ConclusionIn conclusion we report i

Conclusion
In conclusion we report isolation of an endophytic fungus capable
of producing capsaicin upto three generations, which may find
application as an alternative source for its large scale production.
Upscaling of the fermentation broth resulted in the isolation of
compounds 2 and 3, of which 3 was found new to the literature.
Notably, we present an approach employing a fast and sensitive
(MRM) LC-ESI-MS/MS method for the separation and quantification
of capsaicin and compound 3. The developed multimode
procedure can easily be utilized as analytical tool for analysis of
1 and 3 in the presence of other possible constituents. Compound
3 displayed significant anti-proliferative activity against different
human cancer cell lines and was found to induce apoptosis evidenced
by Hoechst staining and loss of mitochondrial membrane
potential. Further studies are underway to optimize conditions
for large scale production of capsaicin and isolate other metabolites
from this fungus. Additional studies on 3 are aimed at carrying
out structural modifications to optimize its activity and elucidating
more details of its molecular mode of action.
Experimental
General experimental procedures
1H and 13C NMR spectra in DMSO-d6 were recorded on 400 MHz
spectrometers with TMS as an internal standard. Chemical shifts
are expressed in parts per million (d ppm); J values are given in
Hertz. Reagents and solvents used were mostly AR grade. Silica
gel coated aluminum plates were used for TLC. HRMS were recorded
on UHD LC/MS Q-TOF. RPMI-1640, 3-(4,5-dimethylthiazole-
2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Rhodamine
123, penicillin-G, Fetal calf serum (FCS), Phosphate buffer saline
(PBS), citric acid, streptomycin, L-glutamine, Hoechst-33258, and
pyruvic acid were all high-quality analytical and molecular biology
grade.
Plant materials and sampling
Mature fruits of a healthy and symptomless one year old plant
of C. annum (Family: Solanaceae) were collected from Jammu (32
430 5800 N, 74 480 3200 E), India. Fruit samples were taken to laboratory
in an icebox, stored in sterilized polybags at 4 C and processed
within 24 h of collection.
Isolation and maintenance of endophytic fungus
To eliminate the epiphytic microbes, the fruit samples of C.
annum were first washed with tap water and processed for isolation
of endophytic fungi. The samples were washed thrice with
autoclaved distilled water and further surface sterilized by consecutive
treatment with 70% ethanol for 1 min, 1% sodium hypochlorite
(NaOCl) for 90 s, after each treatment sample was rinsed with
sterile distilled water. The wet samples were placed on sterilized
filter paper to eliminate the extra moisture. Surface sterilized
sample was cut into 3  3 mm pieces using sterilized surgical
blades and placed on petridishes containing three different media,
potato dextrose agar (Infusion from potatoes 200 g L1, dextrose
20.0 g L1, agar 15.0 g L1) pH 5.6 ± 0.2, yeast malt agar, (yeast extract
4.0 g L1, malt extract 10.0 g L1, glucose 4.0 g L1) 5.5 ± 0.2
and water agar medium (2% Agar w/v) in petridishes (90 mm in
diameter). To avoid the bacterial growth each media was supplemented
with 200 lg/ml streptomycin sulfate. The petridishes were
incubated at 28 C for 3–15 days until the mycelium appeared from
the inoculated sample. The hyphal growth was picked from sample
inoculated on water agar, transferred to potato dextrose agar media
and incubated at 28 C to obtain a pure culture. For long term
preservation the pure endophytic fungal isolate was stored at
4 C (lyophilized) and 80 C in 10% (v/v) glycerol, documented
with accession number MRCJ-10 in the institutional microbial
repository.
DNA extraction, PCR amplification and sequencing of fungal ITS1-5.8SITS2
region
The genomic DNA was extracted by using ZR Fungal/Bacterial
DNA MiniPrep™ kit according to manufacturer’s protocol. The
quality and quantity of genomic DNA was checked by NanoDrop
2000. PCR amplification of ITS1-5.8S rDNA-ITS2 regions was performed
using universal primers ITS5: 50-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-
30 and ITS4: 50-TCCTCCGCTTATTGATATGC-30 (White et al.,
1990). PCR amplification was performed in a 50 ll reaction volume
with 25 ll of PCR Master Mix Promega Corp., Madison, WI), 2.50 ll
of 10 lM each primer, 3 ll of fungal genomic DNA (100 ng) and
17 ll molecular biology grade water. The thermal cycling program
were as follows: initial denaturation 95 C for 5 min; 35 cycles of
30 s at 95 C, 45 s at 56 C, and 60 s at 72 C; and a final extension
of 10 min at 72 C. The PCR product was cleaned with UltraClean™
PCR Clean-up DNA purification kit according to manufacturer’s
protocol.
