Shrimp.Shrimp (Penaeus monodon) wer

Shrimp.
Shrimp (Penaeus monodon) were injected with WSSV stock in our laboratory to prepare WSSV-infected shrimp. Hemolymph was collected from Penaeus monodon brood stock (40 shrimp) received from the Thailand brood stock domestication program (BIOTEC, Bangkok, Thailand) and used to prepare a hemocyte membrane fraction. Domesticated white shrimp (Penaeus vannamei, also called Litopenaeus vannamei) that were specific pathogen free (meaning free of specifically listed pathogens, including WSSV) were obtained from SyAqua Thailand and used for neutralization tests.

Expression and purification of recombinant WSSV VP28 protein.
The WSSV VP28 gene was PCR amplified from WSSV genomic DNA by using the forward primer 5′-GGA TCT AAG CTTA (CAT)6 ATA ATG GAT CTT TCT TT-3′ and the reverse primer 5′-CAA TGA GCT CTT ACT CGG TCT CAG TG-3′. The forward primer contained recognition sequences for HindIII with a His6 tag, and the reverse primer had a recognition site for SacI. For the template, DNA was extracted from a WSSV-infected shrimp that had been diagnosed using a commercial WSSV detection kit (IQ2000 WSSV detection kit; Farming Intelligene Co., Ltd., Taiwan). The PCR amplicon was cloned into pET-17b vector (Novagen). The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain BL21, and the insert was confirmed by sequencing. The fusion recombinant protein (i.e., as rVP28) was purified by Ni-nitrilotriacetic acid-ribotriacetic acid affinity chromatography according to the manufacturer's protocol (QIAGEN). The purified rVP28 was stored at −20°C.

Preparation of shrimp hemocyte membrane protein.
Hemolymph from adult specific-pathogen-free shrimp was collected in AC-1 anticoagulant solution (27) at a hemolymph/AC-1 ratio of 1:2. The hemocyte pellet was collected, resuspended, and homogenized in 0.9% NaCl. This lysate was then sedimented by centrifugation, and the supernatant portion was collected and ultracentrifuged at 100,000 × g for 1 h at 4°C. After ultracentrifugation, the pellet was solubilized in NaCl/phosphate buffer (7) with 1% Triton X-100, 1× protease inhibitor mix (Amersham Biosciences). The suspension was ultracentrifuged, and the supernatant was collected and referred to as shrimp hemocyte membrane protein solution. The total protein concentration in SHM protein solution was determined using Bradford's reagent protein assay (Bio-Rad). To determine the membrane protein profile, the SHM fraction was subjected to 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and stained with Coomassie brilliant blue.

Western blot analysis of rVP28.
Purified rVP28 was separated by standard SDS-PAGE (12). For immunoblotting experiments, the purified rVP28 was electrophoresed and transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences). The membrane was immersed in blocking buffer (5% skim milk in 140 mM phosphate-buffered saline [PBS]) before incubation overnight at 4°C with a 1:1,000 dilution of mouse anti-VP28 antiserum (kindly provided by P. Sithikornkul, Srinakarinwirote University, Bangkok, Thailand). The blot was then washed twice and incubated for 2 h with a 1:2,000 dilution of goat anti-mouse immunoglobulin G conjugated with horseradish peroxidase (HRP) (Zymed). Subsequently, the blot was washed extensively and the color was developed with an AEC (red) substrate kit (Zymed).

