Healthy plants of oilseed rape (B.

Healthy plants of oilseed rape (B. napus) were collected in two
growing seasons (Nov. 2008 to May 2009 and Nov. 2009 to May
2010) grown in fields in Wuhan city, Hubei Province of central
China (30280N, 114210E). At each of the four growth stages (seedling, bolting, flowering and podding) in each season, five healthy
plants were carefully up-rooted using a spade, individually placed
in plastic bags and immediately taken to laboratory. The plants
were washed in tap water to remove soil particles on the roots
and the basal stems. Young leaves, the main stems and the taproots
were detached from each plant for fungal isolation.
The sampled leaves were cut into 3-cm squares, three leaves per
plant at each growth stage. The main stems and the taproots were
cut into 3-cm-long segments. The leaf pieces and the segments of
stems and roots were surface sterilized following the procedures
described by Hallmann et al. (2006), briefly in 70% ethanol (v/v)
for 1 min, then in 5% sodium hypochlorite (v/v) for 5 min, again
in a 70% ethanol for 30 s, and finally rinsed in sterile water 3 times
(3 min each). The surface-disinfected plant tissues were blotted
dry on sterilized filter paper. The ends of each stem and root segment were cut off using a sterile razor blade and the remaining
part of each segment was transversely cut to 2-mm-thick slices,
which were individually placed in Petri dishes (9 cm in diameter)
containing acidified potato dextrose agar (PDA), five slices per dish
and two dishes per plant. For the leaf samples, the margins of each
leaf piece were cut off and the central part was cut into 0.5-cm
squares, and placed on acidified PDA in Petri dishes, five pieces
per dish and two dishes for each leaf sample. The dishes with plant
tissues were incubated at 20 C and examined daily for fungal
growth for up to 4 weeks. The fungal colonies were individually
transferred to new PDA dishes, one colony per dish, and incubated
at 20 C. The resulting fungal cultures were purified by singlespore- or single-hypha-tip isolation. Finally, the pure cultures were
stored in 20% glycerol (v/v) at 80 C.
2.2. Identification and diversity analysis of the endophytic fungi
The endophytic fungi were incubated on PDA at 20 C in the
dark until the colonies reached the rim of the dishes (9 cm in diameter). Morphology of the colonies (color and mycelia) and spores
(conidia, blastospores, sporangiospores or ascospores) produced
by each fungal isolate was examined and used to determine the