Phylogenetic analysis of endophytic fungus
The amplified ITS region was sequenced in both directions by
ABI 377 DNA sequencer using the Big Dye Terminator v3.1 cycle
sequencing kit, following manufacturer’s instruction. To identify
the endophytic fungus, the sequences obtained were used as query
sequence for similarity search by using BLAST algorithm against
the database maintained at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
and the FC-46 strain was taxonomic designated as Alternaria alternata.
The ITS1-5.8S rDNA-ITS2 sequence of FC-46 isolate was
aligned with the most similar reference sequences of the taxa by
using the CLUSTAL W program. A phylogenetic tree was constructed
using software MEGA5 (Tamura et al., 2011), subsequently
analyzed for evolutionary distances by the neighbor
joining method. The robustness of clades was estimated by bootstrap
analysis with 1000 replications. The contiguous rDNA sequences
of the representative isolate was submitted to GenBank
database using SEQUIN program with accession no. KC989106.
Cultivation, fermentation and preparation of extracts
An inoculum of A. alternata was prepared in Erlenmeyer flasks
(500 ml) with potato dextrose broth (PDB) media (150 ml) incubated
for 5 days in shaking (150 rpm) at 28 C. Batch fermentation
was performed in Erlenmeyer flasks (1L) on PDB, pH 5.5. Each flask
containing 300 ml broth was inoculated with 10 percent of inoculum
prepared and incubated at 28 C in dark with shaking at
200 rpm for 7 days. After completion of batch fermentation the
broth was harvested and further processed for preparation of extracts
following the National Cancer Institute’s protocol (McCloud,
2010) i.e., homogenized whole broth was transferred to a separating
funnel with an equal volume of DCM. Following shaking and
separation of layers, the DCM phase was withdrawn, the organic
solvent removed by rotary evaporation. The organic extract was
then subjected to column chromatography on silica gel with ethyl
acetate:hexane (10:90) as eluents.
Alternariol-10-methyl ether (3). Colorless solid, IR (neat) tmax
3400.86, 1658.39 cm1. HRESIMS (m/z) 273.0756 [M+H]+ (calcd
for [C15H12O5]+ 273.0685).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทสรุปเบียดเบียน เรารายงานการแยกเชื้อรา endophytic มีความสามารถในการการผลิตแคปไซซินสำหรับรุ่นสาม ซึ่งอาจพบโปรแกรมประยุกต์อื่นเป็นการผลิตขนาดใหญ่Upscaling ของซุปหมักให้โดดเดี่ยวสาร 2 และ 3 ที่ 3 พบใหม่วรรณคดียวด เรานำเสนอวิธีการใช้อย่างรวดเร็วและตรงตาม(MRM) LC-ESI-MS/MS วิธีแยกและนับแคปไซซินและผสม 3 Multimode พัฒนาขั้นตอนง่าย ๆ นำไปใช้เป็นเครื่องมือวิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์ของ1 และ 3 ในต่อหน้าของ constituents อื่น ๆ ได้ ผสม3 แสดงกิจกรรมสำคัญป้องกัน proliferative ต้นกับแตกต่างกันเซลล์มะเร็งของมนุษย์บรรทัด และพบเพื่อก่อให้เกิด