HRP transport. Translocation experi

HRP transport. Translocation experiments were performed using DIBs
that contained 10 mol% of negatively-charged phosphatidylglycerol
(PG) and 90% PC lipids in one or both leaflets. Unlike Pep-1, D9-NBD
based translocation of HRP showed no significant dependence on
charge distribution in the DIBs (Fig. 4). The addition of a voltage bias
did not increase translocation across an asymmetric DIB (Fig. 4). The
lack of dependence of D9-NBD facilitated HRP transport on either voltage
or membrane asymmetry suggests that D9 and perhaps other
guanidinium-rich carriers may function by a different mechanism
than Pep-1.
To explore these differences further, we examined the relationship
between complex formation and carrier-mediated transport using D9-
NBD and Pep-1. In these experiments, the cargo and carrier were placed
either in the same droplet or in opposite droplets. For Pep-1, HRP transport
was not observed in either case. However, D9-NBD showed a remarkable
increase in HRP transport when placed on the opposite side
of the DIB from HRP (Fig. 5). Further, DLS measurements indicate that
D9-NBD does not adsorb to HRP when they are incubated together
(Table S2). Two important ideas emerge from these results. First, interactions
between D9 and HRP, such as an incubation period, are not a
prerequisite for translocation. This contrasts with Pep-1 where several
literature reports emphasize the importance of both incubation and
the peptide to cargo molar ratio. Second, transport is enhanced when
the cargo and carrier are separated. Guanidinium-rich peptides have already
been shown to “reach across” vesicle membranes to extract bulky
anions [9]. D9-NBD is also capable of extracting bulky anions, in this case
carboxyfluorescein, from vesicles in a concentration-dependent manner
(Fig. 5, inset). Our data suggests that this idea might be extended to
larger entities such as entire proteins. Following several of the DIB experiments
presented here, we imaged the capture droplet by fluorescence
microscopy to measure how much D9-NBD crossed over after
translocation.
However, very little D9-NBD was detected in the capture droplets
(except where D9-NBD and HRP were in separate droplets) (Fig. S8).
This does not necessarily indicate that D9 cannot cross the DIB, but at
least it does not rapidly equilibrate across the membrane. Models like
carpet, toroidal pore and barrel stave are insufficient to explain the
transport of molecular cargo observed in our experiments with Pep-1
and D9 as carriers [16,35–36]. We note that both Pep-1 [31] and D9
form pores in DIB membranes in the absence and presence of cargo
(Fig. S7). This suggests that the requirement for complex formation
(as with Pep-1) [5] may not be related to the formation of pores in the
membrane. If so, perhaps translocation does not take place by passing
through carrier-lined pores but instead by some other means. For example,
the hydrophobic regions of either D9 or Pep-1 could interact with
