A variant produced by inserting a ล

A variant produced by inserting a ลำดับนิวคลีโอไทด์ having a การลอกรหัส-repressing activity into the region involved in the การลอกรหัส of the LMR-DYRK gene of a green alga may also be used.

30
(3) Method of Suppressing การแปลรหัส of LMR-DYRK Gene and
Reducing การแปลรหัส Efficiency of Gene



An example of the method of suppressing the การแปลรหัส of the LMR-DYRK gene is a method using an แอนติเซนส์ RNA (for example, the RNAi method). That is, a gene from which แอนติเซนส์ RNA complementary to the mRNA of the LMR-DYRK gene is transcribed is incorporated into a
5 green algal genome, and the แอนติเซนส์ RNA is overexpressed. The การแปลรหัส of the mRNA of the LMR-DYRK gene is suppressed.
[0040]
Specifically, the variant of the green alga with a reduced LM.R-DYRK
activity according to the การเปิดเผยนี้ can be produced in accordance
1 O with the following procedures. That is, a mutagenic substance is acted on a parental green algal สายพันธุ์, and then a variant with increased ไลปิด content is chosen by screening. It is confirmed that a mutation has been introduced in the LMR-DYRK gene of the obtained variant. In this manner, the variant of the green alga can be produced.
15 [0041]
Alternatively, the variant of the green alga with a reduced LMR-DYRK activity according to the การเปิดเผยนี้ can be produced more efficiently through the following two-stage gene manipulation.
(i) Determination of Partial ลำดับนิวคลีโอไทด์ of LMR-DYRK Gene
20 A partial ลำดับนิวคลีโอไทด์ of the LMR-DYRK gene of a target green alga whose ผลิตภาพไลปิด is to be improved is determined by the following procedures. Proteins belongingto the DYRK ซับแฟมิลี่, ที่รวมถึง the LMR-DYRK encoded by the gene having the ลำดับนิวคลีโอไทด์ of
SEQ ID NO:1 derived from P. ellipsoidea สายพันธุ์ Obi, share a highly conserved
25 amino acid sequence. Thus, a DNA fragment is amplified by PCR การเพิ่มปริมาณ using PCR primers designed based on the conserved amino acid sequence and is cloned in Escherichia coli. Then, the ลำดับนิวคลีโอไทด์ of the DNA fragment is determined. Examples of the primers used for the PCR การเพิ่มปริมาณ are shown in รูป 2. The forward primer
30 (SEQ ID NO: 5) in รูป 2 is designed based on the conserved amino acid . sequence (iHCDLKPEN). On the other hand, the reverse primers {SEQ ID NOs: 6 and 7) are designed based on an amino acid sequence (IDMWSLGC). It is expected that one of the two reverse primers achieves the PCR



การเพิ่มปริมาณ. The ลำดับนิวคลีโอไทด์ is determined according to the

IUPAC standard.
[0042]
Incidentally, the sequence of SEQ ID NO: 5 is, from the 5' end,
5 ATCCACTGCG ACCTNAARCC NGARAA. The sequence of SEQ ID NO: 6 is, from the 5' end, CAGCCCARRCTCCACATRTC DAT. The sequence of SEQ ID NO: 7 is, from the 5' end, CAGCCCARNGACCACATRTC DAT.
[0043]
In some cases, an organism has multiple DYRK genes. Direct
1 O sequencing of the PCR-amplified DNA fragments should be avoided. When the partial DYRK gene sequence thus obtained is extended, the inverse PCR method (Huang SH. (1994) Inverse polymerase chain reaction. An efficient approach to cloning cDNA ends. Mal Biotechnol. 12:15-22.) or ที่คล้ายกัน may
be used. Recently, next-generation sequencing methods have made
15 progress, and determination of whole genome sequences has become very easy. Thus, the whole genome sequence of the target green alga may be determined first, and a sequence which is the closest to the P. ellipsoidea สายพันธุ์ Obi-derived LMR-DYRK gene sequence of SEQ ID NO: 1 may be selected from the genome sequence as a candidate LMR-DYRK gene.
20 (ii) Knockout of Candidate LMR-DYRK Gene
When the ลำดับนิวคลีโอไทด์ of a candidate LMR-DYRK gene has been determined, a variant having a defect in the gene can be produced using the gene knockout method called ZFN, TALEN or CRISPR/Cas (Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based
25 methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 :397-405.).
(iii) Knockdown of Candidate LMR-DYRK Gene
Alternatively, the expression of the LMR-DYRK can be repressed using the RNAi method (Cerutti H, Ma X, Msanne J, Repas T. (2011)
RNA-mediated silencing in Algae: biological roles and tools for analysis of
30 gene function. Eukaryot Cell. 10:1164-1172.). [0044]
The ผลิตภาพไลปิด of the variant of the green alga thus obtained is measured by the method or ที่คล้ายกัน described in Example 1. When the



improvement of the ผลิตภาพไลปิด is confirmed, the production of the variant of the green alga with a reduced LMR-DYRK activity according to the present disclosure is completed.