Determination of WBPs by VOPBA.
To identify hemocyte membrane proteins involved in WSSV binding, a VOPBA was carried out (9, 21). SHM (50 μg) was separated by 12% SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. Prior to the binding assay, the membrane was incubated with 5% skim milk in PBS buffer for 1 h. Following two washes, the membrane was equilibrated for 20 min with binding buffer (10 mM Tris-HCl [pH 6.5], 5 mM CaCl2, 10 mM MgCl2). Subsequently, the membrane was incubated with 0.8 mg of affinity-purified rVP28 (dialyzed against binding buffer at 4°C for 48 h) diluted in binding buffer with 0.02% skim milk and 1% Triton X-100. The membrane was extensively washed and WSSV-rVP28-binding proteins (WBPs) were detected by incubating with diluted mouse anti-VP28 antiserum (1:1,500). After washing, the blot was incubated with rabbit anti-mouse IgG-conjugated HRP (Roche). The hemocyte membrane proteins that interacted with rVP28 were detected by the addition of HRP substrate (0.003% [wt/vol] 3′,3′-diamino-benzenetetrahydrochloride [Sigma]-0.05% [wt/vol] H2O2).

Mass spectrometry analysis.
For internal sequence analysis, the WBPs were excised from the 12% SDS-polyacrylamide gel and separately digested overnight in gel with trypsin at 37°C. Liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry was performed, and the MASCOT program was used to analyze the results as described by Tsai et al. (31).

Expression of recombinant PmRab7.
The nucleotide sequence of shrimp Rab7 cDNA was identified from the information in a Taiwan expressed sequence tag library constructed fro