taxonomic status of an isolate. Meanwhile, the internal transcribed
spacer (ITS) region of rDNA (ITS1-5.8S rDNA-ITS2) of each isolate
was amplified using the universal primers ITS1 (30-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-50) and ITS4 (30-TCCTCCGCTTATTGATATGC-50),
cloned and sequenced using the procedures described by Zhang
et al. (2010). The ITS sequence was compared with that of the most
closely-related fungal species (identity values higher than 95%) in
the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) using the BLAST
program, in consultation with observed colony and spore morphology to confirm the taxonomic status of the investigated fungal isolate. A few parameters including species proportion ( f ), species
richness (S), Shannon Shannon index of diversity (H0), Simpson’s
index (D) and Simpson diversity index (1–D) were used to describe
the population characteristics of the endophytic fungi in oilseed
rape. They were calculated using the following formula:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

พืชสุขภาพของ oilseed rape (เกิด napus) ถูกเก็บรวบรวมในสองเติบโตซีซั่น (2008 พฤศจิกายนอาจ 2009 และ 2009 พฤศจิกายนถึงพฤษภาคมเขตปลูกใน 2010) ในเมืองหวู่ฮั่น มณฑลหูเป่ย์จังหวัดกลางจีน (30 280N, 114 210E) ขั้น 4 การเจริญเติบโต (แหล่ง bolting เวอร์ริ่ง และ podding) แต่ละฤดูกาล ห้าสุขภาพพืชได้อย่างรอบคอบขึ้นรากใช้ไพ่โพดำ แยกกันอยู่ในถุงพลาสติก และทันทีนำไปปฏิบัติ พืชถูกล้างในน้ำประปาเพื่อเอาอนุภาคดินรากฐานและลำต้นโรค หนุ่มใบ ลำต้นหลัก และสหภาพการได้จากแต่ละโรงงานสำหรับแยกเชื้อราตัวอย่างใบถูกตัดเป็นสี่เหลี่ยม 3 ซม. สามใบต่อพืชในแต่ละระยะการเจริญเติบโต มีลำต้นหลักและการสหภาพตัดเป็นเซ็กเมนต์ยาว 3 ซม. ชิ้นส่วนใบและส่วนของลำต้นและรากอยู่ผิว sterilized ตอนอธิบายสั้น ๆ โดย Hallmann et al. (2006), ในเอทานอล 70% (v/v)ใน 1 นาที ใน 5% โซเดียมไฮโป (v/v) ใน 5 นาที อีกแล้วในเอทานอล 70% 30 s และสุดท้าย rinsed ในกระบอกน้ำ 3 ครั้ง(3 นาทีละ) เนื้อเยื่อพืชฆ่าเชื้อโรคสำหรับพื้นผิวที่ blottedกระดาษกรอง sterilized แห้ง ปลายของแต่ละกลุ่มก้านและรากถูกตัดโดยใช้ใบมีดโกนใส่และเหลือส่วนของแต่ละกลุ่มถูกตัดให้ชิ้นหนา 2 มม. transverselyซึ่งแต่ละรายการไว้ในจาน Petri (เส้นผ่านศูนย์กลาง 9 เซนติเมตร)ประกอบด้วยมันฝรั่ง acidified ขึ้น agar (PDA), ห้าชิ้นต่อจานและอาหารสองต่อพืช ตัวอย่างใบ ระยะขอบของแต่ละชิ้นส่วนใบถูกตัดออก และส่วนที่ตัดไป 0.5 ซม.