[0045]
5 In the variant of the green alga according to the การเปิดเผยนี้, the การผลิตไลปิด per unit time and per unit culture area is significantly (for example, 1.1 times or more, ทททคือ 1.3 times or more) higher than in the parental สายพันธุ์ or the สายพันธุ์ไวด์ไทป์.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยังอาจใช้ตัวแปรที่ผลิต โดยการใส่ลำดับนิวคลีโอไทด์มีกิจกรรมที่การลอกรหัส repressing สู่ภูมิภาคในการลอกรหัสของยีน LMR DYRK ของ alga เขียว30(3) วิธีการของการแปลรหัส LMR DYRK ยีน และลดการแปลรหัสประสิทธิภาพของยีน ตัวอย่างของวิธีการของการแปลรหัสยีน LMR-DYRK เป็นวิธีการใช้ RNA เป็นแอนติเซนส์ (เช่น วิธี RNAi) คือ ยีน RNA การ mRNA ของยีน LMR DYRK เป็นทับศัพท์จากแอนติเซนส์ที่รวมไว้ในการ5 พันธุสาหร่ายสีเขียว และแอนติเซนส์ RNA เป็น overexpressed การแปลรหัสของ mRNA ของยีน LMR DYRK จะถูกระงับ[0040]โดยเฉพาะ ตัวแปรของ alga เขียวกับ LM ลดลง R DYRKกิจกรรมตามการเปิดเผยนี้สามารถผลิตได้ตาม1 O ตามขั้นตอนต่อไปนี้ คือ สาร mutagenic จะดำเนินการสายพันธุ์สาหร่ายสีเขียวปกครอง และจากนั้น เลือกตัวแปรไลปิดเพิ่มเนื้อหา โดยตรวจ มียืนยันว่า มีการแนะนำการกลายพันธุ์ในยีน LMR DYRK ของตัวแปรที่ได้รับ ในลักษณะนี้ ตัวแปรของ alga เขียวสามารถผลิต15 [0041]อีกวิธีหนึ่งคือ ตัวแปรของ alga สีเขียวกับกิจกรรม LMR DYRK ลดตามการเปิดเผยนี้สามารถผลิตได้อย่างมีประสิทธิภาพผ่านการควบคุมยีนสองต่อไปนี้(ก) การกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน LMR-DYRK20 ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน LMR DYRK ของ alga เขียวเป้าหมายการผลิตภาพไลปิดจะต้องปรับปรุงเป็นไปตามขั้นตอนต่อไป โปรตีน belongingto DYRK ซับแฟมิลี่ ที่รวมถึง LMR-DYRK รหัส โดยยีนที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์ของSEQ ID ไม่: 1 มาจาก P. ellipsoidea สายพันธุ์โอบิ ร่วมกันนำสูงลำดับกรดอะมิโนที่ 25 ดังนั้น ขยายส่วน DNA PCR การเพิ่มปริมาณใช้ PCR ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาตามลำดับของกรดอะมิโนที่นำ และโคลนใน Escherichia coli แล้ว ลำดับนิวคลีโอไทด์ของส่วน DNA จะถูกกำหนด ตัวอย่างของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR การเพิ่มปริมาณจะแสดงในรูป 2 รองพื้นไปข้างหน้า30 (เลขลำดับ ID: 5) ในรูป 2 แบบจากกรดอะมิโนเมืองเก่า ลำดับ (iHCDLKPEN) บนมืออื่น ๆ ไพรเมอร์กลับ { SEQ ID หมายเลข: 6 และ 7) มีการออกแบบการลำดับกรดอะมิโน (IDMWSLGC) คาดว่า ไพรเมอร์ย้อนกลับที่สองอย่างใดอย่างหนึ่งให้การ PCR การเพิ่มปริมาณ ลำดับนิวคลีโอไทด์ถูกกำหนดตามการมาตรฐานยิ่ง ๆ[0042]บังเอิญ ลำดับของ SEQ ID ไม่: 5 คือ 5' ปลาย5 ATCCACTGCG ACCTNAARCC NGARAA ลำดับของเลขลำดับ ID: 6 คือ 5' ปลาย ซิงค์ข้อมูลและสาย CAGCCCARRCTCCACATRTC ลำดับของเลขลำดับ ID: 7 เป็น 5' ปลาย ซิงค์ข้อมูลและสาย CAGCCCARNGACCACATRTC[0043]ในบางกรณี ชีวิตมีหลายยีน DYRK โดยตรง1 O ลำดับของชิ้นส่วนดีเอ็นเอขยาย