้นหาระเบิด
(http: // wwwncbinlmgov / BLAST) กับฐานข้อมูล NCBI [1] .
ลำดับทั้งหมดถูกสอดคล้องกับลำดับตัวแทน
ในฐานข้อมูล NCBI ใช้ Clustal W [48] และการจ้าง
MEGA 52 ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของการจัดตำแหน่ง
ได้ดำเนินการกับวิธีที่ควรจะเป็นสูงสุด.
182

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . การแยกราเอนโดไฟต์สำหรับการแยกราเอนโดไฟต์ที่ 4 อำเภอของรัฐอัสสัมภาคตะวันออกเฉียงเหนืออินเดียได้รับเลือก แยกได้จากใบของ ไซแนนซิส มีสุขภาพแข็งแรง และเป็นผู้ใหญ่ กลุ่มตัวอย่างประมวลผลภายใน 24 ชั่วโมงของการเก็บรวบรวมและแยกเสร็จและตาม เปตรินี ดรายฟัส [ 27,28 ] ใบคือตัดเป็นชิ้นขนาด 1 ตร. ซม.) , ล้างในใช้น้ำประปา ตามโดยการรักษาแอลกอฮอล์ 96% 30 S , การล้างด้วยการเป็นหมันน้ำกลั่นสำหรับ 30 วินาทีตามด้วย hypochloride โซเดียมไม่ระบุ ( 15% ) และน้ำกลั่น ( 1 : 3 ) การรักษาเป็นเวลา 5 นาที ถือว่ากับเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ 96% 30 และสุดท้ายล้างด้วยน้ำปลอดเชื้อ1 – 2 นาที ตามด้วยการอบแห้ง ฆ่าเชื้อที่พื้นผิวได้ตามตามขั้นตอนที่อธิบายไว้โดย เปตรินี่ และ ดรายฟัส[ 27,28 ] มันถูกเก็บไว้ใน petriplates PDA ที่มีสื่อและเก็บในตู้อบที่ 28 C ที่คว่ำตำแหน่ง 5 –6 วัน การลดลงมา สุดท้ายก็ย้ายลาด PDA สำหรับการประมวลผลต่อไปและ PDA เอียงคือที่เตรียมไว้ในหลอดทดลอง ซึ่งช่วยให้เก็บได้นาน เชื้อราระยะเวลา2.2 . ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของราเอนโดไฟต์และลักษณะทางวัฒนธรรมเชื้อราการแยกปลูกเชื้อบน PDA ( สื่อ ) ที่ประกอบด้วยแผ่นและได้รับอนุญาตให้เติบโตในตู้อบที่ 28 C 6 – 8 วันการศึกษาลักษณะโครงสร้าง พบว่าเมื่อให้เส้นใยของแต่ละแยกครอบครองจาน Petri ทั้งหมด โดยลักษณะทางกล้องจุลทรรศน์รวมและคุณลักษณะลักษณะทางรวมอาณานิคมสัณฐานวิทยาและการเจริญเติบโตของเชื้อราไอโซเลทและขนาดจิ๋วลักษณะรูปร่างและขนาดและจากรวมอัตราการสร้างสปอร์ อัตราการศึกษาโดยเตรียมการสร้างสปอร์ สปอร์ถูกนับโดยการใช้เซลล์จะ 9แขวนลอยใน hemocytometer ซึ่งอยู่ภายใต้กล้องจุลทรรศน์2.3 ด้วยการขยายของโมเลกุลดีเอ็นเอของเชื้อของราเอนโดไฟต์ที่แยกได้ทั้งหมดสกัดโดยใช้ nucleopore gdna เชื้อราแบคทีเรีย มินิชุด ( genetix อินเดีย ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับการสกัดดีเอ็นเอแต่ละคนแยกเป็นเชื้อราที่ปลูกใน Potato Dextrose Broth ซึ่งเป็นอาหารเหลวแล้วดีเอ็นเอได้จากการเก็บเกี่ยวเส้นใย .เพื่อเพิ่มปริมาณของ rDNA , ดีเอ็นเอทั้งหมด คือขยายในเทอร์มอไซเคล ์ ( gen ) biosystem 9700 , ประยุกต์ ,เราใช้ its1 คู่ไพรเมอร์ ( tccgtaggtgaacctgcgg ) และ its4 ( tcctccgcttattgatatgc ) [ 53 ]ซึ่งอนุญาตให้ขยายของเขตของสายพันธุ์เชื้อราเงื่อนไขสำหรับการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส itsrdna สำหรับเพิ่มจำนวน 95 องศาเซลเซียสนาน 5 นาที 35 รอบ 94 องศาเซลเซียส45 , 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที กับ 45 72 C และสุดท้าย 72 C สำหรับ5 นาที ขนาดสินค้าประมาณ 575 BP ซึ่งเป็นมองเห็นได้ในเจล ( ร้อยละ 1.2 ) ภายใต้แสงยูวี ผลิตภัณฑ์ PCRของแต่ละแยกถูกแยกบริสุทธิ์ ( fermentas PCR โดยใช้ชุด ,ลิทัวเนีย ) ต่อให้โปรโตคอล ลำดับของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำโดยวิธีการของ dideoxy แซงเกอร์ใน 3730xl biosystem ประยุกต์ ( bioloink , นิวเดลี , อินเดีย )ลำดับของแต่ละแยกก็ต้องค้นหาระเบิด( http : / / wwwncbinlmgov / ระเบิด ) กับฐานข้อมูล ncbi [ 1 ]ลำดับทั้งหมด ชิดกับตัวแทนลำดับใน ncbi ฐานข้อมูลโดยใช้ clustal W [ 48 ] และ การจ้างเมก้า 52 ซอฟต์แวร์ การวิเคราะห์ชนิดของตำแหน่งแสดงด้วยวิธีความควรจะเป็นสูงสุดถ้าเป็น