สี่เหลี่ยม และ PDA acidified วางบนใน Petri อาหาร ห้าชิ้นต่อจานและจานที่สองสำหรับแต่ละตัวอย่างใบไม้ อาหารกับพืชเนื้อเยื่อ incubated ที่ 20 C และตรวจสอบทุกวันสำหรับเชื้อราเจริญเติบโตถึง 4 สัปดาห์ มีอาณานิคมเชื้อราแต่ละโอนย้ายไปที่ ใหม่ PDA อาหาร ฝูงหนึ่งต่อจาน และ incubatedที่ 20 เซลเซียส วัฒนธรรมเชื้อราเกิดได้บริสุทธิ์ โดยแยก singlespore - หรือเดี่ยว-hypha-คำแนะนำ วัฒนธรรมบริสุทธิ์ถูกที่สุดเก็บอยู่ใน 20% กลีเซอร (v/v) ที่ค. 802.2 วิเคราะห์รหัสและความหลากหลายของเชื้อรา endophyticเชื้อรา endophytic มี incubated บน PDA ที่ 20 C ในการสีเข้มจนอาณานิคมหมายถึงริมอาหาร (เส้นผ่านศูนย์กลาง 9 เซนติเมตร) สัณฐานวิทยาของอาณานิคม (สีและ mycelia) และเพาะเฟิร์น(conidia, blastospores, sporangiospores หรือ ascospores) ผลิตโดยแต่ละแยกเชื้อราถูกตรวจสอบ และใช้การสถานะอนุกรมวิธานของการแยก ในขณะเดียวกัน ภายในทับศัพท์ภูมิภาคเป็นตัวเว้นวรรค (ของ) ของ rDNA (ITS1-5.8S rDNA ITS2) ของแต่ละแยกถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากล ITS1 (30-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-50) และ ITS4 (30-TCCTCCGCTTATTGATATGC-50),โคลน และตามลำดับโดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ โดยเตียวal. ร้อยเอ็ด (2010) ลำดับของถูกเมื่อเทียบกับที่มากที่สุดที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเชื้อราสายพันธุ์ (ค่าตัวสูงกว่า 95%) ในNCBI ฐานข้อมูล (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ใช้การระเบิดโปรแกรม ให้คำปรึกษากับอาณานิคมสังเกตสปอร์สัณฐานวิทยาอนุกรมวิธานสถานะของการ investigated เชื้อรายืนยันแยก บางพารามิเตอร์รวมทั้งสัดส่วนพันธุ์ (f), สายพันธุ์ร่ำรวย (S), แชนนอนแชนนอนดัชนีของความหลากหลาย (H0), ซิมป์สันของดัชนี (D) และดัชนีความหลากหลายของซิมป์สัน (1 – D) ถูกใช้เพื่ออธิบายลักษณะประชากรของเชื้อรา endophytic oilseedข่มขืน พวกเขามีคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พืชที่มีสุขภาพดีของการข่มขืน oilseed (B. napus)
ถูกเก็บไว้ในสองฤดูกาลที่กำลังเติบโต(พฤศจิกายน 2008 ถึงเดือนพฤษภาคม 2009 และพฤศจิกายน 2009 ถึงเดือนพฤษภาคม
2010)
ที่ปลูกในทุ่งในเมืองหวู่ฮั่นมณฑลหูเป่ยภาคกลางของประเทศจีน(30 280N 114? 210E) ในแต่ละขั้นตอนของการเจริญเติบโตของสี่ (ต้นกล้า, bolting ดอกและ podding)
ในแต่ละฤดูกาลที่ดีต่อสุขภาพห้าพืชอย่างระมัดระวังขึ้นที่หยั่งรากใช้จอบที่วางไว้เป็นรายบุคคลในถุงพลาสติกและนำไปยังห้องปฏิบัติการทันที
พืชที่ถูกล้างในน้ำประปาที่จะเอาอนุภาคของดินในรากและลำต้นฐาน ใบอ่อน, ลำต้นหลักและ taproots ถูกถอดออกจากแต่ละโรงงานการแยกเชื้อรา. ใบตัวอย่างถูกตัดเป็นสี่เหลี่ยม 3 ซมสามใบต่อพืชในแต่ละขั้นตอนการเจริญเติบโต ลำต้นหลักและ taproots ถูกตัดออกเป็นกลุ่ม3 ซม. ยาว ชิ้นส่วนใบและส่วนของลำต้นและรากถูกพื้นผิวที่ผ่านการฆ่าเชื้อต่อไปนี้ขั้นตอนการอธิบายโดยHallmann et al, (2006), เวลาสั้น ๆ ในเอทานอล 70% (v / v) เป็นเวลา 1 นาทีจากนั้นใน 5% โซเดียมไฮโปคลอไรต์ (v / v) เป็นเวลา 5 นาทีอีกครั้งในเอทานอล70% เป็นเวลา 30 วินาทีและล้างในที่สุดน้ำหมัน 3 ครั้ง(3 นาทีในแต่ละครั้ง) พื้นผิวฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืชถูกเปื้อนแห้งบนกระดาษกรองผ่านการฆ่าเชื้อ ปลายของแต่ละลำต้นและส่วนรากถูกตัดออกโดยใช้ใบมีดโกนผ่านการฆ่าเชื้อและที่เหลืออีกส่วนหนึ่งของแต่ละส่วนถูกตัดตามขวางเพื่อชิ้น 2 มมหนาซึ่งถูกวางไว้เป็นรายบุคคลในจานเลี้ยงเชื้อ(9 ซม. ในเส้นผ่าศูนย์กลาง) ที่มีมันฝรั่งกรด วุ้นเดกซ์โทรส (PDA) ห้าชิ้นต่อจานและสองจานต่อต้น สำหรับตัวอย่างใบขอบของแต่ละชิ้นส่วนใบที่ถูกตัดออกและภาคกลางที่ถูกตัดเป็น 0.5 ซมสี่เหลี่ยมและวางไว้บนPDA กรดในอาหารเลี้ยงเชื้อ, ห้าชิ้นต่อจานสองจานและตัวอย่างแต่ละใบ อาหารที่มีพืชที่เนื้อเยื่อถูกบ่มที่ 20 องศาเซลเซียสและตรวจสอบรายวันสำหรับเชื้อราเจริญเติบโตได้ถึง4 สัปดาห์ อาณานิคมของเชื้อราเป็นรายบุคคลที่ถูกถ่ายโอนไปยังอาหาร PDA ใหม่หนึ่งอาณานิคมต่อจานและบ่มที่20 องศาเซลเซียส ส่งผลให้วัฒนธรรมถูกเชื้อราบริสุทธิ์โดย singlespore- หรือแยกเดี่ยว hypha ปลาย ในที่สุดเชื้อบริสุทธิ์ที่ถูกเก็บไว้ในกลีเซอรีน 20% (v / v) ที่? 80? C. 2.2 การระบุและการวิเคราะห์ความหลากหลายของเชื้อราเอนโดไฟท์เชื้อราเอนโดไฟท์ถูกบ่มบน PDA ที่ 20 องศาเซลเซียสในที่มืดจนอาณานิคมถึงขอบจาน(9 ซม. ในเส้นผ่าศูนย์กลาง) ทางสัณฐานวิทยาของอาณานิคม (สีและเส้นใย) และสปอร์(สปอร์, blastospores, ปอร์หรือ ascospores) ผลิตโดยแต่ละแยกเชื้อราได้รับการตรวจสอบและใช้ในการตรวจสอบสถานะการจัดหมวดหมู่ของการแยก ในขณะที่ถ่ายภายในspacer (ITS) พื้นที่ของ rDNA (ITS1-5.8S-ITS2 rDNA) ของแต่ละแยกถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากลITS1 (30 TCCGTAGGTGAACCTGCGG-50) และ ITS4 (30 TCCTCCGCTTATTGATATGC-50), โคลนและ ลำดับขั้นตอนโดยใช้วิธีการอธิบายโดย Zhang et al, (2010) ลำดับอยเมื่อเทียบกับที่ของมากที่สุดอย่างใกล้ชิดที่เกี่ยวข้องกับสายพันธุ์ของเชื้อรา (ตัวตนค่าสูงกว่า 95%) ในฐานข้อมูลNCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) โดยใช้ระเบิดโปรแกรมในการปรึกษาหารือกับอาณานิคมสังเกตและสัณฐานวิทยาของสปอร์เพื่อยืนยันสถานะการจัดหมวดหมู่ของการตรวจสอบแยกเชื้อรา พารามิเตอร์ไม่กี่รวมถึงสัดส่วนชนิด (ฉ) ชนิดความร่ำรวย(S) ดัชนี Shannon แชนนอนของความหลากหลาย (H0) ซิมป์สันดัชนี(D) และดัชนีความหลากหลายซิมป์สัน (1-D) ถูกนำมาใช้เพื่ออธิบายลักษณะประชากรของเชื้อราเอนโดไฟท์ใน oilseed ข่มขืน พวกเขาได้รับการคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สุขภาพพืช oilseed rape ( ของบี napus ) ถูกเก็บในฤดูปลูกที่ 2
( พ.ย. 2551 ถึงพฤศจิกายน 2552 ถึง พฤษภาคม 2552 และ
2010 ) ที่ปลูกในทุ่งนาในเมืองหวู่ฮั่น , หูเป่ย์จังหวัดภาคกลาง
จีน ( 30  280n 114  210e ) ในแต่ละสี่ขั้นตอนการเจริญเติบโต ( ต้นกล้า , bolting ออกดอก และ podding ) ในแต่ละฤดูกาล พืชให้ดีขึ้นสุขภาพ
5 ราก ใช้จอบที่วางไว้
เป็นรายบุคคลในถุงพลาสติก และทันทีที่ถ่ายในห้องปฏิบัติการ พืช
ถูกล้างในน้ำเพื่อเอาอนุภาคดินที่รากและลำต้น (
. ใบเล็ก ลำต้นหลักและรากแก้ว
ถูกแยกออกจากแต่ละโรงงานสำหรับเชื้อราที่แยก .