PCR ควรหลีกเลี่ยง เมื่อยีนลำดับบางส่วนของ DYRK จึงได้มีขยาย วิธี PCR ผกผัน (ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสผกผันและ Huang (1994) วิธีการมีประสิทธิภาพกับโคลน cDNA จบ Biotechnol ผิดพลาด 12:15-22.) หรือที่คล้ายกันสามารถใช้ เมื่อเร็ว ๆ นี้ วิธีจัดลำดับรุ่นต่อไปได้ความคืบหน้า 15 และการกำหนดลำดับพันธุทั้งกลายง่ายมาก ดังนั้น ลำดับพันธุทั้ง alga เขียวเป้าหมายอาจกำหนดแรก และลำดับซึ่งใกล้กับ P. ellipsoidea สายพันธุ์มาโอบิ LMR-DYRK ลำดับยีนของ SEQ ID ไม่: 1 สามารถเลือกจากลำดับพันธุเป็นยีนสมัคร LMR-DYRK20 (ii) น่าพิศวงยีน LMR DYRK ผู้สมัครเมื่อมีการกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนสมัคร LMR DYRK ตัวแปรที่มีข้อบกพร่องในยีนสามารถผลิตโดยใช้วิธีการน่าพิศวงยีนที่เรียกว่า ZFN ท่าเลน หรือ CRISPR/Cas (CF Gaj T, Gersbach CA, Barbas 3. ZFN (2013) ท่าเลน CRISPR/Cas ตาม และวิธี 25 สำหรับพันธุวิศวกรรม แนวโน้ม Biotechnol 31:397-405.)(iii) ถอดยีน LMR DYRK ผู้สมัครอีกวิธีหนึ่งคือ การแสดงของ LMR-DYRK สามารถจะอัดอั้นใช้วิธี RNAi (Cerutti H, Ma X, Msanne J, T. Repas (2011)มี RNA สมรในสาหร่าย: บทบาททางชีวภาพและเครื่องมือสำหรับวิเคราะห์ฟังก์ชันยีน 30 เซลล์ Eukaryot 10:1164-1172.) . [0044]ผลิตภาพไลปิดของตัวแปรของ alga เขียวที่ได้รับจึง ถูกวัด โดยวิธีการหรือที่คล้ายกันที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 1 เมื่อการ ของผลิตภาพไลปิดการยืนยัน การแปรของ alga สีเขียวกับกิจกรรม LMR DYRK ลดลงตามการเปิดเผยที่อยู่เสร็จเรียบร้อยแล้ว[0045]5 แปร alga เขียวตามการเปิดเผยนี้ การผลิตไลปิด ต่อหน่วยเวลา และ ต่อพื้นที่วัฒนธรรมเป็นอย่างมาก (ตัวอย่างเช่น 1.1 เท่าหรือมากกว่า ทททคืออย่างน้อย 1.3 เท่า) สูงกว่าในสายพันธุ์โดยผู้ปกครองหรือสายพันธุ์ไวด์ไทป์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวแปรที่ผลิตโดยการใส่ลำดับนิวคลีโอไทด์มีการลอกรหัส - กิจกรรมในภูมิภาคได้มีส่วนร่วมในการลอกรหัสของ lmr-dyrk ยีนของสาหร่ายสีเขียว นอกจากนี้ยังอาจจะใช้30( 3 ) วิธีการการแปลรหัสของยีน lmr-dyrk และลดประสิทธิภาพการแปลรหัสของยีนตัวอย่างของวิธีการเพื่อการแปลรหัสของ lmr-dyrk ยีน เป็นวิธีที่ใช้แอนติเซนส์ RNA ( ตัวอย่างเช่น หาวิธี ) คือ ยีนที่แอนติเซนส์อาร์เอ็นเอ ประกอบกับ mRNA ของยีนและ lmr-dyrk รวมเป็น5 สีเขียวสาหร่าย จีโนม และแอนติเซนส์ RNA เป็นกับ . การการแปลรหัสของ mRNA ของยีน lmr-dyrk ปราบปราม[ 0040 ]โดยเฉพาะ แตกต่างจากสาหร่ายสีเขียว ลด lm.r-dyrkกิจกรรมตามการเปิดเผยนี้สามารถผลิตตาม1 โอ โดยมีขั้นตอนดังนี้ นั่นคือ สารอาหารจะทำบนของสาหร่ายสีเขียวสายพันธุ์แล้วตัวแปรที่เพิ่มขึ้นไลปิดเนื้อหาที่ถูกเลือกโดยคัดกรอง มันได้รับการยืนยันว่า การกลายพันธุ์ที่ได้รับการแนะนำใน lmr-dyrk ยีนของการวิเคราะห์ตัวแปร ในลักษณะนี้ แตกต่างจากสาหร่ายสีเขียวที่สามารถผลิต15 [ 0041 ]หรือตัวแปรของสาหร่ายสีเขียว ลด lmr-dyrk