Cloning of any DNA fragment essenti

Cloning of any DNA fragment essentially involves four steps[4]

fragmentation - breaking apart a strand of DNA
ligation - gluing together pieces of DNA in a desired sequence
transfection - inserting the newly formed pieces of DNA into cells
screening/selection - selecting out the cells that were successfully transfected with the new DNA
Although these steps are invariable among cloning procedures a number of alternative routes can be selected; these are summarized as a cloning strategy.

Initially, the DNA of interest needs to be isolated to provide a DNA segment of suitable size. Subsequently, a ligation procedure is used where the amplified fragment is inserted into a vector (piece of DNA). The vector (which is frequently circular) is linearised using restriction enzymes, and incubated with the fragment of interest under appropriate conditions with an enzyme called DNA ligase. Following ligation the vector with the insert of interest is transfected into cells. A number of alternative techniques are available, such as chemical sensitivation of cells, electroporation, optical injection and biolistics. Finally, the transfected cells are cultured. As the aforementioned procedures are of particularly low efficiency, there is a need to identify the cells that have been successfully transfected with the vector construct containing the desired insertion sequence in the required orientation. Modern cloning vectors include selectable antibiotic resistance markers, which allow only cells in which the vector has been transfected, to grow. Additionally, the cloning vectors may contain colour selection markers, which provide blue/white screening (alpha-factor complementation) on X-gal medium. Nevertheless, these selection steps do not absolutely guarantee that the DNA insert is present in the cells obtained. Further investigation of the resulting colonies must be required to confirm that cloning was successful. This may be accomplished by means of PCR, restriction fragment analysis and/or DNA sequencing.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โคลนของส่วนดีเอ็นเอใด ๆ หลักเกี่ยวข้องกับขั้นตอนที่สี่ [4]กระจายตัว - แบ่งแยกสาระของดีเอ็นเอไข่ - ติดกาวเข้าด้วยกันชิ้นส่วนของดีเอ็นเอในลำดับที่ระบุการ transfection - การแทรกชิ้นส่วนรูปแบบใหม่ของดีเอ็นเอในเซลล์คัดกรอง/เลือก - เลือกออกที่ transfected ได้สำเร็จ ด้วยดีเอ็นเอใหม่ถึงแม้ว่าขั้นตอนเหล่านี้จะปรากฏในขั้นตอนการโคลน สามารถเลือกจำนวนเส้นทางอื่น เหล่านี้จะสรุปเป็นกลยุทธ์การ cloningเริ่ม ดีเอ็นเอที่น่าสนใจจำเป็นต้องแยกให้ส่วนดีเอ็นเอขนาดเหมาะสม ในเวลาต่อมา ตอนไข่ไว้ที่ส่วนเอาต์จะถูกแทรกลงในเวกเตอร์ (ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ) เวกเตอร์ (ซึ่งเป็นวงกลมบ่อย) คือ ใช้เอนไซม์จำกัด linearised และ incubated มีส่วนน่าสนใจภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมกับเอนไซม์เรียกว่า DNA ligase ไข่เวกเตอร์ ด้วยการแทรกต่อไปนี้น่าสนใจเป็น transfected ลงในเซลล์ จำนวนเทคนิคอื่นมี เช่น sensitivation เคมีของเซลล์ electroporation ฉีดออปติคอล และ biolistics สุดท้าย เซลล์ transfected เป็นอ่าง เป็นขั้นตอนดังกล่าวจะมีประสิทธิภาพต่ำสุดโดยเฉพาะอย่างยิ่ง มีความจำเป็นเพื่อระบุเซลล์ที่เรียบร้อยแล้ว transfected ได้ ด้วยสร้างเวกเตอร์ที่ประกอบด้วยลำดับต้องแทรกในแนวที่ต้อง การ เวกเตอร์การโคลนที่ทันสมัยรวมถึงความต้านทานยาปฏิชีวนะที่เลือกเครื่องหมาย ซึ่งช่วยให้เซลล์เท่าที่เวกเตอร์มีการ transfected การเติบโต นอกจากนี้ เวกเตอร์ cloning อาจประกอบด้วยสีเลือกเครื่องหมาย ให้คัดกรองสีฟ้า/ขาว (อัลฟ่าปัจจัย complementation) บนสื่อกลางกัล X อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนเลือกจริง ๆ รับประกันว่า แทรกดีเอ็นเอในเซลล์ที่ได้รับการ สอบสวนเพิ่มเติมของอาณานิคมได้ต้องจำเป็นต้องยืนยันว่า โคลนได้สำเร็จ นี้อาจทำได้โดยวิธี PCR ข้อจำกัดส่วนวิเคราะห์และ/หรือลำดับดีเอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โคลนชิ้นดีเอ็นเอใด ๆ เป็นหลักเกี่ยวข้องกับสี่ขั้นตอน [4] การกระจายตัว - แตกสาระของดีเอ็นเอligation - ติดกาวด้วยกันชิ้นส่วนของดีเอ็นเอในลำดับที่ต้องการtransfection - การใส่ชิ้นที่จัดตั้งขึ้นใหม่ของดีเอ็นเอในเซลล์การตรวจคัดกรอง / เลือก - เลือกออกจากเซลล์ ที่ถูก transfected ประสบความสำเร็จกับดีเอ็นเอใหม่แม้ว่าขั้นตอนเหล่านี้เป็นขั้นตอนการคงที่ในหมู่โคลนจำนวนของเส้นทางทางเลือกที่สามารถเลือกได้; เหล่านี้จะสรุปเป็นกลยุทธ์การโคลน. ในขั้นต้นดีเอ็นเอที่สนใจจะต้องมีการแยกส่วนที่จะให้ดีเอ็นเอที่มีขนาดที่เหมาะสม ต่อจากนั้นเป็นขั้นตอนที่ถูกนำมาใช้ ligation ส่วนขยายที่ถูกแทรกลงในเวกเตอร์ (ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ) เวกเตอร์ (ซึ่งเป็นวงกลมบ่อย) เป็นเชิงเส้นโดยใช้เอนไซม์ข้อ จำกัด และบ่มกับส่วนของดอกเบี้ยตามเงื่อนไขที่เหมาะสมกับการทำงานของเอนไซม์ที่เรียกว่าลิกาเซดีเอ็นเอ ต่อไปนี้ ligation เวกเตอร์ที่มีการแทรกที่น่าสนใจคือ transfected เข้าสู่เซลล์ จำนวนของเทคนิคทางเลือกที่มีอยู่เช่นสารเคมี sensitivation ของเซลล์ electroporation ฉีดแสงและ biolistics ในที่สุดเซลล์ transfected มีการเพาะเลี้ยง ในฐานะที่เป็นขั้นตอนดังกล่าวข้างต้นที่มีประสิทธิภาพต่ำโดยเฉพาะอย่างยิ่งมีความจำเป็นที่จะระบุเซลล์ที่ได้รับการ transfected ประสบความสำเร็จกับการสร้างเวกเตอร์ที่มีลำดับที่ต้องการแทรกในทิศทางที่ต้องการ เวกเตอร์โคลนที่ทันสมัยรวมถึงเครื่องหมายต้านทานยาปฏิชีวนะเลือกที่ช่วยให้เซลล์เดียวที่เวกเตอร์ที่ได้รับการ transfected ที่จะเติบโต นอกจากนี้พาหะโคลนอาจมีเครื่องหมายการเลือกสีที่ให้สีฟ้า / สีขาวคัดกรอง (อัลฟา complementation ปัจจัย) ในสื่อ X-แกลลอน อย่างไรก็ตามขั้นตอนการเลือกเหล่านี้ไม่ได้อย่างแน่นอนรับประกันได้ว่าดีเอ็นเอแทรกอยู่ในเซลล์ได้ การตรวจสอบต่อไปของโคโลนีที่เกิดขึ้นจะต้องจะต้องยืนยันว่าโคลนที่ประสบความสำเร็จ ซึ่งอาจทำได้โดยใช้วิธีการ PCR วิเคราะห์ส่วนข้อ จำกัด และ / หรือลำดับดีเอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การโคลนดีเอ็นเอหลักใด ๆที่เกี่ยวข้องกับสี่ขั้นตอน [ 4 ]