ตัวอย่างใบตัดเป็นสี่เหลี่ยม 3-cm สามใบต่อ
พืชในแต่ละช่วงการเจริญเติบโต ลำต้นหลักและรากแก้วเป็น
ตัดเป็น 3-cm-long เซ็กเมนต์ ชิ้น ส่วนของใบและลำต้น และรากก็ฆ่าเชื้อที่ผิว

ตามขั้นตอนที่อธิบายโดย hallmann et al . ( 2006 ) , ในเวลาสั้น ๆ 70% เอทานอล ( v / v )
1 นาที แล้วใน 5 % โซเดียมไฮโปคลอไรต์ ( v / v ) เป็นเวลา 5 นาที อีกครั้ง
ใน 70% เอทานอลสำหรับ 30 วินาที และสุดท้าย ล้างฆ่าเชื้อในน้ำ 3 ครั้ง
( 3 นาทีแต่ละครั้ง ) ผิวฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืชที่เปื้อน
แห้งฆ่าเชื้อเครื่องกรองกระดาษ ส่วนปลายของลำต้นและรากแต่ละถูกตัดด้วยใบมีดที่เป็นหมัน และอีกส่วนหนึ่งของแต่ละกลุ่มได้

2-mm-thick ตามขวางตัดกับชิ้นที่เป็นแบบวางในจานเลี้ยงเชื้อ ( 9 เซนติเมตร )
ที่มีปรับอาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextrose agar ( PDA ) , 5 ชิ้นต่อจาน
2 จานต่อ พืช สำหรับตัวอย่างใบ ระยะขอบของแต่ละ
แผ่นใบถูกตัดส่วนกลางถูกตัดเป็นสี่เหลี่ยม 0.5-cm
และวางไว้บน PDA ที่ปรับในจานเลี้ยงเชื้อ , 5 ชิ้นต่อจาน 2 จาน
และแต่ละใบตัวอย่าง อาหารกับเนื้อเยื่อพืช
อุณหภูมิ 20  C และตรวจสอบรายวันสำหรับเชื้อรา
นานถึง 4 สัปดาห์ อาณานิคมของนักเรียนรายบุคคล
โอนไปยังจาน PDA ใหม่ อาณานิคมต่อจาน และบ่ม
ที่ 20  C ที่เกิดเชื้อราวัฒนธรรมมีความบริสุทธิ์โดย singlespore - หรือแยกปลายไฮฟาเดี่ยว ในที่สุด วัฒนธรรมที่บริสุทธิ์เป็น
เก็บไว้ใน 20 % กลีเซอรอล ( v / v ) ที่  80  C .
2.2 . การจำแนกและวิเคราะห์ความหลากหลายของราเอนโดไฟท์ที่แยกราเอนโดไฟท์ที่แยก )
) บนอาหาร PDA ที่ 20  C
มืดจนอาณานิคมถึงขอบของจาน ( 9 เซนติเมตร )ลักษณะของอาณานิคม ( สีและเส้นใยและสปอร์ ( โคนิ blastospores
, ,
sporangiospores หรือ ascospores ) ผลิตโดยเชื้อราที่แยกแต่ละระดับและใช้ในการตรวจสอบสถานะทางอนุกรมวิธานของ
ไอโซเลท ขณะเดียวกัน ภายในภูมิภาคและ
spacer ( ITS ) ของ rDNA ( its1-5.8s rdna-its2 ) ของแต่ละแยก
คือการขยายการใช้สากล its1 PCR ( 30-tccgtaggtgaacctgcgg-50 ) และ its4 ( 30-tcctccgcttattgatatgc-50 )
สามารถใช้ขั้นตอนนี้อธิบายโดยจาง
et al . ( 2010 ) ลำดับของมันเมื่อเทียบกับที่ของที่สุด
เชื้อราชนิดที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด ( ค่าสูงกว่า 95% ตัว )
ncbi ฐานข้อมูล ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) โดยใช้โปรแกรมระเบิด
,ในการปรึกษาหารือกับสังเกตอาณานิคมและสัณฐานวิทยาสปอร์เพื่อยืนยันสถานะทางอนุกรมวิธานของเชื้อราที่แยกได้ . ไม่กี่ตัวแปรต่างๆ ชนิด สัดส่วน ( F ) , ชนิด
ความร่ำรวย ( s ) , แชนน่อน แชนนอนดัชนีความหลากหลาย ( H0 ) ดัชนีซิมป์สัน
( D ) และซิมป์สันดัชนีความหลากหลาย ( 1 ) D ) ถูกใช้เพื่ออธิบาย
ประชากรลักษณะของเชื้อราเอนโดไฟท์ในการข่มขืน oilseed
.พวกเขากำลังคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้ :