apoptosis เป็นหลักฐานโดยย้อมสีอย่างไร Hoechst และสูญเสียเยื่อ mitochondrialศักยภาพ ศึกษาเพิ่มเติมอยู่ในระหว่างดำเนินการ ปรับสภาพสำหรับการผลิตขนาดใหญ่ของแคปไซซิน และแยกอื่น ๆ metabolitesจากเชื้อรานี้ ศึกษาเพิ่มเติมใน 3 มุ่งเน้นไปที่การถือครองออกปรับเปลี่ยนโครงสร้างเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของกิจกรรม และ elucidatingรายละเอียดของวิธีการดำเนินการของโมเลกุลทดลองขั้นตอนการทดลองทั่วไปบันทึกในความเร็ว 400 เมกะเฮิรตซ์แรมสเป็คตรา NMR 1H และ 13C ใน DMSO d6ตรวจ ด้วย TMS เป็นการภายใน กะเคมีแสดงในส่วนต่อล้าน (d ppm); J ค่าแสดงไว้ในเฮิรตซ์ Reagents และหรือสารทำละลายที่ใช้ได้ส่วนใหญ่ AR เกรด ซิลิก้าเจที่ใช้แผ่นเคลือบอลูมิเนียมสำหรับ TLC บันทึกสาขาใน Q UHD LC/MS-TOF RPMI 1640, 3- (4,5 - dimethylthiazole -2 yl) โบรไมด์ - 2, 5 - diphenyltetrazolium (MTT), Rhodamine123 ลูกยาเพนนิซิลลิน G ครรภ์เซรั่ม (FCS), น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์(PBS), กรดซิตริก streptomycin, L glutamine อย่างไร Hoechst-33258 และกรดไพรูวิกถูกคุณภาพวิเคราะห์และชีววิทยาโมเลกุลทั้งหมดเกรดวัสดุโรงงานและสุ่มตัวอย่างผลไม้เติบโตของพืชหนึ่งปีสุขภาพ และ symptomlessของ C. annum (ครอบครัว: Solanaceae) ได้รวบรวมจากจัมมู (32430 N 5800, 74 480 3200 E), อินเดีย ตัวอย่างผลไม้ที่นำไปปฏิบัติใน icebox เก็บไว้ในบรร sterilized ที่ 4 C และการประมวลผลภายใน 24 ชมของคอลเลกชันการแยกและการบำรุงรักษาเชื้อรา endophyticการกำจัดจุลินทรีย์ epiphytic ตัวอย่างผลไม้คannum ก่อนล้าง ด้วยน้ำประปา และการแยกการประมวลผลของเชื้อรา endophytic ตัวอย่างถูกล้างเลยด้วยน้ำกลั่น autoclaved และเติมผิว sterilized โดยต่อเนื่องรักษา ด้วย 70% เอทานอลใน 1 นาที 1% ผงฟอกขาว(NaOCl) ใน 90 s หลังจากตัวอย่างแต่ละรักษาถูก rinsed ด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ ตัวอย่างน้ำถูกวางใน sterilizedกระดาษกรองเพื่อกำจัดความชื้นเพิ่มเติม ผิว sterilizedตัวอย่างที่ตัดเป็น 3 ชิ้น 3 มม.ใช้ sterilized ผ่าตัดใบมีดและวางบน petridishes ที่ประกอบด้วยสามสื่อต่าง ๆมันฝรั่งขึ้น agar (คอนกรีตจากมันฝรั่ง 200 g L 1 ขึ้น20.0 g L 1, agar 15.0 g L 1) (สารสกัดจากยีสต์ ยีสต์ข้าวมอลต์ agar ค่า pH 5.6 ± 0.24.0 g L 1 มอลต์สกัด 10.0 g L 1 กลูโคส 4.0 g L 1) 5.5 ± 0.2และน้ำปานกลาง agar (2% Agar w/v) ใน petridishes (90 มม.ในเส้นผ่าศูนย์กลาง) เพื่อหลีกเลี่ยงการเติบโตของแบคทีเรียแต่ละสื่อที่เสริมกับซัลเฟต streptomycin lg/ml 200 ได้ petridishesincubated 3-15 วันจนกว่า mycelium ที่ปรากฏจากที่ 28 Cตัวอย่าง inoculated การเจริญเติบโต hyphal มารับจากตัวอย่างinoculated บนน้ำ agar โอนย้ายไปยังสื่อ agar ขึ้นมันฝรั่งและ incubated ที่ C 28 รับวัฒนธรรมบริสุทธิ์ ในระยะยาวอนุรักษ์บริสุทธิ์ endophytic เชื้อราเพราะถูกเก็บไว้ที่ซี 4 (lyophilized) และ 80 C ใน 10% (v/v) กลีเซอร จัดทำเอกสารมีเลขทะเบียน MRCJ-10 ในสถาบันที่จุลินทรีย์ที่เก็บสกัดดีเอ็นเอ ขยาย PCR และลำดับของ ITS1 เชื้อรา-5.8SITS2ภูมิภาคดีเอ็นเอ genomic ถูกสกัดโดย ZR Fungal/แบคทีเรียชุดดีเอ็นเอ MiniPrep ™ตามโพรโทคอของผู้ผลิต ที่มีการตรวจสอบคุณภาพและปริมาณของ genomic DNA โดย NanoDrop2000. ขยาย PCR ของ ITS1-5.8S ทำ rDNA ITS2 ภูมิภาคใช้ไพรเมอร์สากล ITS5: 50-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -30 และ ITS4: 50-TCCTCCGCTTATTGATATGC-30 (ขาว et al.,1990) การทำ PCR ขยายปริมาณปฏิกิริยาจะเป็น 50กับ 25 จะของ PCR หลักผสม Promega Corp. เมดิสัน WI), 2.50 จะ10 lM แต่ละพื้น 3 ll ของ genomic DNA เชื้อรา (100 ng) และ17 จะอณูชีววิทยาระดับน้ำ โปรแกรมขี่จักรยานความร้อนมีดังนี้: denaturation เริ่มต้น 95 C สำหรับ 5 นาที รอบ 35 ของ30 s ที่ 95 C, 45 s ที่ 56 C และ 60 s ที่ 72 C และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้าย10 นาทีที่ 72 C. ผลิตภัณฑ์ PCR มีความสะอาด ด้วย UltraClean ™ชุดฟอกล้าง DNA PCR ตามของผู้ผลิตโพรโทคอลการเชื้อรา endophytic phylogenetic วิเคราะห์ภูมิภาคของเอาต์ถูกเรียงลำดับในทั้งสองทิศทางโดยABI 377 DNA sequencer v3.1 เทอร์มิเนเตอร์ขนาดใหญ่ย้อมโดยใช้วงจรชุดลำดับ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เมื่อต้องการระบุเชื้อรา endophytic ลำดับที่ได้ถูกใช้เป็นแบบสอบถามลำดับสำหรับค้นหาความคล้ายคลึงกันโดยใช้อัลกอริทึมระเบิดกับฐานข้อมูลที่เก็บรักษาที่ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)และพันธุ์ FC-46 มีอนุกรมวิธานที่กำหนดเป็น Alternaria alternataITS1-5.8S ลำดับ rDNA ITS2 ของ FC-46 แยกได้สอดคล้องกับลำดับการอ้างอิงมากที่สุดคล้ายของ taxa ตามใช้โปรแกรม CLUSTAL W ต้นไม้ phylogenetic ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ MEGA5 (Tamura et al., 2011), ในเวลาต่อมาวิเคราะห์สำหรับระยะทางวิวัฒนาการโดยเพื่อนบ้านรวมวิธี มีประเมินเสถียรภาพของ clades โดย bootstrapวิเคราะห์ ด้วยระยะ 1000 ลำดับ rDNA ที่อยู่ติดกันของแยกพนักงานส่งไป GenBankฐานข้อมูลที่ใช้โปรแกรมเลื่อมสีทะเบียนไม่ KC989106เพาะปลูก การหมัก และการเตรียมสารสกัดจากการ inoculum A. alternata ถูกเตรียมใน Erlenmeyer นำ(500 ml) กับมันฝรั่งขึ้นซุป (PDB) สื่อ (150 มล.) incubated5 วันในการสั่น (150 รอบต่อนาที) ที่หมัก 28 C. ชุดที่ดำเนินการใน Erlenmeyer นำ (1L) บน PDB ค่า pH 5.5 หนาวละประกอบด้วยซุป 300 มล.ถูก inoculated กับร้อยละ 10 ของ inoculumเตรียม และ incubated ที่ 28 C ในความมืดด้วยการสั่นที่รอบต่อนาที 200 7 วัน หลังจากเสร็จสิ้นการหมักชุดซุปได้เก็บเกี่ยวผลผลิต และการประมวลผลเพิ่มเติม สำหรับการเตรียมสารสกัดจากตาม สถาบันมะเร็งแห่งชาติของโพรโทคอ (McCloud2010) เช่น ซุป homogenized เป็นกลุ่มทั้งหมดถูกถ่ายโอนไปแยกกรวย มีปริมาตรการเท่ากันของ DCM ต่อไปนี้สั่น และถอนการแยกของชั้น เฟส DCM การเกษตรอินทรีย์ตัวทำละลายออก โดยการระเหยโรตารี่ เป็นสารสกัดอินทรีย์จากนั้น ภายใต้คอลัมน์ chromatography บนซิลิก้าเจลกับเอทิลacetate: เฮกเซน (10:90) เป็น eluentsAlternariol-10-methyl อีเทอร์ (3) ไม่มีสีทึบ IR (นีท) tmax3400.86, 1658.39 ซม. 1 HRESIMS (m/z) 273.0756 [M + H] + (ปีสำหรับ [C15H12O5] + 273.0685)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สรุป
โดยสรุปเรารายงานแยกเชื้อราเอนโดไฟท์ที่มีความสามารถ
ในการผลิต capsaicin ไม่เกินสามรุ่นซึ่งอาจพบ
การประยุกต์ใช้เป็นแหล่งทางเลือกสำหรับการผลิตขนาดใหญ่ของ.