กิจกรรมไปตามการเปิดเผยนี้สามารถผลิตได้อย่างมีประสิทธิภาพผ่านการจัดการยีนสองขั้นตอนต่อไปนี้( I ) การกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน lmr-dyrk20 ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของ lmr-dyrk ยีนเป้าหมายสีเขียวสาหร่ายที่มีผลิตภาพไลปิดจะปรับปรุงจะถูกกำหนดโดยมีขั้นตอนดังนี้ โปรตีนที่ dyrk ซับแฟมิลี่ belongingto , lmr-dyrk ที่รวมถึงที่เข้ารหัสโดยมีลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนseq id : 1 ได้มาจากหน้า ellipsoidea สายพันธุ์โอบิ ร่วมกันอนุรักษ์สูง25 ลำดับกรดอะมิโน . ดังนั้น , ดีเอ็นเอจะถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยการเพิ่มปริมาณตามศึกษาลำดับกรดอะมิโนและโคลนใน Escherichia coli แล้ว ลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ถูกกำหนด ตัวอย่างของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการตรวจการเพิ่มปริมาณแสดงในรูป 2 รองพื้นไปข้างหน้า30 ( seq id : 5 ) ในรูป 2 ถูกออกแบบบนพื้นฐานการอนุรักษ์กรดอะมิโน ลำดับ ( ihcdlkpen ) บนมืออื่น ๆ , reverse primers { seq id หมายเลข 6 และ 7 ) ออกแบบตามลำดับกรดอะมิโน ( idmwslgc ) คาดว่าอีกสองกลับใช้ PCR ไพรเมอร์การเพิ่มปริมาณ . การลำดับนิวคลีโอไทด์มุ่งมั่นไปตามสากลมาตรฐาน[ 0042 ]อนึ่ง ลำดับหมายเลข seq 5 คือ จากปลาย 5 "5 atccactgcg acctnaarcc ngaraa . ลำดับของ seq id : 6 จาก 5 " จบ cagcccarrctccacatrtc ดิ ลำดับหมายเลข seq 7 คือจาก 5 " จบ cagcccarngaccacatrtc ดิ[ 0043 ]ในบางกรณี สิ่งมีชีวิตที่มียีน dyrk หลาย โดยตรง1 . ลำดับของชิ้นส่วนของ DNA PCR ควรหลีกเลี่ยง เมื่อบางส่วนของ dyrk ลำดับจึงได้ขยาย วิธี PCR ผกผัน ( Huang . ( 1994 ) วิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส . วิธีที่มีประสิทธิภาพเพื่อการโคลนนิ่ง cDNA สิ้นสุดลง มัล biotechnol . 12:15-22 ) หรือที่คล้ายกันอาจจะใช้ เมื่อเร็ว ๆนี้วิธีการจัดลำดับรุ่นต่อไปได้15 ความคืบหน้าและการกำหนดลำดับจีโนมทั้งหมดได้กลายเป็นเรื่องง่ายมาก ดังนั้น ทั้งจีโนมลำดับเป้าหมายสีเขียวสาหร่ายอาจได้รับการพิจารณาก่อน และลําดับที่ใกล้เคียงกับหน้า ellipsoidea สายพันธุ์ Obi ที่มา lmr-dyrk ยีน ลำดับหมายเลข seq 1 อาจเลือกจากจีโนมลำดับเป็นผู้สมัคร lmr-dyrk ยีน20 ( 2 ) ของผู้สมัคร โดย lmr-dyrk ยีนเมื่อลำดับนิวคลีโอไทด์ของผู้สมัคร lmr-dyrk ยีนได้กำหนดตัวแปรมีความบกพร่องของยีน สามารถผลิตได้โดยใช้วิธีการที่เรียกว่า ยีน โดย zfn ทะเล้น , หรือ crispr / CAS ( กัช T , gersbach CA , CF barbas 3 ( 2013 ) zfn สู่ท่าเลนและ crispr / CAS , ตาม25 วิธีการวิศวกรรมพันธุกรรม . แนวโน้ม biotechnol . 31 : 397-405 . )( iii ) การน็อคของผู้สมัคร lmr-dyrk ยีนอีกวิธีหนึ่งคือ การแสดงออกของ lmr-dyrk สามารถระงับการใช้ RNAi วิธี ( Cerutti H , Ma x , msanne J , repas ( 2011 ) .RNA เพื่อปิดปากในสาหร่าย : บทบาททางชีวภาพและเครื่องมือสำหรับการวิเคราะห์ของ30 ยีนฟังก์ชัน eukaryot เซลล์ 10:1164-1172 . ) [ 0044 ]การผลิตภาพไลปิดของ