The primer pairs were designed to h

The primer pairs were designed to have a
similar thermal melting temperature (Tm), to have minimal
base pairing interactions with other primers in the reaction,
and to yield products that differed from each other by
approximately 100 bp, which could be resolved by agarose
gel electrophoresis. The Tm estimations for the primers
shown in Table 2 were calculated based on nearestneighbor
thermodynamic parameters by the Primer Designer
5a software. The specificity of each of the 18 primers
was initially confirmed using BLASTN (nucleotide database
using a nucleotide query; http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/blast/Blast.cgi) and the GenBank sequence database.1
The PCR reaction mixtures contained 18 primers at a
concentration of 0.5 mmol each, 0.2 mmol deoxyribonucleotide
triphosphate mix,b 13 AmpliTaq Gold reaction
buffer II,c 5 mmol MgCl2, and 2.5 units of AmpliTaq Gold
polymerasec in a final volume of 20 ml. For convenience,
master mixes for 50 to 100 tubes containing all the
components of the PCR reaction except the Taq polymerase
and template DNA were prepared in advance. This
master mix was divided into tubes and dehydrated using a
Speed Vac concentrator.d Polymerase chain reaction tubes
prepared this way were stored at 220uC and were stable for
at least 1 year. Crude bacterial DNA template for PCR was
prepared by picking a single colony into 50 ml sterile
distilled H2O and heating at 95–100uC for 10 min.
Template DNA (19.5 ml) was used to reconstitute a
previously prepared PCR tube containing dehydrated
PCR reaction mix, and 2.5 units of AmpliTaq Goldc was
added. Polymerase chain reaction assays were done using a
Perkin-Elmer 2400 thermocycler with the following amplification
conditions: an initial denaturation at 94uC for
10 min, followed by 30 cycles of denaturation for 30 sec at
94uC, annealing at 55uC for 45 sec, and extension for
1.5 min at 72uC. The extension time was increased 3 sec
each cycle, and the final extension was 10 min at 72uC

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คู่รองพื้นถูกออกแบบให้มีการความร้อนคล้ายละลายอุณหภูมิ (Tm), ให้น้อยที่สุดฐานที่โต้ตอบกับไพรเมอร์อื่น ๆ ในปฏิกิริยา การจับคู่และให้ผลิตภัณฑ์ที่แตกต่างกันโดยประมาณ 100 bp ซึ่งสามารถแก้ไขได้ ด้วย agaroseเจ electrophoresis ประมาณ Tm สำหรับไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 2 คำนวณได้ตาม nearestneighborพารามิเตอร์ทางอุณหพลศาสตร์ โดยแบบรองพื้นซอฟต์แวร์ของ 5a Specificity ของไพรเมอร์ 18 แห่งได้เริ่มรับการยืนยันโดยใช้ BLASTN (ฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ใช้แบบสอบถามนิวคลีโอไทด์ http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast/Blast.cgi) และ database.1 ลำดับ GenBankน้ำยาผสมปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วยไพรเมอร์ที่ 18 ที่เป็นเข้มข้น 0.5 mmol ละ 0.2 mmol deoxyribonucleotideโนซีนไตรฟอสเฟตผสม บี 13 ทอง AmpliTaq ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ II, c 5 mmol MgCl2 และ 2.5 หน่วยทอง AmpliTaqpolymerasec ในปริมาตรสุดท้ายของ 20 ml เพื่อความสะดวกหลักการออกแบบผสมผสานสำหรับหลอด 50-100 ประกอบด้วยทั้งหมดพอลิเมอเรส Taq ยกเว้นคอมโพเนนต์ของปฏิกิริยา PCRและแม่แบบดีเอ็นเอได้เตรียมไว้ล่วงหน้า นี้ส่วนผสมหลักถูกแบ่งออกเป็นหลอด และอบแห้งโดยใช้การความเร็วในหลอดปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่ concentrator.d Vacเตรียมวิธีนี้ถูกเก็บไว้ที่ 220uC และมีความมั่นคงในน้อย 1 ปี ดิบดีเอ็นเอแม่แบบแบคทีเรียสำหรับ PCR ได้โดยรับโคโลนีเดี่ยวเป็น 50 ml ที่ผ่านการฆ่าเชื้อH2O กลั่นและความร้อนที่ 95 – 100uC สำหรับ 10 นาทีแม่แบบดีเอ็นเอ (19.5 มล) ถูกใช้เพื่อสร้างขื้นใหม่ก่อนหน้านี้ เตรียม PCR หลอดประกอบด้วยอบแห้งส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR และ 2.5 หน่วย AmpliTaq Goldcเพิ่ม Assays ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสทำโดยใช้การThermocycler เพอร์เอลเมอ 2400 มีขยายต่อไปนี้เงื่อนไข: denaturation เป็นครั้งแรกที่ 94uC สำหรับ10 นาที ตาม ด้วยวงจร 30 การ denaturation นาน 30 วินาทีที่94uC การอบเหนียวที่ 55uC ใน 45 วินาที และส่วนขยายสำหรับ1.5 นาทีที่ 72uC เวลาขยายได้เพิ่มขึ้น 3 วินาทีแต่ละวงจร และส่วนขยายสุดท้ายได้ 10 นาทีที่ 72uC