ยกระดับสัญญาณของน้ำหมักผลในการแยก
สารที่ 2 และ 3 ที่ 3 ถูกค้นพบใหม่วรรณกรรม.
ยวดเรานำเสนอวิธีการใช้อย่างรวดเร็วและที่สำคัญ
(MRM) LC-ESI-MS / MS สำหรับวิธีการแยกและการหาปริมาณ
ของสาร capsaicin และ 3. มัลติพัฒนา
ขั้นตอนการสามารถนำไปใช้เป็นวิเคราะห์ เครื่องมือสำหรับการวิเคราะห์
1 และ 3 ในการปรากฏตัวขององค์ประกอบที่เป็นไปได้อื่น ๆ สารประกอบ
3 แสดงฤทธิ์ต้านการเจริญอย่างมีนัยสำคัญที่แตกต่างกันกับ
เซลล์มะเร็งของมนุษย์และพบว่าทำให้เกิดการตายของเซลล์หลักฐาน
โดยการย้อมสี Hoechst และการสูญเสียของเมมเบรนยล
ที่มีศักยภาพ การศึกษาต่อไปอยู่ระหว่างการเพิ่มประสิทธิภาพเงื่อนไข
สำหรับการผลิตขนาดใหญ่ของ capsaicin และแยกสารอื่น ๆ
จากเชื้อราชนิดนี้ การศึกษาเพิ่มเติมในวันที่ 3 มีจุดมุ่งหมายเพื่อการดำเนิน
การปรับเปลี่ยนโครงสร้างออกมาเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของกิจกรรมและแจ่มชัด
รายละเอียดเพิ่มเติมของโหมดโมเลกุลของการดำเนินการ.
การทดลอง
ขั้นตอนการทดลองทั่วไป
1H และ 13C NMR สเปกตรัมใน DMSO-d6 ถูกบันทึกไว้บน 400 MHz
กับสเปกโทรมิเตอร์ TMS เป็นภายใน มาตรฐาน การเปลี่ยนแปลงทางเคมี
จะแสดงในส่วนต่อล้านส่วน (ppm d); ค่า J จะได้รับใน
เฮิร์ตซ์ รีเอเจนต์และตัวทำละลายที่ใช้ส่วนใหญ่เป็นเกรด AR ซิลิก้า
เจลแผ่นอลูมิเนียมเคลือบถูกนำมาใช้สำหรับ TLC HRMS ถูกบันทึกไว้
ใน UHD LC / MS Q-TOF RPMI-1640, 3 (4,5-dimethylthiazole-
2 YL) โบรไมด์ -2,5-diphenyltetrazolium (MTT), โรดามีน
123 penicillin-G, เซรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ (FCS), ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ
(พีบีเอส), ซิตริก กรด streptomycin, L-glutamine, Hoechst-33258 และ
กรด pyruvic ทุกคนที่มีคุณภาพสูงในการวิเคราะห์และชีววิทยาโมเลกุล
เกรด.