the hydrophobic core of the membrane while the positive regions neutralize
negatively-charged patches on the cargo. The lysine-rich Pep-1

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

HRP ขนส่ง ดำเนินการสับเปลี่ยนทดลองใช้หมากเก็บที่อยู่ 10 โมล%ของ phosphatidylglycerol คิดในเชิงลบ(PG) และโครงการ PC 90% ในหนึ่ง หรือทั้งสองแผ่นพับ ต่างจาก Pep-1, D9-NBDใช้การสับเปลี่ยนของ HRP เห็นพึ่งพาไม่สำคัญในค่ากระจายในหมากเก็บ (Fig. 4) การเพิ่มความแรงความโน้มเอียงไม่ได้เพิ่มการสับเปลี่ยนระหว่าง DIB เป็น asymmetric (Fig. 4) ที่ขาดการพึ่งพาของ D9 NBD HRP การขนส่งบนแรงดันใดที่อำนวยความสะดวกหรือแนะนำเมมเบรน asymmetry ที่ D9 และทีอื่น ๆอุดมไปด้วย guanidinium สายการบินอาจทำงาน โดยกลไกที่แตกต่างกันกว่า Pep-1การสำรวจความแตกต่างเหล่านี้ ต่อไป เราตรวจสอบความสัมพันธ์ก่อตัวที่ซับซ้อนและ mediated ผู้ขนส่งใช้ D9-NBD และ Pep-1 ในการทดลองเหล่านี้ ขนส่งสินค้าและผู้ขนส่งได้ทำหรือหยดเดียว หรือหยดตรงข้าม Pep-1 ขนส่ง HRPไม่ถูกตรวจสอบในกรณีใด อย่างไรก็ตาม D9-NBD แสดงความโดดเด่นเพิ่มขนส่ง HRP เมื่อวางอยู่บนด้านตรงข้ามของ DIB จาก HRP (Fig. 5) เพิ่มเติม DLS ประเมินบ่งชี้ว่าD9-NBD ไม่ชื้นการ HRP เมื่อพวกเขาจะ incubated กัน(S2 ตาราง) สองความคิดที่สำคัญเกิดขึ้นจากผลเหล่านี้ โต้ตอบครั้งแรกระหว่าง D9 HRP เช่นระยะการฟักตัว ไม่มีข้อกำหนดเบื้องต้นสำหรับการสับเปลี่ยน ซึ่งความแตกต่างกับ Pep ที่หลายเอกสารประกอบการรายงานเน้นความสำคัญของทั้งสองคณะทันตแพทยศาสตร์ และเพปไทด์สบต่อสินค้า สอง เพิ่มการขนส่งเมื่อแยกการขนส่งสินค้าและผู้ขนส่ง Guanidinium อุดมไปด้วยเปปไทด์ได้แล้วรับการแสดงเพื่อ "เข้าถึง" เยื่อหุ้มเวสิเคิลขยายขนาดใหญ่anions [9] D9-NBD จะยังสามารถแยก anions ขนาดใหญ่ ในกรณีนี้carboxyfluorescein จากอสุจิในลักษณะขึ้นอยู่กับความเข้มข้น(Fig. 5 แทรก) ข้อมูลแนะนำว่า ความคิดนี้อาจขยายให้เอนทิตีที่มีขนาดใหญ่เช่นโปรตีนทั้งหมด ต่อหลาย DIB ทดลองนำเสนอ เรา imaged หยดจับ โดย fluorescencemicroscopy การวัดจำนวน D9-NBD ข้ามหลังการสับเปลี่ยนอย่างไรก็ตาม มี NBD D9 เล็กพบในหยดจับ(ยกเว้นที่มี D9 NBD และ HRP ในหยดแยกต่างหาก) (ฟิก S8)นี้ไม่ได้หมายความว่า D9 ไม่ข้าม DIB แต่ในอย่างน้อยมันไม่รวดเร็ว equilibrate ผ่านเมมเบรน รูปแบบเช่นพรม รูขุมขน toroidal และ stave บาร์เรลอยู่ไม่เพียงพอจะอธิบายการขนส่งขนส่งโมเลกุลที่พบในการทดลองของเรากับ Pepและ D9 เป็นสายการบิน [16,35-36] เราสังเกตว่า Pep-1 [31] และ D9รูขุมขนแบบฟอร์มเข้า DIB ขาดงานและสถานะของสินค้า(ฟิก S7) นี้แนะนำที่ความต้องการสำหรับผู้แต่งที่ซับซ้อน(เช่นเดียวกับ Pep-1) [5] อาจไม่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของรูขุมขนในเมมเบรน ถ้าเป็นเช่นนั้น ทีการสับเปลี่ยนไม่เกิดขึ้น โดยผ่านผ่านเส้นขนส่ง pores แต่แทน ด้วยวิธีอื่น ตัวอย่างภูมิภาค hydrophobic D9 หรือ Pep-1 สามารถโต้ตอบกับหลัก hydrophobic ของเมมเบรนในขณะที่ภูมิภาคบวกแก้ซอฟต์แวร์ที่คิดค่าส่งในสินค้า อุดมไปด้วยไลซีน Pep-1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