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คู่ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบให้มี
อุณหภูมิหลอมละลายด้วยความร้อนที่คล้ายกัน (TM) จะมีน้อยที่สุด
ปฏิสัมพันธ์ฐานเข้าคู่กับไพรอื่น ๆ ในการทำปฏิกิริยา,
และเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่แตกต่างไปจากคนอื่น ๆ โดย
ประมาณ 100 bp ซึ่งสามารถแก้ไขได้โดยการ agarose
เจล electrophoresis ประมาณการ Tm สำหรับไพรเมอร์
ที่แสดงในตารางที่ 2 ถูกคำนวณจาก nearestneighbor
พารามิเตอร์ทางอุณหพลศาสตร์โดยดีไซน์เนอร์ประถมศึกษา
ซอฟต์แวร์ 5a ความจำเพาะของแต่ละไพรเมอร์ 18
ได้รับการยืนยันในขั้นต้นโดยใช้ไทด์ (nucleotide ฐานข้อมูล
โดยใช้แบบสอบถามเบื่อหน่าย; http: //www.ncbi.nlm.nih.
gov / ระเบิด / Blast.cgi) และลำดับ GenBank database.1
PCR ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 18 ไพรเมอร์ที่
มีความเข้มข้นของ 0.5 mmol แต่ละ 0.2 mmol deoxyribonucleotide
ผสม triphosphate ข 13 AmpliTaq ปฏิกิริยาทอง
บัฟเฟอร์ครั้งที่สองค 5 mmol MgCl2 และ 2.5 หน่วย AmpliTaq ทอง
polymerasec ในเล่มสุดท้าย 20 มิลลิลิตร เพื่ออำนวยความสะดวก
ต้นแบบผสมสำหรับ 50-100 หลอดที่มีทุก
องค์ประกอบของปฏิกิริยา PCR ยกเว้น Taq polymerase
และแม่แบบดีเอ็นเอได้จัดทำขึ้นล่วงหน้า นี้
มาสเตอร์มิกซ์แบ่งออกเป็นหลอดและอบแห้งโดยใช้
ความเร็ว Vac concentrator.d Polymerase หลอดปฏิกิริยาลูกโซ่
เตรียมวิธีนี้ถูกเก็บไว้ที่ 220uC และมั่นคงสำหรับ
อย่างน้อย 1 ปี น้ำมันดิบแม่แบบดีเอ็นเอของแบคทีเรียสำหรับ PCR ได้รับการ
จัดทำขึ้นโดยการเลือกอาณานิคมเดียวใน 50 มลหมัน
H2O กลั่นและความร้อนที่ 95-100uC เวลา 10 นาที.
แม่แบบดีเอ็นเอ (19.5 ml) ถูกนำมาใช้ในการฟื้นฟู
หลอดที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ที่มี PCR แห้ง
ผสมปฏิกิริยา PCR, 2.5 หน่วย AmpliTaq Goldc ถูก
เพิ่ม polymerase การตรวจปฏิกิริยาลูกโซ่ได้กระทำโดยใช้
Perkin-Elmer 2400 เครื่อง thermocycler ที่มีการขยายต่อไปนี้
เงื่อนไข denaturation เริ่มต้นที่ 94uC สำหรับ
10 นาทีตามด้วย 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติสำหรับ 30 วินาทีที่
94uC, หลอมที่ 55uC สำหรับ 45 วินาทีและนามสกุล
1.5 นาทีที่ 72uC ขยายระยะเวลาเพิ่มขึ้น 3 วินาที
แต่ละรอบและขยายสุดท้ายคือ 10 นาทีที่ 72uC