วัสดุอาคารและการสุ่มตัวอย่าง
ผลไม้ของผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดีและ symptomless หนึ่งปีที่โรงงานเก่า
ของซีปี (ครอบครัว: Solanaceae) ถูกเก็บรวบรวมจากชัมมู (32?
430 5800 N, 74? 480 3200 E), อินเดีย ตัวอย่างผลไม้ที่ถูกนำไปยังห้องปฏิบัติการ
ใน icebox เก็บไว้ใน Polybags ฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสและประมวลผล
ภายใน 24 ชั่วโมงของการเก็บ.
การแยกและการบำรุงรักษาของเชื้อราเอนโดไฟท์
เพื่อขจัดจุลินทรีย์อิงอาศัยตัวอย่างผลของซี
ปีถูกล้างครั้งแรกด้วยการแตะ น้ำและการประมวลผลสำหรับการแยก
เชื้อราเอนโดไฟท์ กลุ่มตัวอย่างถูกล้างสามครั้งด้วย
น้ำกลั่นอิฐและพื้นผิวที่ผ่านการฆ่าเชื้อต่อไปโดยติดต่อกัน
การรักษาด้วยเอทานอล 70% เป็นเวลา 1 นาที, โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 1%
(NaOCl) เป็นเวลา 90 วินาทีหลังจากการรักษาตัวอย่างแต่ละคนถูกล้างด้วย
น้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ ตัวอย่างเปียกถูกวางไว้บนฆ่าเชื้อ
กระดาษกรองเพื่อกำจัดความชื้น พื้นผิวฆ่าเชื้อ
ตัวอย่างถูกตัดออกเป็น 3? 3 มมชิ้นผ่านการฆ่าเชื้อโดยใช้การผ่าตัด
ใบมีดและวางไว้บน petridishes มีสามสื่อที่แตกต่างกัน
วุ้นเดกซ์โทรสมันฝรั่ง (Infusion จากมันฝรั่ง 200 กรัม L 1, เดกซ์โทรส
20.0 กรัม L 1, วุ้น 15.0 กรัม L? 1) ค่า pH 5.6 ± 0.2, ยีสต์ข้าวมอลต์ วุ้น (สารสกัดจากยีสต์
4.0 กรัม L 1, มอลต์สกัด 10.0 กรัม L 1 น้ำตาล 4.0 กรัม L? 1) 5.5 ± 0.2
และขนาดกลางน้ำวุ้น (2% วุ้น w / v) ใน petridishes (90 มิลลิเมตร
เส้นผ่าศูนย์กลาง) เพื่อหลีกเลี่ยงการเจริญเติบโตของแบคทีเรียแต่ละสื่อก็ตบท้าย
ด้วยแอลจี 200 / ml ซัลเฟต streptomycin petridishes ถูก
บ่มที่ 28 องศาเซลเซียสสำหรับ 3-15 วันจนเส้นใยปรากฏจาก
ตัวอย่างเชื้อ การเจริญเติบโต hyphal ได้รับเลือกจากตัวอย่าง
เชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อน้ำโอนไปยังสื่อวุ้นเดกซ์โทรสมันฝรั่ง
และบ่มที่ 28 องศาเซลเซียสเพื่อให้ได้เชื้อบริสุทธิ์ สำหรับระยะยาว
การเก็บรักษาเชื้อราเอนโดไฟท์บริสุทธิ์แยกถูกเก็บไว้ที่
4 องศาเซลเซียส (แห้ง) และ? 80? C ใน 10% (v / v) กลีเซอรอเอกสาร
ที่มีจำนวนการเข้า MRCJ-10 ในสถาบันจุลินทรีย์
ที่เก็บ.