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กุ้งกุ้ง (กุ้งกุลาดำ) ถูกฉีด ด้วยสต็อกโรคในห้องปฏิบัติการเพื่อเตรียมการติดเชื้อโรคกุ้ง Hemolymph ถูกรวบรวมจากกุ้งกุลาดำหน้าท้องสต็อก (กุ้ง 40) ได้รับจากโปรแกรม domestication หุ้นหน้าท้องประเทศไทย (BIOTEC กรุงเทพ ประเทศไทย) และใช้ในการเตรียมเศษเยื่อ hemocyte เลี้ยงกุ้งขาว (กุ้งกุลากุลา เรียกว่าแวน) เชื้อโรคเฉพาะฟรี (หมายถึงเฉพาะระบุเชื้อโรค รวมทั้งโรคฟรี) ที่ ได้รับจากไทย SyAqua และใช้สำหรับการวางตัวเป็นกลางการแสดงออกและทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant โปรตีน VP28 โรคยีนโรค VP28 ถูก PCR ที่ขยายจากโรคออกดีเอ็นเอ โดยใช้รองพื้นไปข้างหน้า 5 ′-GGA TCT เอเอจี CTTA (CAT) 6 ATA ATG สมาคม CTT TCT TT-3′ และแผ่น 5 ′-CAA TGA รองพื้นกลับ CTT กระทำ CGG TCT CAG TG-3′ การรองพื้นไปข้างหน้าอยู่ลำดับสำหรับ HindIII ด้วยแท็ก His6 และรองพื้นกลับมีไซต์การรู้ SacI สำหรับแม่ ดีเอ็นเอแยกจากกุ้งที่ติดเชื้อโรคที่ได้รับการวินิจฉัยโดยใช้ชุดตรวจสอบโรคพาณิชย์ (ชุดตรวจโรค IQ2000 ไต้หวันทำฟาร์ม Intelligene Co., Ltd. ) PCR amplicon ถูกโคลนในสัตว์เลี้ยง-17b เวกเตอร์ (Novagen) Recombinant plasmid ธีสซูส Escherichia coli สายพันธุ์ BL21 และการแทรกได้รับการยืนยัน โดยลำดับ ฟิวชั่น (เช่น เป็น rVP28) recombinant โปรตีนบริสุทธิ์ โดย chromatography ความสัมพันธ์กรดกรด ribotriacetic Ni nitrilotriacetic ตามของผู้ผลิตโพรโทคอล (QIAGEN) RVP28 บริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ที่ −20 ° cเตรียมกุ้ง hemocyte เมมเบรนโปรตีนHemolymph จากผู้ใหญ่เฉพาะเชื้อโรคฟรีกุ้งถูกรวบรวมใน AC-1 สารกันเลือดแข็ง (27) ในอัตราส่วน 1:2 hemolymph/AC-1 เม็ด hemocyte รวบรวม resuspended และ homogenized ใน 0.9% NaCl Lysate นี้แล้ว sedimented โดยการหมุนเหวี่ยง และส่วนของ supernatant รวบรวม และ ultracentrifuged ที่ 100,000 × g สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจาก ultracentrifugation เม็ดถูก solubilized ใน NaCl/ฟอสเฟต บัฟเฟอร์ (7) กับ 1% Triton X-100 ผสมยับยั้งน้ำย่อย 1 × (Amersham ออก) ช่วงล่างเป็น ultracentrifuged และ supernatant รวบรวมไว้ และเรียกว่ากุ้ง hemocyte เมมเบรนโปรตีนโซลูชัน ความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดโปรตีนใน SHM พิจารณาใช้ทดสอบโปรตีนรีเอเจนต์ของแบรดฟอร์ด (Bio-ล้อ) การตรวจสอบค่าโปรตีนเมมเบรน เศษส่วน SHM การ 12% โซเดียม dodecyl ซัลเฟตตรวจสอบวิเคราะห์เจอิ (SDS-หน้า) และย้อม ด้วยสีฟ้าสดใส Coomassieตะวันตกซับของ rVP28Purified rVP28 was separated by standard SDS-PAGE (12). For immunoblotting experiments, the purified rVP28 was electrophoresed and transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences). The membrane was immersed in blocking buffer (5% skim milk in 140 mM phosphate-buffered saline [PBS]) before incubation overnight at 4°C with a 1:1,000 dilution of mouse anti-VP28 antiserum (kindly provided by P. Sithikornkul, Srinakarinwirote University, Bangkok, Thailand). The blot was then washed twice and incubated for 2 h with a 1:2,000 dilution of goat anti-mouse immunoglobulin G conjugated with horseradish peroxidase (HRP) (Zymed). Subsequently, the blot was washed extensively and the color was developed with an AEC (red) substrate kit (Zymed).Determination of WBPs by VOPBA.To identify hemocyte membrane proteins involved in WSSV binding, a VOPBA was carried out (9, 21). SHM (50 μg) was separated by 12% SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. Prior to the binding assay, the membrane was incubated with 5% skim milk in PBS buffer for 1 h. Following two washes, the membrane was equilibrated for 20 min with binding buffer (10 mM Tris-HCl [pH 6.5], 5 mM CaCl2, 10 mM MgCl2). Subsequently, the membrane was incubated with 0.8 mg of affinity-purified rVP28 (dialyzed against binding buffer at 4°C for 48 h) diluted in binding buffer with 0.02% skim milk and 1% Triton X-100. The membrane was extensively washed and WSSV-rVP28-binding proteins (WBPs) were detected by incubating with diluted mouse anti-VP28 antiserum (1:1,500). After washing, the blot was incubated with rabbit anti-mouse IgG-conjugated HRP (Roche). The hemocyte membrane proteins that interacted with rVP28 were detected by the addition of HRP substrate (0.003% [wt/vol] 3′,3′-diamino-benzenetetrahydrochloride [Sigma]-0.05% [wt/vol] H2O2).
Mass spectrometry analysis.
For internal sequence analysis, the WBPs were excised from the 12% SDS-polyacrylamide gel and separately digested overnight in gel with trypsin at 37°C. Liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry was performed, and the MASCOT program was used to analyze the results as described by Tsai et al. (31).

Expression of recombinant PmRab7.
The nucleotide sequence of shrimp Rab7 cDNA was identified from the information in a Taiwan expressed sequence tag library constructed fro