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ไพรเมอร์คู่ถูกออกแบบมาให้มีอุณหภูมิหลอมเหลวความร้อนคล้าย
( TM ) ที่จะมีปฏิสัมพันธ์กับไพรเมอร์น้อยที่สุด
ฐานการจับคู่อื่น ๆในปฏิกิริยา
และผลผลิตผลิตภัณฑ์ที่แตกต่างจากแต่ละอื่น ๆโดย
ประมาณ 100 BP ซึ่งสามารถแก้ไขโดยโรส
เจล ซึ่งการด้วย
แสดงดังตารางที่ 2 ) คำนวณตาม nearestneighbor
อุณหพลศาสตร์พารามิเตอร์โดยไพรเมอร์ที่ออกแบบ
5a ซอฟต์แวร์ ความจำเพาะของแต่ละ 18 ชนิด
ตอนแรกยืนยันใช้ blastn ( ฐานข้อมูลลำดับเบสนิวคลีโอไทด์
โดยใช้แบบสอบถาม ; http : / / www.ncbi . nlm . nih gov .
/ ระเบิด / ระเบิด ซีจีไอ ) และขนาดลำดับฐานข้อมูล เพื่อตรวจหาสารผสมประกอบด้วย 1

18 ชนิด ที่ความเข้มข้น 0.5 มิลลิโมลแต่ละ , 0.2 มิลลิโมล deoxyribonucleotide
ไตรฟอสเฟตผสมB 13 amplitaq ทองปฏิกิริยา
บัฟเฟอร์ 2 , C 5 mmol MgCl2 และ 2.5 หน่วย amplitaq ทอง
polymerasec ในเล่มสุดท้ายของ 20 มล. เพื่อความสะดวก
อาจารย์ผสม 50 ถึง 100 หลอดที่มีส่วนประกอบทั้งหมดของปฏิกิริยา PCR
ยกเว้นแท็กโดย
และแม่แบบดีเอ็นเอถูกเตรียมไว้ล่วงหน้า นี้
อาจารย์ผสมแบ่งเป็นหลอดและแห้งโดยใช้ความเร็วต่ำสุด
หัว .การใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส หลอด D
เตรียมด้วยวิธีนี้ถูกเก็บไว้ที่ 220uc และมั่นคง
อย่างน้อย 1 ปี แม่แบบ DNA PCR คือ
ดิบแบคทีเรียเพื่อเตรียมโดยการเลือกกลุ่มเดียวใน 50 ml เป็นหมัน
กลั่น H2O และความร้อนที่ 95 - 100uc 10 นาที
แม่แบบดีเอ็นเอ ( 19.5 มิลลิลิตร ) ถูกใช้เพื่อเก็บเป็น

หลอดบรรจุแห้งที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ PCR เพื่อตรวจหาการผสม , และ 25 หน่วย amplitaq goldc คือ
เพิ่ม การใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส หรือ ทำโดยใช้
เพอร์กินเอลเมอร์ 2400 เทอร์มอไซเคล ์มีดังต่อไปนี้ (
เงื่อนไข : ( เริ่มต้นที่ 94uc สำหรับ
10 นาที ตามด้วย 30 รอบ ( 30 วินาทีที่
94uc annealing ที่ 55uc 45 วินาที และส่งเสริม
1.5 นาทีที่ 72uc . การขยายเวลาเพิ่มเป็น 3 วินาที
แต่ละรอบและส่วนขยายสุดท้าย 10 นาทีที่ 72uc