สกัดดีเอ็นเอ PCR การขยายและการเรียงลำดับของ ITS1-5.8SITS2 เชื้อรา
ภูมิภาค
ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้ ZR เชื้อรา / แบคทีเรีย
ชุดดีเอ็นเอ miniprep ™ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต
คุณภาพและปริมาณของดีเอ็นเอได้รับการตรวจสอบโดย NanoDrop
2000 ขยาย PCR ของภูมิภาค ITS1-5.8S rDNA-ITS2 ได้ดำเนินการ
โดยใช้ไพรเมอร์สากล ITS5: 50 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-
30 และ ITS4: 50 TCCTCCGCTTATTGATATGC-30. (สีขาว, et al,
1990) ขยาย PCR ได้ดำเนินการในปริมาณปฏิกิริยา 50 LL
LL 25 ของ PCR โทผสม Promega คอร์ป, Madison, WI) 2.50 LL
10 LM แต่ละไพรเมอร์ 3 LL ดีเอ็นเอจีโนมของเชื้อรา (100 นาโนกรัม) และ
17 ชั้น LL อณูชีววิทยา น้ำ โปรแกรมความร้อน
มีดังนี้ denaturation เริ่มต้น 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที? 35 รอบของ
30 วินาทีที่ 95 C, 45 s ที่ 56 องศาเซลเซียสและ 60 วินาทีที่ 72? C? และขยายสุดท้าย
10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการทำความสะอาดด้วย ultraclean ™
PCR ทำความสะอาดชุดฟอกดีเอ็นเอตามที่ผู้ผลิตของ
โพรโทคอ.
การวิเคราะห์วิวัฒนาการของเชื้อราเอนโดไฟท์
ขยายของภูมิภาคก็ติดใจในทั้งสองทิศทางโดย
ABI 377 ซีเควนดีเอ็นเอโดยใช้บิ๊กเทอร์มิย้อม v3.1 วงจร
ชุดลำดับ การเรียนการสอนต่อไปของผู้ผลิต เพื่อระบุ
เชื้อราเอนโดไฟท์ลำดับที่ได้ถูกนำมาใช้เป็นแบบสอบถาม
ลำดับสำหรับการค้นหาความคล้ายคลึงกันโดยใช้อัลกอริทึมระเบิดกับ
ฐานข้อมูลเก็บรักษาไว้ที่ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
และสายพันธุ์ FC-46 เป็นอนุกรมวิธาน กำหนดให้เป็น Alternaria alternata.
ลำดับ ITS1-5.8S rDNA-ITS2 ของ FC-46 แยกก็
สอดคล้องกับลำดับการอ้างอิงคล้ายกันมากที่สุดของแท็กซ่าโดย
ใช้โปรแกรม Clustal W phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้น
โดยใช้ซอฟแวร์ MEGA5 (ทามูระ et al., 2011) ต่อมา
วิเคราะห์สำหรับระยะทางวิวัฒนาการเพื่อนบ้าน
วิธีการเข้าร่วม ความทนทานของ clades เป็นที่คาดกันโดยบูต
วิเคราะห์ 1000 ซ้ำ ที่อยู่ติดกัน rDNA ลำดับ
ของการแยกตัวแทนถูกส่งไปยัง GenBank
ฐานข้อมูลโดยใช้โปรแกรม SEQUIN กับคู่สัญญาไม่มี KC989106.
การเพาะปลูกการหมักและการเตรียมสารสกัดจาก
หัวเชื้อของ A. alternata ถูกจัดทำขึ้นใน Erlenmeyer ขวด
(500 มล.) ที่มีน้ำซุปมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDB) สื่อ (150 มล.) บ่ม
เป็นเวลา 5 วันในการเขย่า (150 รอบต่อนาที) วันที่ 28 องศาเซลเซียส . หมักรุ่นที่
ได้รับการดำเนินการใน Erlenmeyer ขวด (1 ลิตร) ใน PDB ค่า pH 5.5 แต่ละขวด
ที่มีน้ำซุป 300 มลได้รับเชื้อด้วยร้อยละ 10 ของเชื้อ
จัดทำและบ่มที่ 28 องศาเซลเซียสในที่มืดด้วยการเขย่าที่
200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 7 วัน หลังจากเสร็จสิ้นการหมัก
น้ำซุปเก็บเกี่ยวและดำเนินการต่อไปสำหรับการเตรียมสารสกัด
ดังต่อไปนี้สถาบันมะเร็งแห่งชาติของโปรโตคอล (McCloud,
2010) กล่าวคือน้ำซุปทั้งปั่นถูกย้ายไปแยก
ช่องทางที่มีปริมาณที่เท่ากันของดีซีเอ็ม ต่อไปนี้การสั่นและ
การแยกชั้นเฟส DCM ถูกถอนอินทรีย์
ตัวทำละลายออกไปโดยการระเหยแบบหมุน สารสกัดอินทรีย์ถูก
ยัดเยียดแล้วคอลัมน์บนซิลิกาเจลที่มีเอทิล
อะซิเตต. เฮกเซน (10:90) เป็นตัวชะ
อีเทอร์ Alternariol-10-methyl (3) ไม่มีสีที่เป็นของแข็ง, IR (เรียบร้อย) TMAX
3,400.86, 1,658.39 ซม. 1 HRESIMS (m / z) 273.0756 [M + H] + (calcd
สำหรับ [C15H12O5] + 273.0685)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สรุป
สรุปรายงานการแยกเชื้อราเอนโดไฟท์ที่เราสามารถผลิตแคปไซซินไม่เกินสามรุ่น

โปรแกรม ซึ่งอาจพบเป็นแหล่งทางเลือกสำหรับการผลิตขนาดใหญ่ .