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กุ้ง.
กุ้ง (Penaeus monodon) ได้รับการฉีดด้วยตัวแดงดวงขาวหุ้นในห้องปฏิบัติการของเราเพื่อเตรียมความพร้อมกุ้งตัวแดงดวงขาวที่ติดเชื้อ เลือดที่ถูกเก็บรวบรวมจากกุ้งกุลาดำลูกหุ้น (40 กุ้ง) ที่ได้รับจากโปรแกรมกกหุ้น domestication ประเทศไทย (ไบโอเทค, Bangkok, Thailand) และใช้ในการเตรียมความพร้อมส่วนเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือด โดดเด่นกุ้งขาว (Penaeus vannamei เรียกว่าแวนนาไม) ที่อยู่ปราศจากเชื้อโรคบางชนิด (หมายถึงฟรีของเชื้อโรคที่ระบุไว้โดยเฉพาะรวมทั้งตัวแดงดวงขาว) ที่ได้รับจาก SyAqua ประเทศไทยและนำมาใช้สำหรับการทดสอบการวางตัวเป็นกลาง. การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant WSSV VP28 โปรตีน. ตัวแดงดวงขาว VP28 ยีน PCR จากการขยายตัวแดงดวงขาวดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์ไปข้างหน้า 5'-GGA TCT AAG CTTA (กสท.) 6 ATA ATG GAT CTT TCT TT-3 'และย้อนกลับไพรเมอร์ 5'-CAA TGA GCT CTT ACT CGG TCT CAG TG -3 ' ไพรเมอร์ไปข้างหน้ามีลำดับการยอมรับสำหรับการ HindIII กับป้าย His6 และไพรเมอร์กลับมีเว็บไซต์ที่ได้รับการยอมรับสำหรับ SACI สำหรับต้นแบบดีเอ็นเอที่สกัดจากกุ้งตัวแดงดวงขาวที่ติดเชื้อที่ได้รับการวินิจฉัยโดยใช้ชุดการตรวจสอบตัวแดงดวงขาวในเชิงพาณิชย์ (ชุดการตรวจสอบ IQ2000 WSSV; เครื่องจักร Intelligene จำกัด ไต้หวัน) PCR amplicon เป็นโคลนเข้าไปในสัตว์เลี้ยง 17B เวกเตอร์ (Novagen) พลาสมิด recombinant ก็กลายเป็นสายพันธุ์ Escherichia coli BL21 และใส่ได้รับการยืนยันโดยลำดับ ฟิวชั่นโปรตีน (เช่นเป็น rVP28) คือการทำให้บริสุทธิ์ด้วยกรด ribotriacetic Ni-nitrilotriacetic โคกรดสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (QIAGEN) rVP28 บริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C. เตรียมโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดกุ้ง. เลือดจากกุ้งผู้ใหญ่เฉพาะปลอดเชื้อมีการรวบรวม AC-1 แก้ปัญหาการแข็งตัวของเลือด (27) ในเลือด / AC-1 อัตราส่วน 1: 2 . เม็ดเซลล์เม็ดเลือดถูกเก็บ resuspended และปั่นใน 0.9% โซเดียมคลอไรด์ lysate นี้ได้รับการตกตะกอนแล้วโดยการหมุนเหวี่ยงและส่วนใสที่ถูกเก็บรวบรวมและ ultracentrifuged 100,000 ×กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 ° C หลังจาก ultracentrifugation เม็ดถูกละลายในโซเดียมคลอไรด์ / ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (7) กับ 1% Triton X-100, 1 ×น้ำย่อยผสมสารยับยั้ง (Amersham ชีววิทยาศาสตร์) ถูกระงับ ultracentrifuged และสารละลายที่ถูกเก็บรวบรวมและเรียกว่าเซลล์เม็ดเลือดกุ้งแก้ปัญหาโปรตีนเมมเบรน ความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดในสารละลายโปรตีน SHM ถูกกำหนดโดยใช้แบรดฟอทดสอบโปรตีนสาร (Bio-Rad) เพื่อตรวจสอบรายละเอียดโปรตีนเมมเบรนที่ส่วน SHM ได้ภายใต้การ 12% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) และย้อมด้วยสี Coomassie สีฟ้าสดใส. วิเคราะห์ดวงตะวันของ rVP28. บริสุทธิ์ rVP28 ถูกคั่นด้วยมาตรฐานระบบ SDS-PAGE ( 12) สำหรับ immunoblotting ทดลองที่ rVP28 บริสุทธิ์ electrophoresed และโอนไปยังเมมเบรน nitrocellulose A (Amersham ชีววิทยาศาสตร์) เมมเบรนที่ถูกแช่อยู่ในการปิดกั้นบัฟเฟอร์ (นมพร่องมันเนย 5% ใน 140 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ [พีบีเอส]) ก่อนที่จะบ่มค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสกับ 1: 1,000 ลดสัดส่วนของเมาส์ป้องกัน VP28 antiserum (ให้ความกรุณาโดยพี Sithikornkul, มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒประสานมิตร, Bangkok, Thailand) blot ถูกล้างแล้วสองครั้งและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับ 1: 2,000 ลดสัดส่วนของแพะต่อต้านเมาส์อิมมูโน G ผันกับมะรุม peroxidase (HRP) (Zymed) ต่อจากนั้นหยดถูกล้างอย่างกว้างขวางและสีได้รับการพัฒนากับประชาคมเศรษฐกิจอาเซียน (สีแดง) ชุดสารตั้งต้น (Zymed). การกำหนด WBPS โดย VOPBA. เพื่อระบุโปรตีนเม็ดเลือดส่วนร่วมในการ WSSV ผูกพันเป็น VOPBA ได้ดำเนินการ (9, 21) . SHM (50 ไมโครกรัม) ถูกแยกจากกันโดย 12% SDS-PAGE และโอนไปยังเมมเบรน nitrocellulose แล้ว ก่อนที่จะมีการทดสอบที่มีผลผูกพัน, เมมเบรนที่ถูกบ่มกับนมพร่องมันเนย 5% ในพีบีเอสบัฟเฟอร์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ต่อไปนี้สองล้างเมมเบรนที่ถูก equilibrated สำหรับ 20 นาทีมีผลผูกพันบัฟเฟอร์ (10 mM Tris-HCl [ค่า pH 6.5] 5 มิลลิ CaCl2 10 มิลลิ MgCl2) ต่อมาเมมเบรนที่ถูกบ่มกับ 0.8 มิลลิกรัม rVP28 ความสัมพันธ์บริสุทธิ์ (dialyzed กับผูกพันบัฟเฟอร์ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง) เจือจางในบัฟเฟอร์ที่มีผลผูกพันกับนมพร่องมันเนย 0.02% และ 1% Triton X-100 เมมเบรนถูกล้างอย่างกว้างขวางและตัวแดงดวงขาว-rVP28 ผูกพันโปรตีน (WBPS) ตรวจพบโดยการบ่มด้วยเมาส์เจือจางป้องกัน VP28 antiserum (1: 1,500) หลังจากล้างรอยเปื้อนที่ถูกบ่มกับกระต่าย HRP ป้องกันเมาส์ IgG-ผัน (Roche) โปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดที่มีความสัมพันธ์กับ rVP28 ตรวจพบโดยการเติมสารตั้งต้น HRP (0.003% [WT / Vol] 3 ', 3'-diamino-benzenetetrahydrochloride [Sigma] -0.05% [WT / Vol] H2O2). the วิเคราะห์มวลสาร . สำหรับการวิเคราะห์ลำดับภายใน WBPS ถูกตัดจาก 12% เจล SDS-polyacrylamide และย่อยค้างคืนในเจลที่มี trypsin ที่ 37 ° C แยกต่างหาก Liquid Chromatography-electrospray ไอออนไนซ์ตีคู่มวลสารได้ดำเนินการและโปรแกรมมิ่งขวัญถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ผลตามที่อธิบาย Tsai, et al (31). การแสดงออกของ PmRab7 recombinant. ลำดับเบสของยีนกุ้ง Rab7 ถูกระบุว่าจากข้อมูลในไต้หวันแสดงไลบรารีแท็กลำดับสร้างเทียวไปเทียวมา