HRP ขนส่ง การทดลองโยกย้ายถูกดำเนินการโดยใช้หมากเก็บที่มี 10 mol% ของ phosphatidylglycerol ประจุลบ (PG) และ 90% ไขมันในเครื่องคอมพิวเตอร์ในหนึ่งหรือทั้งแผ่นพับ ซึ่งแตกต่างจากความห้าวหาญ-1-D9 NBD โยกย้ายตาม HRP พบว่าไม่มีการพึ่งพาอาศัยกันอย่างมีนัยสำคัญในการกระจายค่าใช้จ่ายในหมากเก็บ(รูปที่. 4) นอกเหนือจากอคติแรงดันไฟฟ้าที่ไม่ได้เพิ่มขึ้นโยกย้ายข้าม DIB ไม่สมมาตร (รูปที่. 4) ขาดการพึ่งพาอาศัยกันของ D9-NBD การอำนวยความสะดวกการขนส่ง HRP แรงดันอย่างใดอย่างหนึ่งหรือไม่สมดุลเยื่อแสดงให้เห็นว่าD9 และอื่น ๆ ที่อาจจะเป็นผู้ให้บริการGuanidinium ที่อุดมไปด้วยอาจจะทำงานโดยมีกลไกที่แตกต่างกันกว่าห้าวหาญ-1. เพื่อสำรวจความแตกต่างเหล่านี้ต่อไปเราตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างความซับซ้อนการก่อตัวและการขนส่งผู้ให้บริการสื่อกลางที่ใช้ D9- NBD และห้าวหาญ-1 ในการทดลองเหล่านี้การขนส่งสินค้าและผู้ให้บริการถูกวางไว้ทั้งในหยดเดียวหรือในหยดตรงข้าม สำหรับห้าวหาญ-1, การขนส่ง HRP ไม่ได้สังเกตว่าในกรณีใด อย่างไรก็ตาม D9-NBD แสดงให้เห็นความโดดเด่นเพิ่มขึ้นในการขนส่งHRP เมื่อวางไว้บนฝั่งตรงข้ามของDIB จาก HRP (รูปที่. 5) นอกจากนี้วัด DLS ระบุว่าD9-NBD ไม่ดูดซับเพื่อ HRP เมื่อพวกเขาได้รับการบ่มด้วยกัน(ตารางที่ S2) สองความคิดที่สำคัญเกิดจากผลลัพธ์เหล่านี้ ครั้งแรกที่มีปฏิสัมพันธ์ระหว่างและ D9 HRP เช่นระยะฟักตัวที่ไม่ได้เป็นสิ่งที่จำเป็นสำหรับการโยกย้าย ความขัดแย้งนี้ด้วยความห้าวหาญ-1 ที่หลายรายงานวรรณกรรมเน้นความสำคัญของการบ่มทั้งสองและเปปไทด์ต่อฟันกรามสินค้า ประการที่สองการขนส่งจะเพิ่มขึ้นเมื่อการขนส่งสินค้าและผู้ให้บริการจะถูกแยกออก เปปไทด์ Guanidinium ที่อุดมไปด้วยมีอยู่แล้วแสดงให้เห็นว่า"ถึงข้าม" เยื่อถุงขนาดใหญ่ที่จะดึงแอนไอออน[9] D9-NBD ยังมีความสามารถในการสกัดแอนไอออนขนาดใหญ่ในกรณีนี้carboxyfluorescein จากถุงในลักษณะที่มีความเข้มข้นขึ้นอยู่กับ(รูปที่ 5. สอด) ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าความคิดนี้อาจจะมีการขยายไปยังหน่วยงานที่มีขนาดใหญ่เช่นโปรตีนทั้งหมด ต่อไปนี้หลายการทดลอง DIB นำเสนอที่นี่เราถ่ายภาพหยดจับโดยแสงกล้องจุลทรรศน์ในการวัดเท่าใด D9-NBD ข้ามหลังจากโยกย้าย. แต่น้อยมาก D9-NBD ถูกตรวจพบในหยดจับ(ยกเว้นที่ D9-NBD และ HRP อยู่ในหยดน้ำที่แยกต่างหาก) (รูป. S8). นี้ไม่จำเป็นต้องแสดงให้เห็นว่า D9 ไม่สามารถข้าม DIB แต่อย่างน้อยก็ไม่ได้อย่างรวดเร็วสมดุลทั่วเมมเบรน รูปแบบเช่นพรมและรูขุมขนวงแหวนขั้นบันไดบาร์เรลจะไม่เพียงพอที่จะอธิบายการขนส่งของสินค้าโมเลกุลสังเกตในการทดลองของเราที่มีความห้าวหาญ-1 และเป็นผู้ให้บริการ D9 [16,35-36] เราทราบว่าทั้งห้าวหาญ-1 [31] และ D9 รูขุมขนรูปแบบในเยื่อหุ้ม DIB ในกรณีที่ไม่มีและการปรากฏตัวของสินค้า(รูป. S7) นี้แสดงให้เห็นว่าความต้องการสำหรับการสร้างที่ซับซ้อน(เช่นเดียวกับความห้าวหาญ-1) [5] อาจจะไม่ได้เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของรูขุมขนในเมมเบรน ถ้าเป็นเช่นนั้นอาจจะโยกย้ายไม่ได้เกิดขึ้นโดยผ่านผ่านรูขุมขนให้บริการเรียงราย แต่ด้วยวิธีการอื่น ๆ ยกตัวอย่างเช่นในภูมิภาคที่ไม่ชอบน้ำอย่างใดอย่างหนึ่งหรือ D9 ห้าวหาญ-1 สามารถโต้ตอบกับแกนน้ำเมมเบรนในขณะที่ภูมิภาคบวกแก้แพทช์ประจุลบในการขนส่งสินค้า ไลซีนที่อุดมไปด้วยความห้าวหาญ-1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ชขนส่ง โยกย้ายทดลองใช้หมาก
ที่มี 10 โมลเปอร์เซ็นต์ประจุลบ phosphatidylglycerol
( PG ) และ 90% PC ไขมันในหนึ่งหรือทั้งสอง ใบปลิว ซึ่งแตกต่างจาก pep-1 d9-nbd
, ตามการเคลื่อนย้ายของ HRP อย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติพึ่งพา
ประจุที่กระจายในการตกปลา ( รูปที่ 4 ) นอกจากนี้ของความต่างศักย์
ไม่ได้เพิ่มการเคลื่อนย้ายข้าม ดิบ ( รูปที่ไม่สมมาตร4 )
ขาดการพึ่งพาของ d9-nbd ความสะดวกในการขนส่งทั้งแรงดันช
หรือเยื่อความไม่สมดุลเห็นว่า D9 และอาจอื่น ๆ
guanidinium รวยผู้ให้บริการอาจทำงานด้วยกลไกที่แตกต่างกันกว่า pep-1
.