upscaling ของน้ำหมักมีผลในการแยกสารประกอบ
2 และ 3 ที่ 3 พบใหม่
โดยเฉพาะวรรณกรรม เราได้เสนอวิธีการที่รวดเร็วและไว
( mrm ) วิธี lc-esi-ms / MS เพื่อแยกประเภทและปริมาณของแคดเมียมและสารประกอบ
3 การพัฒนามัลติ
ขั้นตอนได้อย่างง่ายดายสามารถใช้เป็นเครื่องมือวิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์
1 และ 3 ในการแสดงตนขององค์ประกอบที่เป็นไปได้อื่น ๆ สารแสดงความต่อต้าน proliferative
3 กิจกรรมต่อต้านเซลล์มะเร็งแตกต่าง
มนุษย์และพบว่าทำให้เกิด apoptosis )
โดย Hoechst staining และการสูญเสียของการเยื่อ
ที่มีศักยภาพ มีการศึกษาเพิ่มเติมระหว่างปรับเงื่อนไข
สำหรับการผลิตขนาดใหญ่ของแคปไซซิน และแยกอื่น ๆสาร
จากเชื้อรานี้ ศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับ 3 มุ่งแบก
ออกการดัดแปลงโครงสร้างเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของกิจกรรม และอธิบายรายละเอียดของโหมด


ทดลองโมเลกุลของการกระทําทั่วไป ขั้นตอนการทดลอง และ 13C NMR สเปกตรัม
1 ใน dmso-d6 ที่ถูกบันทึกไว้บน 400 MHz
ากับ TMS เป็นมาตรฐานภายใน
กะเคมีจะถูกแสดงในส่วน ต่อล้านส่วน ( ppm ) D ) J ค่าจะได้รับใน
เฮิรตซ์ สารเคมีและสารละลายที่ใช้เป็น AR เกรด ซิลิกาเจลเคลือบอลูมิเนียมแผ่น
นำมา TLC . hrms บันทึก
บน uhd LC / MS q-tof . rpmi-1640 , 3 - 45-dimethylthiazole -
2-yl ) - 2,5-diphenyltetrazolium โบรไมด์ ( MTT ) จาก
123 , penicillin-g ซีรัมลูกโค ( fetal FCS ) , ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (
( PBS ) , กรดซิตริก , streptomycin , L Glutamine , hoechst-33258 และ
กรดไพรูวิกทั้งหมดที่มีคุณภาพสูงและชีววิทยาเชิงโมเลกุลวัสดุเกรด
.

ผลแก่พืชและการสุ่มตัวอย่าง ของสุขภาพและ symptomless หนึ่งปีพืช
C . ปี ( ครอบครัว :โซลานาซี ) ได้รวบรวมจากแนว ( 32 
430 5800 N , 74  3200 E 480 ) , อินเดีย ตัวอย่างผลไม้ถูกปฏิบัติการ
ในตู้เย็น เก็บไว้ในที่  ฆ่าเชื้อ polybags และประมวลผล
4 C ภายใน 24 ชั่วโมงของคอลเลกชัน การแยกและรักษาเชื้อราเอนโดไฟท์

เพื่อกำจัดจุลินทรีย์ epiphytic , ผลไม้ตัวอย่าง C .
ปีแรกล้างด้วยน้ำประปาและประมวลผลสำหรับการแยก