Polymerase chain reaction (PCR) amp

Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the 16S–23S
rDNA gene from the 3 selected bacterial isolates was performed as
described by Mehnaz et al. (2001, 2010). Pure colonies of the bacteria
were inoculated in LB broth, and after overnight growth at
24 °C on a rotary shaker, DNA was isolated from the cultures
using the Gen Elute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma-Aldrich,
USA). The DNA was dissolved in 100 L of TE buffer and used as a
template for PCR reactions. Each reaction mixture (50 L) contained
0.5 L of Taq DNA polymerase (5 U/L), 5 L of 10× PCR buffer, 2.5 L
of MgCl2 (50 mmol/L),1 L dNTPs (10 mmol/L), 2 L (10 mol/L) of
each primer (primer FGPS4-281: AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG;
primer FGPS1509-153: AAG GAGGTG ATC CAG CCG CA; (Normand
1995)), 35 L of filter-sterilized Milli-Q water, and 2 L of template
DNA. After denaturation of the template at 95 °C for 5 min, 30
rounds of temperature cycling (94 °C for 1 min, 55 °C for 1 min,
and 72 °C for 1 min) were followed by incubation at 72 °C for 7 min.
The PCR products were resolved on 1% agarose gel at 100 V, stained
with Red Safe nucleic acid stain solution (20 000×) (5 L/100 mL),
and photographed and analysed using gel documentation system
(Alpha Innotech Corporation, San Leandro, California). The PCR
products were purified by using a QIAquick PCR purification kit
(QIAGEN), cloned in Promega pGEM-T Easy Vector, and sequenced
on the Applied Biosystems 3730 Analyzer (Foster City, California,
USA) at Roberts’ Research Institute (London, Ontario, Canada).
The sequences were deposited in the NCBI GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

พอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ขยายของ 16S – 23Sทำยีน rDNA จาก 3 เลือกเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้เป็นอธิบายโดย Mehnaz et al. (2001, 2010) อาณานิคมของแบคทีเรียบริสุทธิ์มี inoculated ในซุปปอนด์ และค้างคืนอัตราการเติบโต24 ° C ในเชคเกอร์โรตารี่ ดีเอ็นเอแยกต่างหากจากวัฒนธรรมใช้ชุด Gen Elute แบคทีเรีย Genomic DNA (ซิก-Aldrichสหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอถูกละลายในบัฟเฟอร์ TE 100 ลิตร และใช้เป็นแม่แบบสำหรับปฏิกิริยา PCR แต่ละปฏิกิริยาส่วนผสม (50 L) อยู่L 0.5 ของ Taq DNA พอลิเมอเรส (5 U / L), L 5 10 × PCR บัฟเฟอร์ 2.5 Lของ MgCl2 (50 mmol/L), 1 L dNTPs (10 mmol/L), 2 L (10 โมล/L) ของแต่ละสีรองพื้น (พื้น FGPS4-281: ตู้ GTTTGA TCC TGG CTC AGรองพื้น FGPS1509-153: เอเอจี GAGGTG ATC CAG CCG CA (Normand1995)), sterilized กรอง Q น้ำ 35 ลิตร และ 2 ลิตรของแม่ดีเอ็นเอ หลังจาก denaturation แบบที่ 95 ° C สำหรับ 5 นาที 30ปัดเศษของอุณหภูมิ (94 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 55 ° C สำหรับ 1 นาที ขี่จักรยานและ 72 องศาเซลเซียสใน 1 นาที) ตามคณะทันตแพทยศาสตร์ที่ 72 ° C สำหรับ 7 minผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการแก้ไขบน 1% agarose เจล 100 V สีกับกรดนิวคลีอิกแดงปลอดภัยติดโซลูชัน (20 000 ×) (5 L/100 มล.),ถ่ายภาพ และใช้ระบบเอกสารเจ analysed(อัลฟา Innotech Corporation แคลิฟอร์เนีย ซาน Leandro) การ PCRผลิตภัณฑ์ที่บริสุทธิ์ โดยใช้ชุดฟอก QIAquick PCR(QIAGEN), โคลนใน Promega pGEM-T เวกเตอร์ง่าย และเรียงลำดับในตัววิเคราะห์ Biosystems ใช้ 3730 (ฟอสเตอร์ซิตี้ แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) ที่ สถาบันวิจัยของโรเบิตส์ (ลอนดอน Ontario ประเทศแคนาดา)ลำดับที่ได้ฝากในฐานข้อมูล NCBI GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) ขยายของ 16S-23S
ยีน rDNA จาก 3
เลือกแบคทีเรียได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยMehnaz et al, (2001, 2010) อาณานิคมบริสุทธิ์ของแบคทีเรียถูกเชื้อในน้ำซุป LB และหลังจากที่การเจริญเติบโตค้างคืนที่ 24 ° C ในเครื่องปั่นหมุนดีเอ็นเอที่แยกได้จากวัฒนธรรมการใช้Gen ชะแบคทีเรียชุดดีเอ็นเอจีโนม (Sigma-Aldrich, สหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอถูกละลายใน 100 L ของบัฟเฟอร์ TE และใช้เป็นแม่แบบสำหรับปฏิกิริยาPCR แต่ละผสมปฏิกิริยา (50 ลิตร) ที่มีอยู่0.5? L ของดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq (5 U /? L), 5? L 10 ×บัฟเฟอร์ PCR 2.5? L ของ MgCl2 (50 มิลลิโมล / ลิตร), 1 L dNTPs ( 10 มิลลิโมล / ลิตร), 2 ลิตร (10 โมล / ลิตร)? แต่ละไพรเมอร์ (ไพรเมอร์ FGPS4-281: AGA GTTTGA ทีซีซีเอจี CTC TGG; ไพรเมอร์ FGPS1509-153: AAG GAGGTG ATC CAG CCG CA (ปรกติ1995)) 35? ลิตรกรองฆ่าเชื้อน้ำ Milli-Q และ 2 ลิตรแม่แบบของดีเอ็นเอ หลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติของแม่แบบที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 30 รอบของวัฏจักรอุณหภูมิ (94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 55 ° C เป็นเวลา 1 นาทีและ72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที) ตามมาด้วยการบ่มที่ 72 องศาเซลเซียส 7 นาที. ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการแก้ไขในวันที่ 1% เจล agarose ที่ 100 V, สีแดงแก้ปัญหาคราบกรดนิวคลีอิกที่ปลอดภัย(20 000 ×) (5? L / 100 มิลลิลิตร) และถ่ายภาพและวิเคราะห์การใช้ระบบเอกสารเจล(อัลฟา Innotech คอร์ปอเรชั่นซานลีอันโดร, แคลิฟอร์เนีย) PCR ผลิตภัณฑ์ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดฟอก PCR QIAquick (QIAGEN) โคลนใน Promega pGEM-T ง่ายเวกเตอร์และติดใจในแอพพลายด์3730 วิเคราะห์ (ฟอสเตอร์ซิตี้รัฐแคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) ที่โรเบิร์ต Research Institute (ลอนดอน แคนาดา). ลำดับที่ถูกฝากไว้ในฐานข้อมูล NCBI GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) การเพิ่มปริมาณของยีน 16S rDNA และ 23s
3 เลือกจากเชื้อที่แยกได้คือการปฏิบัติ
อธิบายโดย mehnaz et al . ( พ.ศ. 2553 ) บริสุทธิ์โคโลนีของแบคทีเรีย
ปลูกเชื้อในน้ำซุปปอนด์ หลังจากคืนที่ 24 ° C
การเจริญเติบโตในเครื่องปั่น rotary ดีเอ็นเอที่แยกได้จากวัฒนธรรม
ใช้ Gen elute ดีเอ็นเอแบคทีเรีย Kit ( ซิกม่า Aldrich
สหรัฐอเมริกา )ดีเอ็นเอที่ถูกละลายใน 100  l TE บัฟเฟอร์และใช้เป็น
แม่แบบสำหรับปฏิกิริยา PCR แต่ละปฏิกิริยาผสม ( 50  L ) มี 
0.5 ลิตรดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( 5 U /  L ) 5  ชั้น 10 เฟอร์ PCR × 2.5  L
ไอโซโทป ( 50 มิลลิโมล / ลิตร ) 1  ผม dntps ( 10 mmol / L ) , 2  L ( 10  mol / L )
( ไพรเมอร์รองพื้นแต่ละ fgps4-281 : aga gtttga TCC tgg CTC AG ;
รองพื้น fgps1509-153 : อ๊า gaggtg ATC และ ccg CA ; ( นอร์แมนด์
1995 ) )35  ลิตรกรองน้ำฆ่าเชื้อ milli-q และ 2  L ของดีเอ็นเอแม่แบบ

หลังจากการหยุดชั่วคราวของแม่แบบที่ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที 30
รอบจักรยานอุณหภูมิ ( 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 55 ° C เป็นเวลา 1 นาที 72 ° C
1 นาที ) ตามด้วยการบ่มที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที ซึ่งสินค้าถูกแก้ไขบน
โรส 1 เปอร์เซ็นต์ เจลที่ 100 V ,
สีแดงเปื้อนคราบปลอดภัยกรดนิวคลีอิก โซลูชั่น ( 20 000 × ) ( 5  L / 100 ml )
และถ่ายภาพและวิเคราะห์ข้อมูลการใช้ระบบเอกสารเจล
( อัลฟ่าอินโนเทค บริษัท ซาน ลีอันโดร , แคลิฟอร์เนีย ) ผลิตภัณฑ์ PCR
มีความบริสุทธิ์โดยการใช้เชื้อบริสุทธิ์ qiaquick ชุด
( เพิ่ม ) , โคลนใน promega pgem-t ง่ายเวกเตอร์และลำดับ
บน Applied Biosystems 940 Analyzer ( Foster City , California ,
USA ) ที่สถาบันวิจัยโรเบิร์ต ( ลอนดอน ออนตาริโอ , แคนาดา )
ขั้นตอนฝากเงินใน ncbi ขนาดฐานข้อมูล