สำรวจความแตกต่างเหล่านี้เพิ่มเติม เราได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างรูปแบบและระดับที่ซับซ้อน
-
ผู้ให้บริการขนส่งใช้ D9 และไม่สำคัญ pep-1 . ในการทดลองเหล่านี้การขนส่งสินค้าและผู้ให้บริการอยู่
ทั้งในแสงเดียวกันหรือในหยดตรงข้าม สำหรับ pep-1 ช , การขนส่ง
ไม่ได้สังเกตในทั้งสองกรณี . อย่างไรก็ตาม d9-nbd แสดงโดดเด่น
เพิ่ม HRP การขนส่งเมื่อวางอยู่บนด้านตรงข้าม
ของดิบจาก HRP ( ภาพที่ 5 ) เพิ่มเติม dls วัดระบุว่า
d9-nbd ไม่ได้ดูดซับเพื่อ HRP เมื่อพวกเขาถูกบ่มด้วยกัน
( ตาราง S1 )สองความคิดที่สำคัญออกมาจากผลลัพธ์เหล่านี้ แรก และปฏิสัมพันธ์ระหว่าง D9
ช เช่นมีระยะเวลาการบ่มจะไม่ได้
เบื้องต้นสำหรับการโยกย้าย . นี้แตกต่างกับ pep-1 ที่รายงานวรรณกรรมหลาย
เน้นความสำคัญของทั้งสองและบ่มเพาะ
เปปไทด์สินค้าอัตราส่วน . ที่สอง , การขนส่งเพิ่มขึ้นเมื่อ
การขนส่งสินค้าและผู้ให้บริการจะถูกแยกออกจากกันดูแล้วรวย guanidinium
ถูกแสดง " ข้าม " ว่า เยื่อแยกเทิง
แอน [ 9 ] d9-nbd ยังสามารถแยกเทิงแอน ในกรณีนี้ carboxyfluorescein
ตั้งแต่เล็กในความเข้มข้นขึ้นอยู่กับลักษณะ
( ภาพที่ 5 ใส่ ) ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่า ความคิดนี้อาจจะขยายไปยัง
องค์กรขนาดใหญ่ เช่น โปรตีนทั้งหมดต่อไปนี้การทดลองหลายของออ
นำเสนอที่นี่ เรายึดตัวอื่นๆด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
ที่จะวัดเท่าใด d9-nbd ข้ามหลัง
โยกย้าย .
แต่น้อยมาก d9-nbd ที่ตรวจพบในการจับหยด
( ยกเว้นที่ d9-nbd HRP อยู่แยกและหยด ) ( รูปที่ s8
นี้ไม่จำเป็นต้อง ) แสดงว่า D9 ไม่ข้าม ดิบ แต่ที่
อย่างน้อย มันก็ไม่สมดุลกันอย่างรวดเร็วผ่านเยื่อแผ่น นางแบบชอบ
พรม , รูขุมขนและถัง Toroidal stave ไม่เพียงพอที่จะอธิบาย
การขนส่งโมเลกุลของสินค้าที่พบในการทดลองของเรา และ pep-1
D9 เป็นผู้ 16,35 ) [ 36 ] เราทราบว่าทั้งสอง pep-1 [ 31 ] และ D9
รูขุมขนในรูปแบบดิบ membranes ในการขาดงานและสถานะของสินค้า
( รูป S7 )นี้แสดงให้เห็นว่าความต้องการ
เชิงซ้อน ( เช่นกับ pep-1 ) [ 5 ] อาจจะเกี่ยวข้องกับการก่อตัวของรูใน
เมมเบรน ถ้าบางทีการโยกย้ายไม่ได้เกิดขึ้นโดยผ่านทางรูขุมขนแทนแต่ผู้ให้บริการ
เรียงรายด้วยวิธีอื่น ๆ ตัวอย่างเช่น
ภูมิภาค ) ของ D9 หรือ pep-1 สามารถโต้ตอบกับ