fragmentation - แตกเส้นดีเอ็นเอ
Ligation - ติดกาวกันชิ้นส่วนของดีเอ็นเอในลําดับที่ต้องการ
สำหรับ - ใส่ใหม่ขึ้นชิ้นส่วนของดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์
คัดกรอง / เลือก - เลือกออกเซลล์ที่ประสบความสำเร็จ transfected กับ DNA ใหม่
ถึงแม้ว่าขั้นตอนเหล่านี้จะคงที่ระหว่างการขั้นตอนจำนวนของเส้นทางที่สามารถเลือก เหล่านี้จะเป็นการสรุปกลยุทธ์

ตอนแรก ดีเอ็นเอที่สนใจต้องแยกให้เป็นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดเหมาะสม ต่อมาเป็นขั้นตอนการใช้ Ligation amplified fragment ที่ถูกแทรกลงในเวกเตอร์ ( ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ )เวกเตอร์ ( ซึ่งมักเป็นวงกลม ) linearised โดยใช้เอนไซม์และบ่มด้วยชิ้นส่วนที่น่าสนใจภายใต้สภาวะที่เหมาะสมกับเอนไซม์ไลเกส ที่เรียกว่า ดีเอ็นเอ ต่อไปนี้ Ligation เวกเตอร์กับแทรกที่น่าสนใจคือ transfected เข้าไปในเซลล์ จำนวนของเทคนิคทางเลือกที่มีอยู่ เช่น เคมี sensitivation electroporation เซลล์ ,ฉีดแสงและ biolistics . ในที่สุด transfected เซลล์เพาะเลี้ยง . เป็นขั้นตอนดังกล่าวมีประสิทธิภาพต่ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ต้องมีการระบุเซลล์ที่ได้รับเรียบร้อยแล้ว transfected ที่มีเวกเตอร์ที่ต้องการสร้างที่มีการแทรกลำดับในทิศทางที่ต้องการ . เวกเตอร์ที่ทันสมัยรวมถึงเลือกยีนต้านทานยาปฏิชีวนะเครื่องหมายซึ่งอนุญาตให้เฉพาะเซลล์ที่เวกเตอร์ได้ transfected เพื่อเติบโต นอกจากนี้ การโคลนเวกเตอร์อาจประกอบด้วยเครื่องหมายการเลือกสี ฟ้า / ขาว ( ซึ่งให้บริการคัดกรองอัลฟาปัจจัย Complementation ) x-gal ปานกลาง อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนการเลือกเหล่านี้ไม่ได้จริง ๆ รับประกันว่าใส่ดีเอ็นเออยู่ในเซลล์ได้การสอบสวนเพิ่มเติม ทำให้เกิดอาณานิคมจะต้องยืนยันว่า การประสบความสำเร็จ นี้อาจจะประสบความสำเร็จโดยวิธี PCR , การวิเคราะห์ส่วนจำกัดและ / หรือการจัดลำดับดีเอ็นเอ